疏水层析

常用商品化疏水层析介质
⒈ Octyl Sepharose 4 Fast Flow
工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大 速度是600cm/h,配基结合量为每ml50μmol正辛烷 基，疏水性中等，适合各种蛋白的分离和纯化。
⒉ Butyl Sepharose 4 Fast Flow
疏水作用层析
Hydrophobic Interaction Chromatography
HIC
内容简介
疏水层析的概念及原理 疏水层析与反相层析 疏水层析过程 疏水层析在蛋白质纯化中的重要性 疏水层析的发展趋势
疏水层析的概念及原理
疏水层析分离的概念早在1948年由Tiselius提出，真 正发展是1970年开发出一系列适合疏水层析的固定相 以后；
四、疏水层析在蛋白质纯化中的 重要性
疏水层析作为对其他根据蛋白质电荷、大小、生物 特异性识别等来进行分离的方法的有效补充，广泛 用于蛋白的纯化。
为样品进行硫酸铵沉淀后理想的下游纯化步骤（硫 酸铵沉淀经常用于起始步骤样品的浓缩和清洁）或 者是在离子交换层析后的下游纯化步骤。这两种情 况样品都含有高浓度的盐，可以不经过或者经过很 少处理，直接上样疏水层析。
疏水层析的原理完全不同于离子交换层析或凝胶过 滤层析等技术，使该技术与后两者经常联合使用来 分离复杂的生物样品；
目前该技术主要应用领域是在蛋白质的纯化方面， 成为血清蛋白、膜结合蛋白、核蛋白、受体、重组 蛋白等，以及一些药物分子，甚至细胞等分离时的 有效手段。
疏水层析原理：
疏水层析亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，是利用 盐—水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水 配基之间的疏水力不同，而使样品组分得以分离的 一种层析方法。从分离纯化生命物质的机制来看， 它也属于吸附层析一类 。
“反相”：主要是与“常相”相反；
“常相层析”：是一种使用亲水固定相和含有己烷 或氯甲烷等有机溶剂作为流动相的技术。
反相层析中，固定相是疏水的，所以使用了水/有机 溶剂作为流动相使用。即固定相比流动相更加疏水。
反相层析：
与基质结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质类 物质具有较大的吸附力；
欲将吸附物解析下来，须用含有机溶剂的流动相(降 低极性)洗脱，方可见效；
各种盐离子和离子对具有破坏周围水分子有序排列 的能力。
流动相中盐的组成对蛋白质在疏水层析介质上的吸 附能力具有最为重大的影响。
选择合适的盐对保证蛋白质的分离以及分离后蛋白 质的活性都很重要。硫酸铵、醋酸铵、氯化钠和磷 酸盐是疏水层析分离常用的几种盐。
与硫酸铵沉淀的区别
除疏水层析需要在蛋白质溶液中加入硫酸铵外，盐 析法沉淀蛋白质也经常用硫酸铵沉淀法。
HIC的样品体积受样品中组分浓度和介质的结合容 量的影响，对于稀释样品无需浓缩可以直接加样
层析条件的优化：
优化目标： 目标分子达所需纯度的基础上，获得尽可能高的回收 率，同时力求缩短分离所需时间、降低分离成本。
HIC中，层析条件包括流动相A，流动相B，洗脱方 式，层析柱的柱长，流速，温度等
流动相A与流动相B
R代表疏水配基，M代表基质。调节两种反应物的比例 可控制介质的配基密度。
偶联至基质的 常见配基类型
（A）丁基， （B）辛基， （C）苯基， （D）新戊基
对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，为 洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的 高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不仅可提供足 够的结合力，且避免了上述缺点。
往流动相中添加去污剂等 ，去污剂本身能与介质 发生强烈吸附，从而将结合在其上的目标组分置换 下来（分离膜蛋白）
洗脱理论：
疏溶剂理论：1976年由Sinanoglu等人提出，认为 由于溶质分子有减少其与水接触的非极性表面的倾 向，而增加了与疏水配基结合的概率。
自由能分离理论：1979年Vanoss等人提出，认为 生物体界面自由能比水低，与配基产生范德华力， 这个引力随溶液盐析能力的改变而改变。
近年来研制超大琼脂糖(superporous) ，在扩散孔 的基础上增加了对流孔，在流速较高的条件下获较好 的分辨率；
壳聚糖具有良好的生物相容性和化学稳定性，近年来 在疏水层析中也得到了应用。
HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，与反相 层析介质相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多为 苯基。
4、柱温
一般柱温升高，生物大分子的构象会发生变化，疏水作用增 加，吸附能力增加，有利于提高层析柱的分离度，所以有时可 以通过提高柱温来增加疏水基团与配基间的相互作用，分离性 质相近的化合物，如对分离一些小分子是非常有效的。但是对 于具有生物活性的物质或酶类，在高温条件下易变性失活，因 此不宜在高温条件下进行分离。一般都在常温或低温下操作。
HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8之间， 苯基的疏水性大致与戊基相当，因与溶质发生π-π相 互作用，它与戊基有不同的选择性，而寡聚乙二醇固 定相的疏水性介于丁基与苯基之间 。
样品的准备：
往样品中添加足够浓度的盐，使样品溶液中的盐浓 度达到与流动相A（平衡液）中基本一致，并调节 样品溶液的pH使其满足吸附条件 ，同时选择适当 浓度及pH的缓冲液。
工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最 大速度是600cm/h,配基结合量为每ml 50μmol 正丁 烷基，疏水性最弱，适合含脂族配体的生物分子。
⒊ PBiblioteka Baiduenyl Sepharose 6 Fast Flow
疏水性强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子 的预处理，配基结合量为每ml40μmol苯基Phenyl， 工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的 最大速度是600cm/h 。
二者相似处：都使得蛋白质疏水微区暴露，增强蛋 白质的疏水性。
二者的区别：加入硫酸铵的量不一样；硫酸铵沉淀 过于剧烈，蛋白质已经盐析沉淀。
Hofmeister序列：
排在最左边的离子，盐析作用最强，洗脱能力最弱； 排在最右边的离子，洗脱能力最强，盐析作用最弱。 Hofmeister序列：指的是离子在水结构中，产生有序或混 沌的能力。
2、离子强度
离子强度的大小直接影响样品组分在固定相的保留值。一般 增加离子强度来增加组分的保留值，降低离子强度来提高组分 的解析附能力。 HIC实验中，改变离子强度进行洗脱的方式，一般宜采用梯度 洗脱法，可提高分离的选择性。
3、溶液的酸碱度
溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境。 一般情况，溶液的pH接近蛋白质的等电点，其疏水性增加， 有利于与固定相配基相互作用；远离其等电点，其疏水性减少， 不利于与固定相配基结合，但有利于蛋白质洗脱。因此通过改 变溶液的pH也可以改变蛋白质的疏水性。
洗脱液的极性降低，常常会引起大分子活性物质变 性；
因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量的肽 类和辅基等物质。
三、疏水层析过程
介质的选择 样品的准备 层析条件的优化 层析介质的再生、清洗和贮存
介质（基质+配基）
基质主要有多糖类如琼脂糖、纤维素和人工合成聚合 物类如聚苯乙烯、聚丙烯酸甲酯类。其中，半刚性的 琼脂糖类凝胶仍是应用最广泛的疏水介质；
流动相B为含盐量较低的缓冲液，缓冲液类型与流动相A一致。
起始流动相中盐浓度对蛋白质结合容量的影响
蛋 白 质 结 合 容 量 （ mg/ ml 凝 胶 床）
洗脱的方式：
采用降低流动相中盐浓度的方式洗脱（最常用）；
通过往流动相中添加有机溶剂 ，如：乙二醇、丙 醇、异丙醇等，降低流动相极性的方式洗脱 （溶 剂中稳定性良好的物质）
熵分离理论：1984年Regnier提出，认为高盐溶液 中，蛋白质疏水区域的邻近分子是有序排列，疏水 部分易于配基结合，减弱了水分子排列的有序度， 表面水分子被排斥开，使体系熵增加。
梯度洗脱和阶段洗脱
UP疏水层析紫外检测仪图
疏水层析的影响因素：
1、盐类和盐组成
盐的摩尔表面张力增大，蛋白质在疏水层析柱内的 吸附能力相应增大。
⒋ Phenyl Sepharose CL-4B
疏水性较Octyl弱，适用于分离和纯化对疏水性尚未 了解的蛋白，配基结合量为每ml40μmol苯基 Phenyl；工作pH范围为3-13，清洗pH范围为214，工作的最大速度是50cm/h 。
介质的选择：
在HIC中，应选机械强度较大的刚性基质；若待分离 物质分子量很大，且样品量较大，则应选大孔基质， 如琼脂糖凝胶；若待分离物质较小，或样品量很小， 但分辨率的要求高，则可选孔径小的基质甚至非孔型 基质。
疏水电荷诱导层析(HCIC)
HCIC是近几年来发展起来的一类不同于HIC的新 技术，由Burton等 1998年提出；
HCIC与蛋白质的作用除了疏水作用，还有电荷间 的相互作用；
HCIC与蛋白质的结合是由疏水作用推动的，与 HIC不同的是，这一过程通常是在不改变离子强度 的条件下实现的；
洗脱时也不像HIC那样通过改变盐的浓度而是由 pH值的改变来实现的。
层析介质的再生、贮存 ：
再生：常规用蒸馏水清洗，如有疏水性很强的物质 如脂类、变性蛋白等牢固结合在介质上，则需合适 的清洗剂进行清洗，NaOH溶液是其中常用的一种 清洗剂，它在清洗层析柱的同时还能使微生物钝化 灭活起到消毒的效果。此外，促溶盐类的水溶液也 是良好的清洗剂。
贮存：一般悬浮在20%的乙醇中，如在水溶液体系 中保存，则需添加一定量的防腐剂，以防止微生物 的生长。
“疏水作用”一词是Kauzmann于1959年首次在“蛋 白质进展”杂志中提出的，随后陆续有学者发表用疏 水层析成功分离蛋白质的文献报道；如钙调蛋白、苯 丙氨酸裂解酶、凝集素等。
1972年，Erel Z.等人将不同链长的α，ω—二胺同系 物键合在琼脂糖上，以不同pH的含盐缓冲液作流动相 成功纯化了糖原磷酸化酶，开始确立了疏水层析在分 离纯化某些疏水蛋白质、肽类等生物大分子的重要作 用。
蛋白质等生物大分子与HIC介质的结合不仅取决于
分子疏水性表面的比例，还与疏水微区的分布有关;
一般来说每个分子被吸附的过程都会有一个以上的 配基参与，换句话说，分子在介质上发生的结合是 多点结合。
疏水层析与反相层析
在用液相层析分离时，能满足疏水特性的有两种不 同模式：疏水层析和反相层析。
是1950年由Howard和Martin建立的。
1）亲硫性疏水层析(thio—philic chromatography) 2）疏水电荷诱导层析 (HCIC)
亲硫性疏水层析
该技术主要在疏水作用的基础上增加了硫元素的 相互作用。利用层析介质与含硫蛋白质和非硫蛋 白质的亲硫性差异，对蛋白质加以分离。具体应 用条件和HIC类似。
通常这类介质通过硫醚键将配基和基质联接，如 Butyl—S-Sepharose 6 Fast Flow，已用于乙肝 病毒表面抗原的分离纯化。
利用被分离组分分子表面的疏水微区、（可逆）变 性后暴露出的疏水残基，或在高盐环境下暴露于分 子表面的疏水残基与固定相的疏水性 配体之间的作 用强弱，依次用从高至低离子强度洗脱液可将疏水 作用由弱到强的组分分离开。
高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子 周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与 介质的疏水配基之间发生结合。
在分离过程中，样品被纯化，并被分别以小体积洗 脱下来，因此浓缩了样品，并且洗脱条件为低盐溶 液，也降低了洗脱样品的电导，以便进行凝胶过滤 层析或者离子交换层析。
在纯化方案中，疏水作用层析可以用于样品的捕获、 中度纯化、精细纯化。
疏水层析在蛋白质纯化中的位置：
五、发展趋势
近年来，随着层析技术的发展，与HIC相关的其它 层析技术也得到了发展，主要有以下两种：
流动相A的缓冲液的种类、pH ，盐的种类和浓度的选 择：
缓冲液种类据所需的pH选择，注意目标物的稳定性，浓度一 般在0.01--0.05mol/L；
不同盐类对疏水作用的强度有影响，层析中的选择性也不尽相 同 0.7；5盐～浓2m度o也l/随L，目N标a分Cl子为的1～疏4水m性ol而/L异；，(NH4)2SO4常用