肺炎克雷伯菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

（Ｙｕｎｎａｎ Ｔｒｏｐｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｕｂｔｒｏｐｉｃａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｖｉｒｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ／Ｙｕｎｎａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０２２４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ａｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｏｎｅ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ １６ＳｒＲＮＡ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．Ａ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔ，ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔ，ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅ ｔｅｓｔ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ２．２９×１０２ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ ｒｅｃｏｍ－ ｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＤ－１６Ｓ，ａｎｄ ｎｏ ｃｒｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｐｉｇ ｂａｃｔｅｒｉａ ｏｃｃｕｒｅｄ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ，Ｋ．ｏｚａｅｎａｅ，Ｋ．ｒｈｉｎｏｓｃｌｅｒｏｍａｔｉｓ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｓｔｒｅｐｔｏ－ ｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ，Ｅｒｙ－ ｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ，Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ，ａｎｄ Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｙｏｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｉｎｄｉ－ ｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒ－ａｎｄ ｉｎｔｒａ－ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｗｅｒｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ３％ ．Ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ－ ｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｒｅｐｅａｔａｂｌｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，ｆａｓｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ．
１．３ 主 要 试 剂 细 菌 基 因 组 ＤＮＡ 提 取 试 剂 盒、ＳｕｐｅｒＲｅａｌ ＰｒｅＭｉｘ（Ｐｒｏｂｅ）Ｋｉｔ和 ＴＩＡＮｐｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ 均购 自 天 根 生 化 科 技 （北 京 ）有 限 公 司。２×Ｅａｓｙ Ｔａｑ ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ 和 Ｔｒａｎｓ ＤＮＡ ＭａｒｋｅｒⅠ 均 购 自北京全式 金 生 物 技 术 有 限 公 司。ｐＭＤ１９－Ｔ 载 体 试剂 盒 购 自 宝 生 物 工 程 （大 连 ）有 限 公 司。 柱 式 ＤＮＡ 胶回收试剂盒 购 自 生 工 生 物 工 程 （上 海）股 份 有限公司。
１．４ 荧光定量 ＰＣＲ 标准品的制备 用细菌基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒提取肺炎克 雷 伯菌 基 因 组 ＤＮＡ 作 为 模 板，以 引 物 ＫＰ－ｑＰＣＲ－Ｐｆ 和 ＫＰ－ｑＰＣＲ－Ｐｒ进 行 ＰＣＲ 扩 增 以 获 得 目 的 片 段。 将目的 片 段 与 ｐＭＤ１９－Ｔ 载 体 连 接 构 建 重 组 质 粒 ｐＭＤ－１６Ｓ。重组质粒经 ＰＣＲ 鉴定正确后，用超微量 紫外分光光度计测 定 其 浓 度 并 换 算 成 拷 贝 数，作 为 荧光定量 ＰＣＲ 的标准品。 １．５ 荧光定量 ＰＣＲ 反应条件的优化及标准曲 线 的 绘制
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ；ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ；１６ＳｒＲＮＡ ｇｅｎｅ；ｅａｒｌｙ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ｑｕａｎｔｉｔａ－ ｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
收 稿 日 期 ：２０１４－０８－１３；修 回 日 期 ：２０１４－１１－２５ 基 金 项 目 ：云 南 省 重 大 科 技 专 项 （２０１２ＺＡ０１７）；云 南 省 现 代 农 业 生 猪 产 业 技 术 体 系 建 设 项 目 （云 财 教 ［２０１３］１６０ 号 ） 作者简介：李富祥（１９７９－），男，云南曲靖人，助理研究员，硕士，主要 从 事 动 物 微 生 物 学 及 免 疫 学 的 研 究 ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｆｘｋｍｋｍ
中 国 兽 医 科 学 ２０１４，４４（１２）：１２３１－１２３５ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ
中 图 分 类 号 ：Ｓ ８５２．６１２ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１６７３－４６９６（２０１４）１２－１２３１－０５
肺炎克雷伯菌 ＴａｑＭａｎ荧光定量 ＰＣＲ 检测方法的建立
李富祥，廖德芳，姚 俊，熊和丽，李华春＊
（云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 ６５０２２４）
摘要：为建立肺炎克雷伯菌 ＴａｑＭａｎ荧光定量 ＰＣＲ 检测方法，根据肺炎克雷伯菌１６ＳｒＲＮＡ 基因的保 守序列设计特异性引物和 ＴａｑＭａｎ 探针，通过反应条件优化和特异性、敏感性、重复性试验以及临床样品的 检测，建立了肺炎克雷伯菌 ＴａｑＭａｎ 荧光定量 ＰＣＲ。结果 显 示，该 方 法 与 猪 肺 炎 支 原 体、猪 鼻 支 原 体、臭 鼻 克雷伯菌、鼻硬结克雷伯菌、多杀性巴氏杆菌、链球菌、葡萄球菌、大肠 杆 菌、沙 门 菌、肠 球 菌、乳 杆 菌、解 淀 粉 芽胞杆菌、猪丹毒杆菌、奇异变形杆菌和化脓隐秘杆菌共 １５种细菌无交叉反应；标 准 品 浓 度在 ２．２９×１０９～ ２．２９×１０４ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ 范围内具有良好的线性关系，最低可检测到 ２．２９×１０２ ｃｏｐｉｅｓ／μＬ 的 标 准 品 阳 性 质 粒； 批内和批间变异系数均小于３％。临床样 品 的 检 测 结 果 表 明，该 方 法 具 有 敏 感 性 高、特 异 性 好、稳 定 性 强 和 检 测 快 速 的 优 点 ，可 用 于 肺 炎 克 雷 伯 菌 感 染 的 早 期 诊 断 、样 品 的 快 速 检 测 以 及 肺 炎 克 雷 伯 菌 的 定 量 分 析 。
＠１６３．ｃｏｍ。 ＊ 通 信 作 者 ，Ｔｅｌ：０８７１－６５０１５６０６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｃｈｕｎ＿ｌｉ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
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中国兽医科学
第 ４４ 卷
肺 炎 克 雷 伯 菌 （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｋｐｎ） 是 肠 杆 菌 科 、克 雷 伯 菌 属 的 成 员 ，为 一 种 重 要 的 革 兰 阴性、人兽共患 的 条 件 致 病 菌。 该 菌 主 要 引 起 人 和 多种 动 物 的 肺 炎、呼 吸 道 感 染、肠 炎、肝 脓 肿、腹 膜 炎 、脑 膜 炎 、腹 泻 ，甚 至 败 血 症 。 近 年 来 ，国 内 外 肺 炎 克雷伯菌引起人和多种动物感染的报道迅速增多， 现 已 从 患 病 的 猪 、牛 、绵 羊 、山 羊 、鸡 、鸭 、家 兔 、麝 鼠 、 大 熊 猫 、熊 、狐 狸 、梅 花 鹿 、中 华 鳖 、水 貂 、石 龟 等 多 种 动物体内分离到肺炎克雷伯菌 。 ［１－３］ 多重耐 药、强 致 病性肺炎克雷伯菌菌株的出现给养殖业造成了巨大 的经济损失，同时也 给 人 类 食 品 安 全 造 成 了 严 重 威 胁。因此，建立早期 快 速 检 测 方 法 对 肺 炎 克 雷 伯 菌 感染的预防和控制具有十分重要的意义。 在肺炎克雷伯 菌 的 病 原 检 测 方 面，国 内 外 已 经 建立 了 病 原 分 离 鉴 定、普 通 ＰＣＲ［４］和 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ 方 法［５］，但 未 见 ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ 检测方法的报道。为此，本研究利用ｒｅａ１－ｔｉｍｅ ＰＣＲ 技术，经过 反 应 条 件 的 优 化，建 立 了 检 测 肺 炎 克雷 伯 菌 的 ＴａｑＭａｎ 荧 光 定 量 ＰＣＲ。 该 方 法 特 异 强、敏感性高、稳定 性 强 且 快 速，对 人 和 多 种 动 物 肺 炎克雷伯菌感染的 早 期 诊 断、大 通 量 临 床 样 品 的 快 速检测、动物源性食 品 肺 炎 克 雷 伯 菌 污 染 的 快 速 检 测以及肺炎克雷伯菌的快速鉴定和定量都具有重要 意义。
关键词：肺炎克雷伯菌；ＴａｑＭａｎ 荧光定量 ＰＣＲ；１６ＳｒＲＮＡ 基因；早期诊断；定量分析
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＴａｑＭａｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ
ＬＩ Ｆｕ－ｘｉａｎｇ，ＬＩＡＯ Ｄｅ－ｆａｎｇ，ＹＡＯ Ｊｕｎ，ＸＩＯＮＧ Ｈｅ－ｌｉ，ＬＩ Ｈｕａ－ｃｈｕｎ
ＴＧＴＣ－３′，下 游 引 物 ＫＰ－ｑＰＣＲ－Ｐｒ：５′－ＣＣＣＣＣＣＴＣ－ ＴＡＣＡＡＧＡＣＴＣＴ－３ＣＣＧＡＣＴＴＧＡＣＡＧＡＣＣＧ－ ＢＨＱ１－３′。该对 引 物 预 期 扩 增 片 段 的 大 小 为 ２１６ ｂｐ。荧光定量 ＰＣＲ 引 物 和 探 针 均 由Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公 司合成。肺炎克 雷 伯 菌 的 普 通 ＰＣＲ 引 物 则 按 参 考 文献 ［４］报 道 的 方 法 设 计：ＫＰ－Ｐｆ：５′－ＴＧＡＴＴＧ－ ＣＡＴＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧ－３′， ＫＰ－Ｐｒ：５′－ＧＧＴＣＡＡＣ－ ＣＣＡＡＣＧＡＴＣＣＴＧ－３′。该对 引 物 扩 增 肺 炎 克 雷 伯 菌体外溶血酶基 因 ｋｈｅ的 群 特 异 性 ４２８ｂｐ 的 基 因 片段。普通 ＰＣＲ 引 物 由 生 工 生 物 工 程 （上 海）股 份 有限公司合成。