小鼠树突状细胞(DC)培养
树突状细胞实验报告
一、实验目的1. 了解树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）的基本特性及其在免疫调节中的作用。
2. 掌握DCs的分离、培养和鉴定方法。
3. 学习利用DCs进行免疫调节实验。
二、实验原理树突状细胞是机体免疫系统中重要的抗原提呈细胞，具有摄取、加工和呈递抗原的能力。
DCs在启动、调控和维持免疫应答中发挥着关键作用。
本实验通过分离、培养和鉴定DCs，探讨DCs在免疫调节中的作用。
三、实验材料1. 试剂：胎牛血清、RPMI 1640培养基、DMEM培养基、双抗、TNF-α、IL-4、抗鼠CD14抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体等。
2. 仪器：CO2培养箱、倒置显微镜、流式细胞仪等。
四、实验方法1. DCs分离与培养（1）取健康小鼠脾脏，置于DMEM培养基中，剪碎后用200目筛网过滤。
（2）将滤液加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养。
（3）培养3天后，加入TNF-α和IL-4，继续培养至第7天。
2. DCs鉴定（1）收集培养的细胞，用抗鼠CD14抗体进行标记。
（2）用FITC标记的羊抗鼠IgG抗体进行二次染色。
（3）流式细胞仪检测细胞表面CD14的表达情况。
3. 免疫调节实验（1）将分离得到的DCs与抗原共同培养，观察DCs对抗原的摄取和呈递能力。
（2）将DCs与T细胞共同培养，观察DCs对T细胞的激活作用。
五、实验结果1. DCs分离与培养：培养7天后，观察到细胞形态呈树突状，符合DCs的形态特征。
2. DCs鉴定：流式细胞仪检测结果显示，细胞表面CD14的表达率为（95±3）%，说明成功分离出DCs。
3. 免疫调节实验：（1）DCs对抗原的摄取和呈递：在抗原刺激下，DCs能够摄取并呈递抗原，说明DCs具有抗原摄取和呈递能力。
（2）DCs对T细胞的激活作用：在DCs与T细胞共同培养条件下，观察到T细胞增殖，说明DCs具有激活T细胞的作用。
小鼠骨髓源树突状细胞的体外培养及鉴定
源 的未 成 熟 和 成 熟 Ｄ Ｃ．
［ 关键词］树突状细胞 ；小 鼠；近交系 ；骨髓 细胞 ；吞 噬作用
［ 中图分类号］Ｒ ３ ２ ２ ． ２［ 文献标识码］Ａ ［ 文章编号］２ ０ ９ ５ －６ １ ０ Ｘ （ ２ ０ １ ３ ）１ １ －０ ０ ０ ５ －０ ４
Ｃｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ Ｉ ｄｅ ｎｔ ｉ ｉｃ ｆ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｄｅ ｎｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｍｏ ｕｓ ｅ Ｂｏ ｎｅ Ｍａ ｒ ｒ ｏ ｗ ｉ ｎ Ｖｉ ｔ ｒ ｏ
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（ １ ）Ｂ ｉ ｏ ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ，Ｔ ｈ ｅ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ａ ｔ ｅ ｄ Ｃ ｌｍ ａ ｅ ｔ ｔ ｅ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ｌ ａ ｏ ｆＫｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ，Ｋｕ ｎ ｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ １ １ ； ２）Ｄ ｅ ｐ ｔ ． ｆＡ ｏ ｎ ｅ ｓ ｔ ｈ ｅ ｓ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ，Ｔ ｈｅ Ｉ ｓ ｔ Ａ ｆ ｉｌ ｆ ｉ ｔ ａ ｅ ｄ Ｈｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｆＫ ｏ ｕ ｎ ｍ ｉ ｎ ｇ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ， Ｋｔ ｍｍｉ ｎ ｇ Ｙ ｕ ｎ ｎ ａ ｎ ６ ５ ０ ０ ３ １ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ） ［ Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］ Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｉ ｓ ｈ ａ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｃ ｕ ｌ ｔ ｉ ｖ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｄ ｅ ｎ ｄ ｒ ｉ ｔ ｉ ｃ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ（ ＤＣ ） ｆ ｒ ｏ ｍ ｍｏ ｕ ｓ ｅ ｂ ｏ ｎ ｅ ｍ ａ ｒ ｒ ｏ ｗ
小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)培养
小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC）的培养1、取骨髓，对倍稀释2、用滴管沿管壁缓慢加入淋巴细胞分离液(45度角倾斜，尽量产生气泡，起到缓冲作用)3、2000转，离心30分钟4、吸取白膜层，（沿管壁）交替多次吸取，加入5倍体积以上的PBS液5、1500转，离心15分钟（洗掉血小板）6、弃掉上清，留少许回流液，轻弹管壁，加入PBS液至50ml7、800转，离心10分钟，（洗掉红细胞）8、重复两至三次9、加入PBS液至50ml，计数:？个细胞离心后铺板，1X1076孔板培养液，共铺20板。
无血清1640+DNA酶12h后轻晃培养液，洗板后加入完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) 10、第三天每孔补加等体积的完全培养基和GM—CSF(1000U/ml)和IL—4(500U/lml) ，这时细胞部分悬浮11、第五天为imDC，+1LPS(1ug/ml),诱导至第七天，为mDC。
参考Inaba等人的方法，并根据本实验室的经验稍作改进。
即：1. 颈椎脱位法处死C57BL/6小鼠，无菌状态下取股骨和胫骨，浸泡在RPMI-1640培养基中。
2. 用1ml注射器吸取RPMI-1640培养液，从骨干的一端刺入骨髓腔，将骨髓冲洗到一无菌培养皿中，每根骨头反复4～6遍，收集培养皿中的骨髓细胞悬液，离心，1500 rpm×10min。
3. 弃去上清，加入5 ml无菌Tris-NH4Cl溶液悬浮细胞溶解红细胞，于室温下静置2分钟溶解红细胞后，再次离心，1500 rpm×5min，弃上清。
4. 用RPMI-1640培养液洗涤后将细胞用完全培养基悬浮，分至6孔培养板中，并在每孔中加入完全培养基至4 ml，再加入rmGM-CSF至终浓度10 ng/ml，IL-4终浓度10ng/ml。
5. 将细胞培养板放入37℃，含5% CO2的孵箱中培养48小时。
6. 轻轻吹打细胞后，连同培养液一起吸去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞。
bmdc培养方法
bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。
以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。
将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。
将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。
3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。
此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。
在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。
此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。
4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。
将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。
将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。
5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。
用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。
用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。
总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。
dc细胞培养方法
dc细胞培养方法DC细胞（Dendritic Cell）是一类非常重要的免疫细胞，它在机体的免疫防御中起着至关重要的作用。
DC细胞的培养方法是研究人员进行免疫学研究的基础，下面将介绍一种常用的DC细胞培养方法。
我们需要准备培养基。
DC细胞的培养基通常是由多种细胞因子、生长因子和血清组成的。
常用的培养基包括RPMI-1640、DMEM 等。
在培养基中加入适当浓度的人血清或胎牛血清，以提供细胞生长所需的营养物质。
接下来，我们需要获取DC细胞的前体细胞。
一般来说，骨髓或外周血中的单个核细胞（Mononuclear Cells，简称MNCs）是DC 细胞的主要来源。
我们可以通过离心分离的方法来获得MNCs。
将MNCs转移到离心管中，并用PBS缓冲液洗涤一次，以去除血小板和红细胞等细胞。
然后，将MNCs转移到离心管中，并用PBS缓冲液洗涤一次，以去除血小板和红细胞等细胞。
之后，我们需要使用一种刺激因子来诱导MNCs分化为DC细胞。
常用的刺激因子包括GM-CSF （Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor）和IL-4（Interleukin-4）。
将刺激因子加入培养基中，然后将MNCs转移到含有刺激因子的培养基中，进行细胞培养。
在细胞培养过程中，需要定期更换培养基，以保证细胞获得充足的营养物质。
同时，还要检查细胞的形态和生长情况，确保细胞处于正常的生长状态。
通常情况下，DC细胞的培养时间为5-7天。
在培养过程中，我们还可以对DC细胞进行一些操作，以进一步提高其免疫活性。
例如，可以通过刺激因子的调整和细胞因子的添加来调控细胞的分化和功能。
此外，还可以利用基因工程技术对细胞进行改造，使其具有更强的免疫活性和抗肿瘤能力。
总结一下，DC细胞的培养方法是免疫学研究中重要的一环。
通过合理选择培养基和刺激因子，并进行适当的细胞操作，可以获得高质量的DC细胞，用于进一步的免疫学研究和临床治疗。
一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法
专利名称：一种小鼠骨髓来源树突状细胞的培养方法专利类型：发明专利
发明人：国林沛,解晖,杨宪法,王准,彭双鹤,唐慧琴
申请号：CN202111468217.1
申请日：20211203
公开号：CN114058585A
公开日：
20220218
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞培养领域，特别是小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)的原代培养。
该细胞培养步骤，包括：步骤A：获取小鼠完整的股骨；步骤B：获取股骨中的骨髓干细胞；步骤C：将骨髓干细胞接种于细胞培养板中，并加入细胞因子，刺激分化为树突状细胞。
本发明提供了一种经济高效的培养小鼠骨髓来源树突状细胞的方法，数十分钟即可获得大量的骨髓干细胞，加入少量的细胞因子培养6‑8天即可获得2×107以上成熟的树突状细胞。
申请人：无锡市第二人民医院
地址：214001 江苏省无锡市梁溪区中山路68号
国籍：CN
代理机构：天津佳盟知识产权代理有限公司
代理人：林玉慧
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DC培养方法
树突状细胞（DC）培养方法准备：小鼠（8-10周龄）、玻璃皿（用于解剖小鼠）、培养皿（塑料，DC在光滑的皿里转化的好，因此最好使用一次性的塑料培养皿）、剪刀、镊子、纱布、细胞培养液、GKN缓冲液、吸管、离心管（50ml、100ml用饭盒多装一些）、锡箔纸、1ml注射器。
细胞因子：GM-CSF、IL-4高压灭菌：除锡箔纸、注射器，其他物品都需要高压灭菌。
实验步骤：1．取下小鼠的四肢（后两肢最好），分离骨上附着的肌肉、血管、皮肤（用纱布反复的搓），完全暴露出骨及其附带关节，注意不要离断关节。
将腿骨剪成三节即小腿骨、关节处、大腿骨。
2．用1ml注射器吸取GKN（1640也可以，但费用较高），冲洗骨髓至骨完全变白，吹入两个离心管，便于离心找平。
3．1000转5分钟离心，倒掉上清液，再用1640悬起再离心一次，倒掉上清液。
4．加细胞培养液，将骨髓细胞重悬。
一只小鼠大概分4个培养皿，重悬的细胞总量尽量保持4ml。
5．细胞至于培养皿，补充培养基。
即1ml细胞+4ml培养液。
6．加入细胞因子，IL-4和GM-CSF以向DC转化。
GM-CSF 20 ng/ml加入浓度IL-4 10 ng/ml用锡箔纸包裹，避光放入培养箱。
轻拿轻放不可摇晃。
7．第三天（之前不可拿出）等量加入培养基即4ml，并加入对应量的细胞因子。
8．第6~7天骨髓细胞中可转化为DCS（镜下）（预计：50ml细胞培养液、100mlGKN，）GKN平衡盐缓冲液NaCL 8gKCL 0.4gNa2HPO4·12H2O 3.56gNaH2PO40.78g1L 配好后进行过滤除菌。
(NaH2PO4·2H2O 1.014g)葡萄糖 2.0g酚红0.01g去离子水（高压灭菌）由于实验室中仅有NaH2PO4·2H2O因此换算如下：NaH2PO4 NaH2PO4·2H2O（Na：23；P：31）相对分子量120 156质量0.78 1.014因此加NaH2PO4·2H2O为1.014g.1640培养基NaHCO3 2g1640培养基粉1袋1L 用0.22µm滤膜过滤去离子水（高压灭菌）细胞培养液普通1640培养液＋巯基乙醇（终浓度15µmol/L）＋Hepes（终浓度：10mmol/L）＋双抗＋进口胎牛血清1．巯基乙醇：母液为14.4mol/L，先用去离子水进行1000倍稀释，浓度变为14.4mmol/L（相当于14.4µmol/ml），在每升的培养基中加入1ml即可（相当于再进行1000倍稀释），终浓度近似为15µmol/L。
小鼠骨髓及脾脏来源的树突状细胞培养及鉴定
Ｃ Ｆ 和 白细 胞 介 素 （Ｌ ４ 协 同 诱 导 下 培 养 ， Ｓ） Ｉ－ ） 光镜 下 观 察 Ｄ 的 形 态 ， 式 细 胞 仪 检 测 Ｃ ８ 、 Ｄ ６表 达 水 平 。结 果 Ｃ 流 Ｄ ０Ｃ ８ 骨髓 细 胞 体 外 诱 导 培 养 ３天 后 ， 镜 下 显 示 细 胞 表 面 不 规 则 ， 树 突 状 突 起 ， 光 呈 可见 典 型 的 树 突 状 细 胞 形 态 ， 表 达 共 刺 低 激分 子 （ Ｄ ０Ｃ ８ ） Ｃ ８ ， Ｄ ６ 。结 论 与 脾 脏 细 胞 相 比 ， 髓 细 胞 中不 仅 富 含 大 量 的 ＤＣ的 前 体 细 胞 而 且 诱 导 成 ＤＣ时 间 短 。 骨 关 键 词 ： 突状 细 胞 ； 髓 ； 脏 ； 树 骨 脾
ｄ ｔ ｃ ｅ ｗｉｈ ｆｏ ｅｅ ｔｄ ｔ ｌ ｗ ｃ ｔ ｙ ｏｍｅ ｒ ｔ ｙ．Ｒｅ ｕ ｔ ｂｏ ｍ ａ ｒ ｓ ｌｓ ｎｅ ｒｏｗ ｃ ｌｓ ｐｐ ａ ｅ ｉｒ ｇｕｌｒ ａ ｏｒ ｅ ｎ ｉｉ ｐｒ ｅ ｓ ｓ ａ ｔ ｒ ｅ ｌ ａ ｅ ｒ ｄ ｒ ｅ ａ ｎｄ ｆ ｍ ｄ ｄｅ ｄｒｔｃ ｏｃ ｓ ｅ ｆｅ ３
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树突状细胞研究进展 (带参考文献)
树突状细胞研究进展摘要：树突状细胞（dendritic cells ,DC）是目前已知的功能最强的专职性抗原呈递细胞（APC），1973年Steiman和Cohn首次从脾脏中分离出一类与粒细胞、巨噬细胞、和淋巴细胞形态和功能都不相同的白细胞，因其细胞膜向外伸出，形成与神经细胞轴突相似的膜性树突状突起，故命名为树突状细胞。
DC膜表面高度表达MHC的I类和MHCⅡ类分子以及其他多种与免疫应答有关的细胞因子，DC能有效摄取、加工、提呈抗原，并能显著刺激初始型T淋巴细胞的增殖分化和成熟，并在免疫应答中起着重要作用，本文就DC的免疫应答研究进展作一综述。
关键词：树突状细胞结构功能免疫激活免疫耐受近年来随着免疫学与分子生物学的最新进展，人们认识到树突状细胞是机体抗原提呈细胞中最主要的和最有效的成分，在调控机体细胞免疫中起重要的作用。
树突状细胞是开启免疫反应的始动细胞，也是机体免疫应答反应过程中的关键环节。
因此对DC的生物学特征研究越来越受到人们的关注。
1 DC的生物学特征1.1 DC的来源在研究中人们发现DC的来源主要起源于两种途径：1）骨髓来源的DC，大多数DC 来源于骨髓，由骨髓CD34+细胞分化而来，数量较少仅占外周血单核细胞的1％以下。
骨髓CD34+具有双潜能，由M-CSF可诱生为巨噬细胞，而由Ⅵ-CSF／TNF-α可诱生为DC。
骨髓来源的DC 分布广泛，外周血中存在有骨髓来源的DC前体细胞，DC前体细胞进入外周血后进一步分化成熟。
2）淋巴组织来源的DC，是胸腺中分离的前体细胞发育而来，表达低水平的CD34，无其他T细胞标志，主要分布于胸腺髓质T细胞居留区，这类细胞可能与自身及外来抗原的免疫耐受有关。
1.2 DC的形态特征及表面标志不同发育阶段的DC具有不同的形态特征，谢遵江等在体外培养小鼠骨髓树突状细胞的观察研究中，在无菌条件下提取小鼠骨髓细胞进行分化增殖，在光镜下观察。
培养7天后可见，细胞体积增大，周边刺突十分明显，突起较粗大，分支较明显，细胞形态似星形或梭形，细胞核明显，细胞聚集生长。
小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存
中国组织工程研究与临床康复第14卷第45期 2010–11–05出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research November 5, 2010 Vol.14, No.45 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH8455 Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,ChinaZhu Guo-hui★, Studying for master’s degree, Departmentof Urinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrzhugh@hotmail.com Correspondence to:Liu Xiu-heng, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor, Department ofUrinary Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, Hubei Province,Chinadrliuxh@Supported by: the National Natural Science Foundationof China, No. 30672107*Received: 2010-05-01 Accepted: 2010-06-30小鼠骨髓源性树突状细胞培养与冻存*★朱国辉，翁小东，刘修恒，匡幼林Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cellsZhu Guo-hui, Weng Xiao-dong, Liu Xiu-heng, Kuang You-linAbstractBACKGROUND: Dendritic cell is an ideal carrier of tumor antigen due to the presenting function and the promotion of T cell proliferation. How to obtain large numbers of dendritic cells is important for producing tumor vaccine.OBJECTIVE: To induce, culture, amplify and cryopreserve dendritic cells derived from mouse bone marrow, then compare the biological characters of cryopreserved dendritic cells with the fresh dendritic cells, than find an effective method to obtain and store large numbers of dendritic cells.METHODS: Dendritic cells from mouse bone marrow cells were induced, cultured and amplified in complete medium with recombinant mouse granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (rmGM-CSF) (10 μg/L) and recombinant mouse interleukin 4 (rmIL-4) (5 μg/L). On day 6, the dendritic cells were frozen in complete medium with dimethyl sulphoxide. After thawing, lipopolysaccharide was added to induce the maturation. At last, large number of mature dendritic cells was obtained. Then the viability, morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction were compared between the thawed cells and fresh cells.RESULTS AND CONCLUSION: After thawing, the recovery rate of cells was (82.2±4.73)%. The survival cells became mature dendritic cells induced by lipopolysaccharide. Compared with fresh dendritic cells, there was no significant difference in morphology, dendritic cells markers and mixed lymphocyte reaction. Results suggest that there was no significant difference in biological characters between frozen-thawed dendritic cells and fresh dendritic cells. To store dendritic cells through cryopreservation can avoid repeating culture in different times and can obtain large numbers of dendritic cells.Zhu GH, Weng XD, Liu XH, Kuang YL.Culture and cryopreservation of mouse bone marrow-derived dendritic cells.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2010;14(45): 8455-8459. [ ]摘要背景：树突状细胞因其良好的抗原提呈功能及促T细胞增殖功能，成为肿瘤抗原的良好载体。
小鼠骨髓源CD103+DC分离培养及LPS对其形态与功能特征的影响
小鼠骨髓源CD103+DC分离培养及LPS对其形态与功能特征的影响侯艳华;张凯;王磊;孙静;王旭荣;张康;王学智;李建喜;张景艳【摘要】旨在建立C57BL/6小鼠骨髓源CD103+树突状细胞(CD103+dendritic cell,CD103+DC)分离培养方法,阐述LPS对其形态与功能特征的影响.在无菌条件下分离C57 BL/6小鼠骨髓细胞,并用重组GM-CSF和FLT3L对其进行体外联合诱导培养;利用光镜、扫描电镜、荧光显微镜和流式细胞术,分别对LPS作用前后细胞形态、表型及功能进行了分析.结果表明,细胞培养至第3天有零星集落出现,第13天后集落开始分散,可见典型的树突状突起,第15天后可得到大量的CD103+DC,加LPS刺激培养24 h后细胞表面树突样结构更加明显;分离培养的骨髓细胞能够表达表面分子CD103,其表达率达90％以上.RPMI-1640组(LPS未刺激组)可吞噬VOA的CD103+DC比例为25.70％,能够表达MHC-Ⅱ和CD83阳性细胞分别为41.31％和13.79％;LPS刺激组可吞噬VOA的CD103+DC比例为10.33％,能够表达MHC-Ⅱ和CD83的阳性细胞分别为68.10％和24.71％.MTT法检测结果显示,经LPS处理的CD103+DC刺激T细胞增殖的能力明显增强.综上所述,分离于C57BL/6小鼠的骨髓细胞,可在体外经FLT3L和GM-CSF共同诱导培养出CD103+DC,LPS可促进CD103+DC的成熟.【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2018(030)007【总页数】10页(P1122-1131)【关键词】C57BL/6小鼠;骨髓源CD103+DC;分离培养;LPS;功能特征【作者】侯艳华;张凯;王磊;孙静;王旭荣;张康;王学智;李建喜;张景艳【作者单位】中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃兰州730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃兰州 730050;中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省中兽药工程技术研究中心,甘肃兰州 730050【正文语种】中文【中图分类】S852.4树突状细胞(dendritic cells，DCs)是目前所知的功能最强的专职抗原提呈细胞，能够高效地摄取、加工处理和提呈抗原，在通过天然免疫与获得性免疫调节而维持机体稳态方面起着重要作用。
小鼠骨髓dc细胞流式细胞术圈门策略_概述及解释说明
小鼠骨髓dc细胞流式细胞术圈门策略概述及解释说明1. 引言1.1 概述近年来，骨髓DC细胞在免疫学研究中引起了广泛关注。
作为免疫系统中重要的抗原呈递细胞类型之一，骨髓DC细胞在调控免疫应答和免疫耐受过程中发挥着关键作用。
为了深入了解小鼠骨髓DC细胞的特性和功能，流式细胞术被广泛应用于其表型和功能分析。
然而，由于样本中包含多种不同类型的细胞，准确地识别和分选小鼠骨髓DC细胞成为一项挑战。
1.2 文章结构本文将首先对小鼠骨髓DC细胞、流式细胞术及圈门策略进行概述。
接着，详细解释说明小鼠骨髓DC细胞流式细胞术圈门策略的关键要点。
最后，总结文章主要发现，并讨论其在免疫学研究中的意义和展望。
1.3 目的本文旨在全面介绍小鼠骨髓DC细胞流式细胞术圈门策略的原理、方法和应用。
通过对其前沿研究进行概述和解释说明，读者将能够更好地理解和运用这一技术，促进免疫学领域的研究进展。
2. 小鼠骨髓DC细胞流式细胞术圈门策略概述：2.1 小鼠骨髓DC细胞：小鼠骨髓DC（树突状细胞）是免疫系统中的一类重要抗原呈递细胞。
它们起着连接天然免疫和适应性免疫的关键作用，通过捕获、处理和呈递外源性抗原来激活T淋巴细胞。
小鼠体内的DC细胞主要分为两个亚群：CD4+CD11b- 和CD4+CD11b+。
2.2 流式细胞术介绍：流式细胞术（flow cytometry）是一种用于分析、计数和分类单个或多个生物学元件的技术。
它以高速流动的液态样本通过荧光标记的抗体和其他探针，使得这些探针与目标表面上的特定标志物结合，并通过检测所发出的荧光来确定目标对象的特征。
该技术广泛应用于生物学、医学研究以及临床诊断等领域。
2.3 圈门策略介绍：在流式细胞术中，为了准确地分析和鉴定感兴趣的细胞类型，需要使用圈门策略（gating strategy）。
圈门是根据特定的荧光信号设置，在流式细胞仪中将所需的细胞子群圈起来。
对于小鼠骨髓DC细胞流式细胞术，圈门策略可用于区分不同亚群的DC细胞。
树突状细胞与黑色素瘤细胞体外共培养体系对小鼠黑色素瘤形成的影响
树突状细胞与黑色素瘤细胞体外共培养体系对小鼠黑色素瘤形成的影响郑云梅;和晨辰;王世忠;沈万秋;李海东【摘要】目的探讨树突状细胞(DC)与黑色素瘤细胞(B16)体外共培养后对小鼠黑色素瘤生长的影响.方法提取小鼠骨髓细胞,分化DC,培养至第6天,将细胞分为4组,脂多糖(LPS)组、聚肌胞[Poly(IC)]组、Melan-A抗原肽(Melan-A)组分别加入DC佐剂LPS(终浓度100 ng/mL)、Poly(IC)(终浓度20 ng/mL)、Melan-A抗原肽(终浓度5μmol/L)进行处理,未处理组未进行干预.采用流式细胞术检测DC成熟状态.B16细胞与培养第6天的DC共培养2 d.取C57BL/6J小鼠皮下注射B16细胞(8只),DC+B16细胞(8只),LPS(8只)、poly(IC)(8只)、Melan-A抗原肽激活(8只)的DC+B16细胞,接种B16细胞1周再接种DC+B16细胞(5只),对照组(3只)不接种细胞.于接种第14天取部分小鼠处死,取脾脏,镜下观察其组织形态,接种第28天测算肿瘤体积.结果LPS组、Poly(IC)组、Melan-A组成熟DC多于未处理组.接种DC+B16细胞的小鼠未见肿瘤生长;接种第28天,与接种B16细胞的小鼠比较,接种LPS、poly(IC)、Melan-A抗原肽激活的DC+B16细胞及接种B16细胞1周再接种DC+B16细胞的小鼠肿瘤体积减小(P均<0.05).与对照组比较,第14天接种DC+B16细胞小鼠脾脏滤泡结构无明显变化,而接种B16细胞及LPS、poly(IC)、Melan-A抗原肽激活的DC+B16细胞小鼠,脾脏滤泡结构增加.结论 DC与B16共培养的可抑制小鼠黑色素瘤的形成.%Objective To investigate the effect of co-culturing dendritic cells (DC)with melanoma cells (B16)on growth of melanoma in mice.Methods We extracted the bone marrow cells.Mouse DC were cultured for 6 days and then were divided into 4groups:lipopolysaccharide (LPS)group,Poly (IC)group,Melan-A group andthe control group. Cells in the LPS group,Poly (IC)group,Melan-A group were incubated with LPS (LPS with final concentration of 100 ng/mL),poly-inosinic-cytidylic acid [Poly(IC)with final concentration of 20 ng/mL]and Melan-A peptide (with final concentration of 5 μmol/L),respectively.The control group was not treated.Flow cytometry was used to study the matura-tion and activation state of DC.B16-F10 (B16)melanoma cells were co-cultured with DC for 2 days and then were used for inoculation of mice.For melanoma model,C57BL/6J mice were inoculated subcutaneously.Some mice were killed at 14 days after inoculation and their spleens were taken to study the structural changes by histochemistry.Tumor size was meas-ured at 28 days after inoculation.Results More mature DC were produced after LPS,Poly(IC)or Melan-A peptide treat-ment as compared with that of the control group (P <0.05).There was no tumor growth after DC +B16 cell inoculation. Compared with the mice inoculated with B16 cells only,the tumor volume was smaller in the mice inoculated with LPS,Po-ly(IC)or Melan-A peptide-activated DC +B16 cells or the mice inoculated with B16 cells one week later followed by an-other inoculation of DC +B16 cells (all P<0.05).Compared with the control group,there was no structural change of the spleen follicles in the mice inoculated with DC +B16,but the number of spleen follicles was increased in the mice inocula-ted with B16 or with LPS,Poly (IC),or Melan-A peptide-activated DC +B16 cells.Conclusion DC co-cultured with B16 can inhibit the growth of melanoma in mice.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2017(057)005【总页数】3页(P1-3)【关键词】黑色素瘤;树突状细胞;免疫治疗;小鼠【作者】郑云梅;和晨辰;王世忠;沈万秋;李海东【作者单位】天津医科大学基础医学院,天津 300070;天津医科大学药学院;天津医科大学基础医学院,天津 300070;天津医科大学药学院;天津医科大学基础医学院,天津 300070【正文语种】中文【中图分类】R739.5黑色素瘤恶性程度高，转移发生早，病死率高[1]。
树突状细胞培养方法
2.2.4 小鼠骨髓源性树突状细胞的培养1）颈椎脱位法处死健康雄性4到6周龄的BABLIc小鼠，75％乙醇浸泡10分钟。
2）无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剥离附着的肌肉软组织后浸泡在75%乙醇中2分钟。
RPMI1640冲洗，剪开骨的两端，1 ml 注射器抽取RPMI1640，分别从骨两端插入骨髓腔反复冲洗直至变白，RPMI1640清洗骨髓细胞后重悬。
3）在离心管中预先加入小鼠脾淋巴细胞分离液，将相同体积的骨髓细胞悬液小心加入淋巴细胞分离液上层，不打乱两层液体界面。
4）4℃，1500rpm离心7min后吸取中间白膜层，PBS清洗所获的单个核细胞。
5）BMDC完全培养液重悬后，以2×106每孔的浓度分种至6孔培养板中，每孔4ml完全培养基。
6）将细胞培养板放入37℃，含5%CO2的培养箱中培养6小时。
7）弯头滴管轻轻吹打，连同培养液一起弃去悬浮细胞，仅保留贴壁细胞；加入新鲜完全培养基和500 U/ml的rmGM-CSF及rmIL-4继续培养。
8）隔日半量换液，补加相同浓度细胞因子，尽量保留悬浮细胞。
9）培养至第6天，轻轻吹打收集所有悬浮细胞，即为未成熟的BMDC。
10）诱导培养过程中每天观察细胞集落及形态变化并拍照。
11）流式检测所诱导的未成熟BMDC表面分子CD11c的表达以评估BMDC 的纯度。
收集培养至第6天的BMDC，PBS洗2次，1×106个细胞用冷的Buffer （PH7.2的PBS+150mMNacl+ 0.09%NaN3+0.2%BSA）100µL悬浮。
加入3µL FITC-CD11c，对照管加入PBS，4℃冰箱避光反应45min。
Buffer洗2次，弃上清，500µL 1%多聚甲醛固定。
送第四军医大学流式细胞室上机检测。
(完整版)DC细胞的分离及培养
DC细胞的分离及培养一、单个核细胞的分离1. 取新鲜脐带血按等体积加血液稀释液或PBS，混合均匀。
2. 将Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）瓶来回倒置几次，以确保其混合均匀。
使用带注射针头的注射器刺穿隔片，倒置Ficoll-Paque PLUS 瓶并抽取需要量的Ficoll-Paque PLUS。
3. 将Ficoll-Paque PLUS 取3 ml 缓缓加入15 ml离心管中。
4. 轻轻加入稀释血液样品4 ml，使其置于Ficoll-Paque PREMIUM层上。
加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不得混合。
5. 在18-20 °C 下，离心400 g 30-40 分钟。
6. 使用无菌的吸管或移液器抽出上层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。
7. 采用一无菌的吸管或移液器将淋巴细胞层移入一清洁的离心管中。
在最小量的情况下移出界面处所有的物质至关重要。
移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。
8. 向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的PBS溶液。
9. 用吸管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。
在18-20 °C 下，以60-100 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液。
10. 重复步骤8-9，至此，淋巴细胞应悬浮于适合CD34阳性细胞分选液中。
二、CD34阳性细胞分选1. 使用含0.5% BSA的PBS（分选buffer）重悬制备好的单个核细胞，加入50~100 μl CD34+ microbeads（Miltenyi公司），4 °C混合半个小时。
2. 选择合适的分选柱，MS柱适合50 ml血量，更多则使用LS柱。
3. 用分选buffer平衡分选柱3个柱体积后，将分选柱至于磁极上。
4. 将步骤1的悬浊液混合物以300 g 速度离心10 分钟，丢弃上清液，并使用2-3 ml的分选buffer重悬。
小鼠dc细胞提取原理
小鼠dc细胞提取原理小鼠DC细胞提取是一种常用的实验技术，用于研究小鼠的树突状细胞（Dendritic Cell，简称为DC细胞）。
DC细胞是免疫系统中重要的抗原呈现细胞，具有调节和激活免疫反应的功能。
以下是小鼠DC细胞提取的原理和步骤。
1. 小鼠准备：选择适合的小鼠品系，根据需要的DC细胞类型进行选择。
小鼠可以通过麻醉和牺牲来收集组织。
2. 组织切割：使用无菌器械将收集的小鼠组织切割成小块，并将其转移到称重器皿中，以便进一步分类和处理。
3. 组织消化：将组织块置于含有适当酶解酶的消化液中（如胰蛋白酶），并在37摄氏度的恒温搅拌条件下进行消化。
消化时间根据组织类型和实验需求而定。
4. 细胞分离：经过适当的消化时间后，将消化液过筛或过滤，并使用无菌操作将细胞转移到离心管中。
离心操作可分离细胞悬浮液和残留的组织碎片。
5. 密度梯度离心：为了分离出DC细胞，可以将细胞悬浮液进行密度梯度离心，以分离不同细胞类型。
常用的密度梯度离心介质有离心液（如Ficoll）。
6. DC细胞纯化：通过离心梯度离心后，可以通过其他细胞纯化方法（如磁分选或流式细胞术）进一步纯化DC细胞，以获得更纯的细胞群体。
7. DC细胞检测：通过染色或使用特定的抗体标记方法，可以对提取的DC细胞进行检测和鉴定。
这可以包括对DC细胞特异标志物的检测，如CD11c、CD11b、CD80和CD86等。
小鼠DC细胞提取原理涉及多个步骤，从选择小鼠到最后的细胞检测，每一步都至关重要。
正确操作和技术的运用将有助于获得高质量、纯净的小鼠DC细胞用于后续的实验研究。
DC细胞培养方案
DC细胞培养方案简介：树突状细胞（Dendritic Cell，DC）是一类具有强大抗原递呈和免疫调节功能的免疫细胞，是免疫系统中重要的抗原递呈细胞。
DC细胞的体外培养是进行DC相关研究的重要步骤之一，如DC疫苗制备、疾病免疫治疗等。
下面介绍一种常用的DC细胞培养方案。
材料和试剂：1. FBS（Fetal Bovine Serum）2.RPMI1640培养基3. GM-CSF（Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor）4. IL-4（Interleukin-4）5. TNF-α（Tumor Necrosis Factor alpha）6. IL-1β（Interleukin-1 beta）7. IL-6（Interleukin-6）8. Penicillin-Streptomycin9.L-谷氨酰胺10.制备DC的细胞株或组织样品步骤：1.细胞培养和细胞数目的调整a. 将DC细胞株或组织样品接种在25cm2或75cm2细胞培养瓶中，加入合适的RPMI 1640培养基（含10% FBS和1% Penicillin-Streptomycin）进行培养。
b.细胞数量达到80-90%的对数生长期后，将细胞收获，用PBS洗涤干净，进行细胞计数。
c.根据需要的DC细胞数量调整细胞数目到合适的浓度。
2.细胞分化和培养a.将调整后的细胞悬浮液以2×106个细胞/mL的浓度加入含有GM-CSF（1000U/mL）和IL-4（1000U/mL）的RPMI1640培养基中，混匀。
b.将细胞悬液分配到含有GM-CSF和IL-4的细胞培养瓶中，培养在37℃、5%CO2的恒温培养箱中。
c.48小时后，将培养基中的非贴壁细胞及细胞悬浮物移除，保留贴壁细胞。
d.继续用新鲜的RPMI1640培养基中加入GM-CSF（1000U/mL）和IL-4（1000U/mL）进行培养。
DC培养方法
树突状细胞（DC）培养方法准备：小鼠（8-10周龄）、玻璃皿（用于解剖小鼠）、培养皿（塑料，DC在光滑的皿里转化的好，因此最好使用一次性的塑料培养皿）、剪刀、镊子、纱布、细胞培养液、GKN缓冲液、吸管、离心管（50ml、100ml用饭盒多装一些）、锡箔纸、1ml注射器。
细胞因子：GM-CSF、IL-4高压灭菌：除锡箔纸、注射器，其他物品都需要高压灭菌。
实验步骤：1．取下小鼠的四肢（后两肢最好），分离骨上附着的肌肉、血管、皮肤（用纱布反复的搓），完全暴露出骨及其附带关节，注意不要离断关节。
将腿骨剪成三节即小腿骨、关节处、大腿骨。
2．用1ml注射器吸取GKN（1640也可以，但费用较高），冲洗骨髓至骨完全变白，吹入两个离心管，便于离心找平。
3．1000转5分钟离心，倒掉上清液，再用1640悬起再离心一次，倒掉上清液。
4．加细胞培养液，将骨髓细胞重悬。
一只小鼠大概分4个培养皿，重悬的细胞总量尽量保持4ml。
5．细胞至于培养皿，补充培养基。
即1ml细胞+4ml培养液。
6．加入细胞因子，IL-4和GM-CSF以向DC转化。
GM-CSF 20 ng/ml加入浓度IL-4 10 ng/ml用锡箔纸包裹，避光放入培养箱。
轻拿轻放不可摇晃。
7．第三天（之前不可拿出）等量加入培养基即4ml，并加入对应量的细胞因子。
8．第6~7天骨髓细胞中可转化为DCS（镜下）（预计：50ml细胞培养液、100mlGKN，）GKN平衡盐缓冲液NaCL 8gKCL 0.4gNa2HPO4·12H2O 3.56gNaH2PO40.78g1L 配好后进行过滤除菌。
(NaH2PO4·2H2O 1.014g)葡萄糖 2.0g酚红0.01g去离子水（高压灭菌）由于实验室中仅有NaH2PO4·2H2O因此换算如下：NaH2PO4 NaH2PO4·2H2O（Na：23；P：31）相对分子量120 156质量0.78 1.014因此加NaH2PO4·2H2O为1.014g.1640培养基NaHCO3 2g1640培养基粉1袋1L 用0.22µm滤膜过滤去离子水（高压灭菌）细胞培养液普通1640培养液＋巯基乙醇（终浓度15µmol/L）＋Hepes（终浓度：10mmol/L）＋双抗＋进口胎牛血清1．巯基乙醇：母液为14.4mol/L，先用去离子水进行1000倍稀释，浓度变为14.4mmol/L （相当于14.4µmol/ml），在每升的培养基中加入1ml即可（相当于再进行1000倍稀释），终浓度近似为15µmol/L。
dc疫苗 培养流程
dc疫苗培养流程DC疫苗（Dendritic Cell Vaccine）是一种新型的癌症免疫治疗方法，通过培养和激活患者自身的树突状细胞（Dendritic Cell），提高免疫系统对癌细胞的识别和攻击能力。
本文将从DC疫苗的培养流程进行介绍，以便更好地了解这一治疗方法的原理和操作过程。
培养DC疫苗需要一定数量和质量的树突状细胞。
树突状细胞是一类具有强大抗原递呈功能的免疫细胞，其主要任务是捕获、处理和呈递抗原，激活T细胞的免疫应答。
通常情况下，我们会从患者的外周血或骨髓中采集到单个核细胞（Mononuclear Cell，MNC），然后通过负选择或正选择的方法分离出树突状细胞。
接下来，我们需要对分离得到的树突状细胞进行培养和激活。
首先，将树突状细胞放入含有足够营养物质的培养基中，提供细胞所需的生长因子和营养物质，使其能够生长和增殖。
同时，还需要添加一定浓度的肿瘤抗原或抗原肽，以激活树突状细胞对抗原的识别和处理能力。
在培养过程中，通过调整培养条件和添加适当的激活因子，可以促使树突状细胞发生成熟和激活的变化。
成熟的树突状细胞具有更强的抗原递呈能力和免疫刺激能力，能够更有效地激活T细胞的免疫应答。
因此，在培养过程中，我们需要对树突状细胞进行适时的激活和刺激，以提高其成熟度和免疫活性。
为了增强DC疫苗的抗原递呈和免疫活性，还可以通过基因工程技术对树突状细胞进行改良。
例如，可以将特定抗原基因导入树突状细胞中，使其能够表达和呈递特定抗原，从而增强免疫应答的特异性和强度。
此外，还可以通过转染特定基因或抑制特定信号通路，调控树突状细胞的功能和活性。
在完成树突状细胞的培养和激活后，我们需要将其注射回患者体内，以触发免疫应答并抑制肿瘤的生长。
通常情况下，DC疫苗会与其他治疗方法（如放疗、化疗或免疫检查点抑制剂）联合应用，以增强治疗效果并降低肿瘤的耐药性。
总结起来，DC疫苗的培养流程包括树突状细胞的采集、分离、培养和激活。
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8．加入树突细胞培养液重悬细胞，调整细胞数至1×106/ml(Scepter自动细胞计数器,美国Millipore公司)，按2ml/孔接种至12孔细胞培养板（4.5cm2/孔），置37℃、5%CO2孵箱培养。
9．于培养第3，5天每孔分别更换2ml树突细胞培养液。第6天收集悬浮细胞，流式抗体染色后，流式细胞仪检测树突状细胞的表型。
1.4.4 红细胞裂解液pH7.2（1L）：
NH4CL 8.56g
Tris碱 2.059g
MilliQ水定容至1L 调节pH至7.2
1．处死BALB/c小鼠并浸泡于75%医用酒精10min，随后取小鼠股骨及胫骨并用眼科剪剔除附着在骨骼上的肌肉。
2．剪掉两侧股骨头，将吸满PBS缓冲液的注射器针头插入骨腔中，并缓慢推动注射器冲洗骨髓腔，直至骨变白。
3．将收集到的骨髓细胞悬液500×g离心5mim，弃上清。
4．向骨髓细胞沉淀中加入红细胞裂解液并反复吹打混匀，置37℃孵箱孵，吸弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，200钼铜网过滤除去骨髓细胞悬液中组织碎块。
6．用1ml PBS缓冲液重悬细胞，加入功能纯化抗体抗-小鼠CD4/CD8a/ MHC-Ⅱ/CD45R及兔血清补体，37℃孵育1h，以去除T淋巴细胞、B淋巴细胞及MHC-Ⅱ+细胞。(功能纯化抗体抗-小鼠 CD4(L3T4)、CD8a(Ly-2)、CD45R(B220)、MHC-Ⅱ（I-A/I-E）抗体购自eBioscience公司)