第五章酶工程酶的化学修饰
《酶工程》课后知识题目解析
《酶工程》课后知识题目解析第一章酶工程基础1.名词解释：酶工程、比活力、酶活力、酶活国际单位、酶反应动力学①酶工程：由酶学与化学工程技术、基因工程技术、微生物学技术相结合而产生的一门新技术，是工业上有目的地设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类所需产品或服务于其它目的地一门应用技术。
②比活力：指在特定条件下，单位质量的蛋白质或RNA所拥有的酶活力单位数。
③酶活力：也称为酶活性，是指酶催化某一化学反应的能力。
其大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高。
④酶活国际单位: 1961年国际酶学会议规定：在特定条件(25℃，其它为最适条件)下，每分钟内能转化1μmol底物或催化1μmol产物形成所需要的酶量为1个酶活力单位，即为国际单位（IU）。
⑤酶反应动力学:指主要研究酶反应速度规律及各种因素对酶反应速度影响的科学。
2.说说酶的研究简史酶的研究简史如下：(1)不清楚的应用：酿酒、造酱、制饴、治病等。
(2)酶学的产生：1777年，意大利物理学家 Spallanzani 的山鹰实验；1822年，美国外科医生Beaumont 研究食物在胃里的消化；19世纪30年代，德国科学家施旺获得胃蛋白酶。
1684年，比利时医生Helment提出ferment—引起酿酒过程中物质变化的因素（酵素）；1833年，法国化学家Payen和Person用酒精处理麦芽抽提液，得到淀粉酶；1878年，德国科学家K?hne提出enzyme—从活生物体中分离得到的酶，意思是“在酵母中”（希腊文）。
(3)酶学的迅速发展（理论研究）：1926年,美国康乃尔大学的”独臂学者”萨姆纳博士从刀豆中提取出脲酶结晶，并证明具有蛋白质的性质;1930年，美国的生物化学家Northrop分离得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶结晶，确立了酶的化学本质。
3.说说酶工程的发展概况I.酶工程发展如下：①1894年，日本的高峰让吉用米曲霉制备淀粉酶，酶技术走向商业化：②1908年，德国的Rohm用动物胰脏制得胰蛋白酶，皮革软化及洗涤；③1911年，Wallerstein从木瓜中获得木瓜蛋白酶，用于啤酒的澄清；④1949年，用微生物液体深层培养法进行－淀粉酶的发酵生产，揭开了近代酶工业的序幕；⑤1960年，法国科学家Jacob和Monod 提出的操纵子学说，阐明了酶生物合成的调节机制，通过酶的诱导和解除阻遏，可显著提高酶的产量；⑥1971年各国科学家开始使用“酶工程”这一名词。
酶工程 第五章
第—节 金属离子置换修饰
用于酶分子修饰的金属离子，往往是二价金属离子。例如 Ca 2 , Mg 2 , Mn2 , Zn2 , Co 2 , Cu 2 , Fe2 等等。金属离子置换修饰法只适用于本来 在结构中含有金属离子的酶。 在离子置换修饰的过程中，首先要加入一定量的乙二胺四乙酸 (EDTA)等金属螯合物到酶液中，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯 合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分于筛层析等方法， 可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。然后用不同的金属离子加到 酶液中，酶蛋白与金属离子结合。根据离子种类的不同，经离子置换 后的酶将会出现不同的特性。有些修饰酶活性比原来酶的活性降低， 甚至完全无活性；有些修饰酶的活性比原酶活性提高；有些修饰酶的 稳定性比原酶增加等。所以只要选择到适宜的金属离子作修饰剂，去 置换原来的金属离子，就有可能提高酶活力，增加酶稳定性。
第二节
大分子结合修饰
一、通过修饰提高酶活力
酶的催化能力受诸多因素的影响。本质上是由其特定 的空间结构，特别是由其活性中心的特定构象所决定的。 水溶性大分子通过共价键与酶分子结合后，可使酶的 空间结构发生某些改变，使酶的活性中心更有利于和底物 结合，并形成准确的催化部位，从而使酶活力得以提高。 例如：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可 使该酶的活力提高到原有的活力的2.25倍；用右旋糖酐修 饰胰凝乳蛋白酶，当每分子酶与11分子右旋糖酐结合时， 修饰酶的活力达到原有的活力的5.1倍；每分子胰蛋白酶 用11分子的右旋糖肝修饰后，酶活力可提高30％等。
第二节 大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某 些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分 子结合修饰法。简称为大分子结合法。 通常使用的水溶性大分子修饰剂有：有旋糖酐、聚乙 二醇、肝素、蔗糖聚合物(Ficoll)、聚氨基酸等。这些大 分子在使用前一般需经过活化，然后在一定条件下与酶分 子以共价键结合。对酶分子进行修饰。例如：右旋糖酐先 经高碘酸(HIO4)活化，然后与酶分于的氨基共价结合。
酶工程 第五章酶分子修饰 第四节酶蛋白侧链基团修饰
一、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化台物，称为 氨基修饰剂。主要的有：二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、 二硫化碳、亚硝酸、乙亚腔甲酯、O-甲基异脲、顺丁烯二 酸酐等。这些修饰剂作用于酶蛋白侧键上的氨基或产生脱 氨基作用，或与氨是共价结合将氨基屏蔽起来，使氨基原 有的副链改变，从而改变酶蛋白的构象。
酶蛋白侧链基团的修饰可以使用各种小分子物质，也 可使用各种大分子物质。其中使用水溶性大分子与侧链基 团结合的属大分子结合修饰，已在本章第二节阐述。使用 不溶性大分子与酶侧链基团结合的属于结合固定化方法， 将在下一章介绍。本节主要介绍各种小分子化合物与酶蛋 白侧极基团相互作用的修饰方法。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
已知大肠杆菌的苹果酸酶可催化下列4种生化反应：
该酶的巯基用乙基马来酰亚胺修饰后，其催化 主反应A的功能消失，同时也失去催化反应B的能力， 然而催化反应C和D的酶活性却提高10倍以上。
第四节 酶蛋白侧链基团修饰
酶经侧链基团修饰后，对于酶的活性、稳定性或抗原 性都有显著影响，往往可提高其使用价值。例如：用O-甲 基异脲修饰溶菌酶，使赖氨酸残基的ε-氨基与之结合， 修饰后酶活力保持不变，但稳定性提高，且很容易结晶析 出；用亚硝酸修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸 和肽链中的赖氨酸的氨基脱去变成羟基，经修饰后，该酶 的稳定性大大提高，在体内的半衰期可延长2倍，显著提 高治疗效果；枯草杆菌蛋白酶的第l 04位酪氨酸可特异地 被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由于负电荷能 引入，而增加了对带正电荷底物的结合力；葡萄糖异构酶 经琥珀酰化修饰后，其最适pH值下降0.5单位，并增加酶 的稳定性，这对果葡糖的生产有利。
Chapter5_酶分子修饰
蛋白类酶主要由蛋白质组成，酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质 的氨基酸残基上的功能团。主要包括氨基、羧基、巯基、胍基、 酚基、咪唑基、吲哚基等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋 白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起 酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。
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氨基修饰
采用某些化合物使酶分子侧链上的氨基发生改变，从而改 变酶蛋白的空间构象的方法称为氨基修饰。
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏酶活 性功能的必需基团，使修饰率高，同时酶的活力回收高。 （1）pH与离子强度
pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的 解离状态不同，反应性能也不同。
（2）修饰反应的温度与时间
严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修 饰反应。
(4)分离：酶经过大分子结合修饰后，不同酶分子的修饰效果往往有所差别，需要通过凝 胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果 的修饰酶。
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大分子结合修饰的作用：
(1)通过修饰提高酶活力：每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐 结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋 白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍。 (2)通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性：酶对人体来说是一种外源 性蛋白。当酶进入体内会成为一种抗原，刺激体内产生抗体；酶再 次进入体内，抗体就能和酶特异性结合，酶失去催化功能。二者的 特异结合是由它们之间特定的分子结构引起的。通过酶分子修饰， 使酶结构发生改变，可大大降低甚至消除酶的抗原性，从而保持催 化功能。
5
2 酶分子修饰的基本要求和条件
酶分子的化学修饰
作用： （1）提高酶活力 （2）增加酶的稳定性 （3）降低抗原抗体反应
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根据修饰分子的大小和对酶分子的作用方式，可分为 大分子的非共价修饰和大分子的共价修饰两类。
（1）大分子的非共价修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护
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二、酶化学修饰的基本要求：
决定化学修饰成败的关键是修饰的专一性， 尽量少破坏必需基团，得到高的酶活力回 收。为此，有时需要通过反复试验来确定。
选择修饰剂 选择酶反应条件 反应的专一性
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三、酶分子化学修饰的主要方法
（一）酶分子的主链修饰 （二）酶分子的侧链基团修饰 （三）酶分子的化学交联修饰 （四）酶分子的大分子结合修饰 （五）酶分子的亲和标记修饰 （六）酶分子的基因修饰 （七）与辅助因子相关的修饰
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侧链基团修饰的主要作用
1.探测酶和蛋白质的必须氨基酸残基的性 质和数目。
2.用于酶蛋白的纯度的分析与鉴定
3.探索酶蛋白作用的化学机理
4.用于酶蛋白分子的固定化
（三）酶分子的化学交联修饰 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
概念：既可以酶分子内部亚基之间，也可 以在分子与分子之间。
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（二）酶分子的侧链基团修饰
概念：采用人工方法使酶蛋白的氨基酸残基的侧 链基团与修饰剂发生化学反应，从而改变酶分子 的性质和功能的修饰方法称为侧链修饰基团。
选择性修饰试剂必须要与多肽链中某—种特定的 氨基酸残基侧链基团发生化学反应，并形成紧密 共价结合。酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧 链基团有：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、 酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等。
酶工程-05-酶分子修饰
2)专一性化学修饰 （2）位点专一性修饰（亲和标记） 含有活泼反应基团的底物类似物：
①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与 活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。
②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性中心的基团形 成稳定的共价键。
Enzyme Engineering
位点专一性修饰
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Enzyme Engineering
酶的结构
研究酶活性中心的方法
2、化学修饰法 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团相互作
用。
Problem???
怎样判断化学试剂是同活性中心内的必需基团结 合？
How to determine ?
Enzyme Engineering
催化特性
研究角度 —— 酶学
环境适应性
研究酶分子中一级结构的改变对酶空间构象的影响，进一步探 索酶的结构与催化特性之间的关系
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 探索酶分子的拓扑学及寡聚酶的亚基结合状态 探测酶蛋白部分区域的构象状态，以及结构变化与运动 探索酶的作用机理和催化反应历程
Enzyme Engineering
Enzyme Engineering
酶分子修饰
大分子结合修饰
Macromolecules combine modification
采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶分子的空
间构象发生某些精细的改变，从而改变酶催化特性的方法 常用的大分子
Enzyme Engபைடு நூலகம்neering
酶分子修饰
酶分子修饰的条件
修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行，并尽量不破坏维 持酶活性功能的必需基团
酶工程习题参考答案
第五章酶工程习题答案一、填空题1.决定酶催化活性的因素有两个方面，一是酶分子结构，二是反应条件。
2. Km是米氏常数。
它与酶的种类和反应条件有关。
3..对生产酶的菌种来说，我们必须要考虑的条件有，一是看它是不是致病菌，二是能够利用廉价原料，发酵周期短，产酶量高，三是菌种不易退化，四是最好选用能产生胞外酶的菌种，有利于酶的分离纯化，回收率高。
4.酶制剂有四种类型即液体酶制剂固体酶制剂纯酶制剂固定化酶制剂5.通常酶的固定化方法有吸附法，共价键结合法，交联法，包埋法。
6. 酶分子的体外化学修饰又可分为酶的表面修饰和内部修饰。
经化学修饰的酶热稳定性有较大提高，这是因为修饰剂的多个功能基团与酶分子上的的多个基团（如氨基、羧基、咪唑基等）相互交联，增加了酶分子构象的稳定性。
7. 生物酶工程主要包括三个方面：基因工程方法大量生产酶（克隆酶）；对酶基因修饰产生遗传修饰酶（突变酶）；设计新的酶基因，合成新的酶。
二、问答题1．解释下列名词：核酶：具有催化功能的RNA，包括剪切型核酶和剪接型核酶两类。
克隆酶：通过基因工程手段，克隆各种天然的蛋白质或酶基因，并将其与适当的调节信号连接，再通过一定的载体（质粒）导入能够大量繁殖的微生物体内，使之高效表达。
突变酶：利用有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶的催化特性、底物专一性或辅酶专一性，使之更加符合人们的需要。
进化酶：创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随即突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。
人工酶：又称模拟酶或酶模型，指利用有机化学、生物化学等方法设计和合成一些较天然酶简单的非蛋白质分子或蛋白质分子，以这些分子作为模型来模拟酶对其作用底物的结合和催化过程。
固定化酶：指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
细胞固定化技术：将细胞限制或定位于特定空间位置的技术称为细胞固定化技术。
酶的化学修饰名词解释是什么
酶的化学修饰名词解释是什么酶是生物体内一类催化剂。
它们是由蛋白质组成的，能够加速生物化学反应的速度，但反应本身不会被改变。
酶的活性与其分子结构密切相关，而化学修饰则是指通过改变酶的分子结构来调节其活性或功能的方法。
在这篇文章中，我们将探讨酶的化学修饰的概念、方法和应用。
一、酶的化学修饰是什么？酶的化学修饰是指通过引入化学基团或小分子到酶的分子结构上，从而改变酶的活性、稳定性或选择性的过程。
化学修饰可以发生在酶的氨基酸残基上，如蛋白质N-或C-端基团，也可以直接作用于酶的辅助因子上。
这些修饰可以是酶天然产生的，也可以是人工合成的，用于改善特定酶的性质或开发新的催化功能。
二、常见的化学修饰方法1. 脱氨基修饰：通过酶的氨基酸残基上的脱氨酶催化作用，去除酶中的氨基基团（如酰胺基、酮基等），从而改变酶的电荷分布和立体结构，进而调节酶的催化活性。
例如，氨基酸的去乙酰化可以通过脱乙酰化酶来实现。
2. 硫醇修饰：利用巯基（-SH）在酶分子中的反应活性，可通过脱氧剂（如巯基还原酶）的作用，降低或增加酶中硫醇含量，从而改变酶的三维结构和活性。
硫醇修饰还可以通过反应性硫醇试剂与酶中的巯基反应，如巯基化合物或含硫醇的小分子，来调节酶的性质。
3. 糖基化修饰：通过酶的氨基酸残基与糖分子发生酯键或糖苷键的形成，将糖基连接到酶分子上，从而改变酶的电荷分布和溶解度，以及与其他分子的相互作用。
糖基化修饰常见于糖基转移酶催化的反应过程中，如糖基转移酶可将糖基转移至酶分子的特定氨基酸残基上。
4. 磷酸化修饰：磷酸添加到酶的氨基酸残基上，通过调节酶的电荷分布和构象来改变酶的活性和功能。
磷酸化修饰对于调控细胞信号传导和调控酶的催化活性具有重要作用。
它可以通过激酶催化磷酸化反应，或者通过磷酸酯酶催化去磷酸化反应，来实现。
三、酶的化学修饰的应用1. 工业应用：通过化学修饰可以改善酶的催化效率、稳定性和选择性，从而提高酶在工业上的应用价值。
酶工程5化学修饰
酶分子的化学修饰
酶分子化学修饰
——在体外将酶分子通过人工的方法与 一些化学物质，特别是一些有生物相容 性的物质进行共价连接，从而改变酶的 结构和性质。这些化学物质称为修饰试 剂，酶化学修饰主要用于基础酶学的研 究和疾病治疗。
酶化学修饰的应用领域
在基础酶学研究上
探测酶活性必需氨基酸的性质和数目 酶蛋白一级结构的测定
酶蛋白的结构变化与运动
酶蛋白部分区域的构象状态 酶的作用机理与催化反应历程 酶分子的拓扑学以及寡聚酶的亚基结合状态 酶的固定化技术 酶纯度的分析与检测
在疾病治疗上
—克服酶在体内的不稳定性
—消除或降低酶的抗原性 —有助于酶分子到达并集中于病灶部位 在工业上的应用
—酶稳定性提高，使生产成本降低 Nhomakorabea主要内容
第一节 第二节 第三节
酶分子的化学修饰方法 酶化学修饰的基本要求 修饰酶的化学性质
酶的化学修饰的基本原理
——大量研究表明，酶分子表面外形 的不规则、各原子间极性和电荷的不 同、各氨基酸残基间相互作用等使酶 分子结构的局部形成了一种包含了酶 活性部位的微环境，不管这种微环境 是极性的还是非极性的，都直接影响 到酶活性部位氨基酸残基的电离状态， 并为活性部位发挥催化作用提供合适 的条件。
大分子共价修饰：
——利用一些可溶性大分子，通过共价 键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖 层，形成的可溶性酶具有许多有用的性 质。例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物 歧化酶（SOD），不仅可以降低或消除酶 的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力， 延长了半衰期，从而提高了药效。
（四）分子内交联 ——增加酶分子表面的交联键数 目是提高酶稳定性的有效方法之 一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基 经过羰二亚胺活化后，可以与一 系列二胺发生作用，使酶的稳定 性得到改善。
2011酶工程 第五章 酶的分子修饰
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸 Lys Asp、 Glu 侧链基团 氨基 羧基 修饰剂 三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙 酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸 水溶性碳化二亚胺
Arg
Cys
胍基
巯基 二硫键
苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮
碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺 巯基乙醇、DTT 焦碳酸二乙酯、碘乙酸 碘、四硝基甲烷
Ficoll(高分子量)–SOD 聚乙二醇-SOD
24 h 35 h
240 350
新型修饰剂
优点主要体现在 (1)叉状聚乙二醇可以减少蛋白酶与蛋白质的接触以减弱其 水解作用 (2)聚乙二醇结构变化造成的空间位阻效应减少了聚乙二醇 与蛋白质的结合位点减少蛋白沉淀 (3)聚乙二醇对蛋白质的屏蔽效应更为显著更好地降低蛋白 药物的抗原性和免疫原性
半衰期相对稳定性天然sod70ficoll低分子量sod14140ficoll高分子量sod24240聚乙二醇sod35image优点主要体现在1叉状聚乙二醇可以减少蛋白酶与蛋白质的接触以减弱其水解作用2聚乙二醇结构变化造成的空间位阻效应减少了聚乙二醇与蛋白质的结合位点减少蛋白沉淀3聚乙二醇对蛋白质的屏蔽效应更为显著更好地降低蛋白药物的抗原性和免疫原性imagetst的毒性以及卤原子过强的亲核活性使其应用受到限制imagecdi活化peg需注意cdi遇水生成co2和咪唑所以活化反应宜在有机溶剂中进行溶剂不能含水活化后的聚二醇应用冷冻干燥法除去残留的有机溶剂以免使偶联的蛋白失效偶联蛋白质的缓冲液勿含有胺类如tris或甘氨酸否则它将与待连接的蛋白分子竞争偶联image其方法操作简单容易重复而且反应环境温和但其偶联后的配基包括蛋白质rnh很容易脱落
（4）溴化氰法
其方法操作简单容易重复而且反应环境温和 但其偶联后的配基(包括蛋白质R-NH2)很容易脱落。 这种脱落主要是由于活化载体和含氨基配基之间形成不 稳定的异脲键所引起的 加之溴化氰有毒操作须在通风橱中进行该方法逐渐被 其它方法所取代
酶工程酶分子侧链基团的化学修饰
一．特定氨基酸残基侧链基团的 化学修饰
• 酶分子中经常被修饰的氨基酸残基 侧链基团有：巯基，氨基，羧基， 咪唑基，酚基，胍基，吲哚基，硫 醚基及二硫键等。
1．巯基的化学修饰
• 巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰 剂与酶蛋 白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶 的空间构象、特性和功能。
• ①烷基化试剂 烷基试剂中用得最多的是碘乙酸，碘乙酰胺, 巯基乙醇，谷胱甘肽(GSH)。
→ E—SH + ICH2COOH(或ICH2CONH2) E—S—CH2COOH(或E—
S—CH2CONH2)+HI ②汞试剂 这类试剂如HgCl2，对氯汞苯甲酸(p二酮
二羰基化合物 1，2－环己二酮
苯乙二醛
几种重要的修饰反应 1．烷基化反应
2．酰化及其相关反应
3．氧化和还原反应
4．芳香环取代反应
• 重要的修饰反应*
酰化及其相关反应 烷基化反应 氧化和还原反应 芳香环取代反应
• 特定氨基酸残基 侧链基团的化学 修饰*
巯基的化学修饰 氨基的化学修饰 羧基的化学修饰 咪唑基的化学修饰 胍基的化学修饰 二硫基的化学修饰
4．咪唑基的化学修饰
常用修饰剂：碘乙酸、 焦碳酸二乙酯等； 其中焦碳酸二乙酯在近 中性的条件下对组氨酸 残基上的咪唑基具有较 好的特异修饰能力，而 且产物在240 nm波长处 有最大吸收峰，可以通 过修饰得知分子中咪唑 基的数量。
5. 胍基的化学修饰
来源：Arg 修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。 修饰剂：
①乙酸酐修饰 ②2,4,6—三硝基苯磺酸修饰. ③2,4—二硝基氟苯修饰(Sanger 反应) ④氨基的烷基化.这类试剂包括 卤代乙酸,芳香卤和芳香磺酸等. ⑤丹磺酰氯(DNS)修饰. ⑥苯异硫氰酸酯(PITC)修饰(即 Edman反应)
酶分子修饰
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白 水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上 敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂 后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
同理，其他有机溶媒，去垢剂等也由于会 破坏维持酶天然构象的平衡力和改变微环 境而导致酶失活。
4、消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
酶经过化学修饰后，除了能减少由于内部平衡力 被破坏而引起的酶分子伸展打开外，还由于大分 子修饰剂本身就是多聚电荷体，所以有可能在酶 分子表面形成一层“缓冲外壳”。在一定程度上 抵御外界环境的电荷、极性变化，维持酶活性部 位的微环境相对稳定，使酶能在更广泛的条件下 发挥作用。
3、维持酶功能结构的完整性与抗蛋白酶水解
根据蛋白水解酶是一大分子物质，并只是在充分接近多肽 链上敏感键和敏感基团后才能产生作用的原理，酶化学修 饰期望交联于酶上的大分子修饰剂能产生空间障碍来阻挡 蛋白水解酶接近酶分子，能“遮盖”酶分子上敏感键免遭 破坏。 另外，酶分子上许多敏感基团（如赖氨酸的ε-氨基等）参 与修饰反应，交联上修饰剂后，也减少了酶分子遭受蛋白 水解酶攻击破坏的可能性。
化学修饰方法虽多，但基本都是利用修饰剂所具有的各种 化学基团特性，或直接或经过一定的活化过程，与酶分子 上某氨基酸残基（一般尽量选酶活性非必需基团）产生化 学反应，对酶分子结构进行改造。
化学修饰是分子酶工程的重要手段之一。 只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保 持酶活性的基础上，能够在较大范围内改 变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良 特性，甚至创造出新的活性。
酶分子的基本结构是蛋白质，这一特性就决定了 当某种酶在作用于底物使之转变为产物的同时， 其本身也可能成为另一种酶（如蛋白水解酶）的 底物。对于蛋白水解酶来讲，一般是作用于某些 特定敏感键后，导致蛋白多肽链断裂。
酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生
十一次课
02
2
1
酶分子侧链基团修饰
酶侧链基团的修饰方法很多，主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、酚基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰及分子内交联修饰等
功能基团主要有氨基、羧基、巯基．咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基
3
各种氨基酸侧链的修饰剂
氨基酸
侧链基团
修饰剂
Lys
氨基
三硝基苯磺酸，2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸
02
分离
03
需要通过不同的方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。
04
金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。 金属离子置换修饰的方法：酶的纯化、去除原有的金属离子、加入置换离子 金属离子置换修饰的作用：
聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。
酶
半衰期
相对稳定性
天然SOD
6 min
1
右旋糖酐-SOD
7 h
70
Ficoll(低分子量)–SOD
14 h
140
Ficoll(高分子量)–SOD
2
引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。
01
仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。
02
有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。
03
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：
氨基酸置换修饰
将酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法，称为氨基酸置换修饰。
4.8第五章酶分子修饰
等次级键结合。
单选题 1分
下列关于酶活性部位的描述错误的一项是 。
活性部位是酶分子中直接与底物结合，并发挥催 A 化功能的部位
活性部位的基团按功能可分为两大类：一类是结 B 合基团，一类是催化基团
酶活性部位的基团可以是同一条肽链但在一级结 C 构上相距很远的基团 D 不同肽链上的有关基团不能构成该酶的活性部位
▪ 超氧化物歧化酶（SOD）：生物体内重要的自由 基清除剂，催化超氧阴离子（O2-）的歧化反应， 能缓解许多由自由基介导的炎症反应，减轻组织 缺血性损伤，预防和治疗辐射损伤。
▪ 应用：延缓人体衰老，防止色素沉着，消除局 部炎症，特别是治疗风湿性关节炎、慢性多发 性关节炎及辐射防护。
缺陷：半衰期短（6min）、稳定性差、免疫原 性强！
单选题 1分
利用物理吸附法对酶进行固定化主要通过 载体上。
结合于
A 氢键、疏水作用和π-电子亲和力 B 氢键、离子键和π-电子亲和力 C 氢键、离子键和共价键 D 离子键、疏水作用和共价键
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单选题 1分
酶固定化后，受载体带电性和产物性质的影响，其最适pH和 酶活力-pH曲线常发生偏移。一般来说，用带负电荷载体制 备的固定化酶，其最适pH较游离酶 ；当催化反应的产物 为碱性时，固定化后酶的最适pH值较游离酶 。
消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期 用Dextran修饰-淀粉酶，-淀粉酶，胰蛋白酶、 过氧化氢酶：提高了酶的热稳定性。
（2）侧链基团修饰（小分子修饰 ）
（side residues modification）
通过小分子化学修饰剂使酶分子侧链基团发生改变， 从而改变酶的催化特性的修饰方法。
酶工程 第五章酶分子修饰 第五节氨基酸置换修饰
第五节 氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰除了在酶工程方面应用之外，还可用 来修饰其他功能蛋白质或多肽分子。例如：β-干扰素原 来稳定性差。这是由于其分子中含有3个半胱氨酸，其中2 个半胱氨酸的巯基连结形成二硫键，而另一个在第17位的 半肮氨酸(Cys-17)的巯基是游离的。当β-干扰素分子的 游离巯基与另—个β-干扰素的游离巯基相结合形成二硫 键时，β-干扰素就失去其活性。若将这个半胱氨酸(Cys17)用丝氨酸置换，就使β-干扰素不会生成二聚干扰素， 从而大大提高其稳定性。经修饰后的β-干扰素在低温条 件下保存半年，仍可保持其活性不变，这就为β-干扰素 的临床使用创造了条件。
第五节 氨基酸置换修饰
氨基酸置换修饰可以用化学方法进行。例如：Bender 和Koshland成功地用化学方法将枯草杆菌蛋白酶活性中心 的丝氨酸转换为半胱氨酸，经修饰后，该酶对蛋白质和肽 的水解能力消失，但却出现了催化硝基苯酯等底物水解的 活性。但是化学方法进行氨基酸置换，难度较大，受到诸 多限制。
80年代兴起和发展起来的蛋白质工程，为氨基酸置换 修饰提供了行之有效的可靠手段。
蛋白质工程又被称为第二代遗传工程。是指通过改造 与蛋白质相对应的基因中的碱基排列次序，或设计合成新 的基因，将它克隆到寄主细胞中，通过基因表达而获得具 有新的特性的蛋白质的技术过程。
第五节 氨基酸置换修饰
蛋白质工程主要步骤如下： 1.新蛋白质结构的设计 根据已知的蛋白质或酶的化学结构、空间结构及其特 性，确定欲得到的新蛋白质或酶的氨基酸排列次序。确定 欲置换的氨基酸及位置。 2.突变基因的核苷酸序列的确定 根据欲得到蛋白质的氨基酸序列，确定其对应的m RNA上的核苷酸序列，再根据互补原则，从mRNA核苷酸序 列确定其所对应的突变基因上的核苷酸序列。依据欲置换 的氨基酸确定需要置换的核苷酸及其位置。
2008级《酶工程》复习大纲
2008级生物技术专业《酶工程》复习大纲试题题型：成对名词解释，判断题，填空题，简答题，论述题，实验设计题。
A、B卷第一章酶工程基础一、名词解释酶，酶工程；转换数，催化周期；酶活力，比活力；酶活国际单位IU，催量kat。
二、问答题1、酶催化的特点有哪些？2、影响酶催化作用的因素有哪些？3、试述米氏方程和米氏常数K m的意义。
第二章酶的发酵工程一、名词解释组成酶，诱导酶；协同诱导，顺序诱导；终产物阻遏，分解代谢物阻遏；葡萄糖效应。
二、问答题1、常见的产酶微生物有哪些？2、对产酶菌种有哪些要求？3、从微生物产酶的上中游阶段调控来分析，可通过哪些措施来提高产酶量？4、结合酶生物合成的四种模式，试述如何提高酶的合成量。
5、如果要筛选酸性蛋白酶高产菌株，请制定筛选方案（策略）。
第三章酶的分离工程一、名词解释盐析，盐溶；双水相，反胶束；超滤，透析。
二、问答题1、试述机械、物理、化学和生物酶法破碎细胞的优缺点（可采用表格归类总结）。
2、酶的提取方法有哪些？在酶的提取过程中应注意哪些问题？3、评价酶分离纯化方法优劣的指标有哪些，各自能反映什么问题？4、试述盐析、等电点和有机溶剂沉淀的原理及各自的优缺点（可采用表格归类总结）。
5、试述凝胶层析、离子交换层析和亲和层析各自的分离原理及操作特性。
6、现在分离得到一株脂肪酶高产菌株，经鉴定为黑曲霉。
利用所学知识，试设计一套从黑曲霉发酵液中分离纯化脂肪酶的实验方案。
已知，黑曲霉所产脂肪酶为胞外酶。
第四章固定化酶与细胞一、名词解释固定化酶，固定化细胞；构象效应，屏蔽效应；微扰效应，分配效应；外扩散限制，内扩散限制。
二、问答题1、固定化酶具有什么优点？2、试述常见固定化酶的方法、原理及其优缺点（可采用表格归类总结）。
3、评价固定化酶固定效果的参数有哪些？4、固定化酶活力降低的可能原因有哪些？5、固定化对酶反应体系产生了哪些影响（效应）？6、固定化酶的表观米氏常数K m’受哪些因素的影响？第五章化学酶工程一、名词解释酶分子改造，酶分子修饰；模拟酶，肽酶；抗体酶，印迹酶。
化学酶工程
O
O
O
白蛋白 NH C CH2CH2C NH 酶 酶 NH2 白蛋白 NH C CH2CH2C O
NO2
第五章 化学酶工程
第一节 酶分子的化学修饰
影响酶化学修饰的因素
分子量的影响 pH对化学修饰的影响 温度的影响 修饰剂与酶的用量之比对修饰效果的影响 反应时间的影响
第五章 化学酶工程
第一节 酶分子的化学修饰
CH3 NCONH 糖肽 NCO
CH3 NCONH NCO
糖肽 酶 NH2
pH9.5
CH3 NCONH
糖肽
NCONH 酶
戊二醛法
糖肽 NH2 + OHC(CH2)3CHO
糖肽 N CH (CH2)3 CHO
糖肽
N
CH
(CH2)3
酶
CHO
NH2
糖肽
N
CH
(CH2)3 CH N
酶
第五章 化学酶工程
具有生物活性的大分子对酶的修饰
第五章 化学酶工程
第一节 酶分子的化学修饰 第二节 模拟酶 第三节 抗体酶 第四节 印迹酶
第五章 化学酶工程
第一节 酶分子的化学修饰
游离酶缺点： 抗原性； 稳定性差； 活性不够高。
第五章 化学酶工程
第一节 酶分子的化学修饰
定义
广义：凡是通过化学的方法和手段或是通过化学反应使酶的分 子结构发生改变的技术或过程，都可称为酶的化学修饰。 狭义：酶的化学修饰则主要是指在较温和的条件下，以可控的 方式使酶同某些化学试剂发生特异反应，从而引起单个氨基酸 残基或其功能基团发生共价的化学改变的过程。
第五章 化学酶工程
第一节 酶分子的化学修饰
酶化学修饰的目的：人为地改变天然酶的一些性质，创造
酶的改造工程
• 在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产， 绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下 有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业 生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在， 反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提 高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来 说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热 稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引 起的活性丧失等。
1. 研究酶的结构与功能的关系。 2. 改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。
1）提高酶活力。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性。 4）产生新的催化能力。
第三节 酶化学修饰的原理
一、如何维持酶的天然构象
修饰剂与酶形成多点交联，使酶的天然构象产生 “刚性”结构。
二、如何保护酶活性部位
由必需基团构成的与酶催化活性有关的 特定区域.
非必需基团
酶
非活性中心
分
子
活性中心外
必需基团
必需基团
结合基团 活
活性中心
性
必需基团
中
催化基团 心
Active site Binding site: determine the specificity of enzyme.
Catalytic site: determine the catalytic ability of enzyme.
蛋白质工程(protein engineering)： 通过改造与蛋白质相应的基因中 的碱基顺序，或设计合成新的基 因，将它克隆至受体细胞中，通 过基因表达而获得具有新的特性 的蛋白质技术。
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四、金学修饰
加入EDTA
加入Ca2+
Zn2+
Ca2+
锌型蛋白酶
透析 EDTA-Zn2+
第五章酶工程酶的化学修饰
钙型蛋白酶 ↑20~30%
第二节 大分子结合修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
一、大分子结合修饰
利用水溶性大分子与酶结合，使酶 的空间结构发生某些精细的改变，从而 改变酶的特性与功能的方法称为大分子 结合修饰法，简称为大分子结合法。
1
：
5.1
第五章酶工程酶的化学修饰
大分子化学修饰的优点
2.通过修饰增强酶的稳定性 酶的半衰期t1/2：酶的活力降低到原来
活力一半时所经过的时间。
很多修饰剂分子具有多个活性基团，常与 酶形成多点交联，使酶的空间结构稳定，特别 是使酶活性中心的构象得到保护。
第五章酶工程酶的化学修饰
举例：超氧化物岐化酶（SOD） O2- + O2- + 2H+ =H2O 2 +O2
二、为什么要对酶进行分子修饰？
1.增强酶活性 2.增强酶的稳定性 3.消除或降低酶的抗原性
第五章酶工程酶的化学修饰
三、酶分子修饰的方法？
1.金属离子置换修饰 2.大分子结合修饰 3.酶蛋白侧链基团化学修饰 4.氨基酸置换修饰 5.物理修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第一节 金属离子置换修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
后，体内血清中就可能出现与此外源蛋白 特异性结合的物质，这些物质称为抗体， 能引起体内产生抗体的物质称为抗原。
大分子化学修饰是降低甚至消除酶抗原性 的有效方法之一：PEG-L-天冬氨酰酶
第五章酶工程酶的化学修饰
第三节 其他修饰方法
第五章酶工程酶的化学修饰
一、肽链有限水解
1.活性中心被破坏，失去催化功能 2.活性中心构象变化不大，活力基本不变 3.活性中心发生有利于与底物的结合并且形
后，体内血清中就可能出现与此外源蛋白 特异性结合的物质，这些物质称为抗体， 能引起体内产生抗体的物质称为抗原。
大分子化学修饰是降低甚至消除酶抗原性 的有效方法之一：PEG-L-天冬氨酰酶
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
SOD作用：保护DNA，蛋白质和细胞膜
SOD药用：类风湿性关节炎，白内障，膀 胱炎，皮肤炎，红斑狼疮等。
SOD静脉注射：t1/2=6~30min 右旋糖酐-SOD：t1/2=7h 聚乙二醇-SOD：t1/2=35h
第五章酶工程酶的化学修饰
大分子化学修饰的优点
3.通过修饰降低或消除酶的抗原性 当外源蛋白非经口进入人或动物体内
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
猪肝尿酸酶用白蛋白修饰: 最适pH由天然酶的10.5,下降到7.4—8.5
第五章 酶分子修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
二、常用的修饰剂
右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖 聚合物、聚氨基酸等
第五章酶工程酶的化学修饰
三、修饰方法
修饰酶
第五章酶工程酶的化学修饰
四、大分子化学修饰的优点
1.通过修饰提高酶的活性
核糖核酸酶 Vs 右旋糖酐修饰核糖核酸酶
1
：
2.25
胰凝乳蛋白酶 Vs 右旋糖酐修饰胰凝乳蛋白酶
一、金属离子置换修饰
通过改变酶分子中所含的金属离子， 使酶的特性和功能发生改变的方法称为 金属离子置换修饰，简称离子置换法。
第五章酶工程酶的化学修饰
二、金属离子置换修饰的目的
提高酶活性 提高酶的稳定性
第五章酶工程酶的化学修饰
三、金属离子置换修饰的适用范围
只适用于本来在结构中含有金属离子的酶 用于酶修饰的金属离子：Ca2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Cu2+, Fe2+…
1
：
5.1
第五章酶工程酶的化学修饰
大分子化学修饰的优点
2.通过修饰增强酶的稳定性 酶的半衰期t1/2：酶的活力降低到原来
活力一半时所经过的时间。
很多修饰剂分子具有多个活性基团，常与 酶形成多点交联，使酶的空间结构稳定，特别 是使酶活性中心的构象得到保护。
第五章酶工程酶的化学修饰
举例：超氧化物岐化酶（SOD） O2- + O2- + 2H+ =H2O 2 +O2
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
氨基的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
胍基的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
SOD作用：保护DNA，蛋白质和细胞膜
SOD药用：类风湿性关节炎，白内障，膀 胱炎，皮肤炎，红斑狼疮等。
SOD静脉注射：t1/2=6~30min 右旋糖酐-SOD：t1/2=7h 聚乙二醇-SOD：t1/2=35h
第五章酶工程酶的化学修饰
大分子化学修饰的优点
3.通过修饰降低或消除酶的抗原性 当外源蛋白非经口进入人或动物体内
第五章酶工程酶的化学修饰
二、常用的修饰剂
右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖 聚合物、聚氨基酸等
第五章酶工程酶的化学修饰
三、修饰方法
修饰酶
第五章酶工程酶的化学修饰
四、大分子化学修饰的优点
1.通过修饰提高酶的活性
核糖核酸酶 Vs 右旋糖酐修饰核糖核酸酶
1
：
2.25
胰凝乳蛋白酶 Vs 右旋糖酐修饰胰凝乳蛋白酶
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
第五章酶工程酶的化学修饰
一、什么是酶的分子修饰？
• 通过各种方法使酶分子结构发生某些 改变，从而改变酶的某些特性和功能 的过程，称为酶的分子修饰。
第五章酶工程酶的化学修饰