SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤

【跑电泳的步骤】

1、取出电泳仪器和四个烧杯；

2、将超纯水倒入烧杯中，保鲜膜封口；

3、配制过硫酸铵溶液（ AP）：0. 1gAP+0. 9g 超纯水，保鲜膜封口；

4、取出所有药品。 Tris-HCL(88,6.8) ，TEMED ，SDS，Acry-bis ，按次序排好；

5、拿卷纸平铺，移液枪枪头：三个蓝，两个黄，一个白，移液枪 3 只；

6、先配分离胶

7、组装凝胶模具，插好板

（1）海绵用自来水润湿，插在下面槽里；

（2）板： Bio-Rad 前后玻璃板，注意前后顺序，夹子夹好，塞枪头于夹子上。

8、配胶见配方，用2号蓝混匀所有试剂；

9、加液至支架上方，用超纯水液封（不能用气泡）；

10、待界面清晰后，用滤纸将水吸干；

11、配浓缩胶；

12、插梳子：一个个斜着插，有字面朝向我；

13、拔下梳子，转移（有字朝里，白色架子垫黄纸，将玻璃板卡在绿卡下面，不要有空隙，装去离子水，不能漏（ 1h），等待。），样品煮沸 3 分钟；

14、用 10uL 移液枪移液，移液，每个依次加入梳槽内；

15、电压（浓缩胶） 90V ，电流 20mV；

16、盖上盖子：红对红，黑对黑；插上电源插头：红对红，黑对黑。

【附配方】

分离胶 separating gel (5mL) ( 1 个板 3.5mL) 1 板 2 板

Prescription12%10%7.5% 3.5 mL7.0 mL

Del H2O 1.6 mL 1.9mL 2.3 mL 1.3 3mL 2.66mL

1.5M Tris-HCL pH8.8 1.3 mL 1.3 mL 1.3 mL0.91 mL 1.82 mL

30%Acry/bis

2 mL 1.7 mL 1.

3 mL 1.19mL 1.38 mL

单体胶（ 29.2g+0.8g/100mL）

10%SDS50uL50uL50uL35uL70uL

10%AP50uL50uL50uL35uL70uL

TEMED2uL2uL(5 uL)2uL 3.5uL 7uL(夏 )~8

uL

浓缩胶 Stacking gel ( 2 板 3mL)

Prescription Volume(2 mL)(2 mL)

Del H2O 1.4mL 2.1mL

0.5M Tris-HCL pH6.8250uL375uL

30%单体胶330uL495uL

10%SDS20uL30uL

10%AP20uL30uL

TEMED2uL(5 uL)3uL(8 uL 冬，5 uL 夏 )【附所需试剂配制】

1、 30%单体胶（ 30%单体胶即 30%T，2.67%C）配制50mL：丙烯酰胺Acry ：14.6g，甲叉双丙烯酰胺bis：0.4g； (100mL：Acry 29.2g，bis 0.8g)超纯水定容至50mL，0.45 uM 膜过滤， 4℃保存（一个月）；说明：单体浓度 %T 是指单体总质量（丙烯酰胺 +双丙烯酰胺）在溶液中的百分比（ m/V ），可选择的范围为 3%~30%；%C 是指双丙烯酰胺与单体总质量的比值（ m/m），也指交联度。

2、分离胶缓冲液 pH8.8 配制 100mL(1.5M Tris-HCL pH8.8) ：Tris 18.15g，部分去离子水溶解，并用 HCL 调 pH8.8，最后定容至 100 mL，过 0.45 uM 膜， 4℃保存。

3、浓缩胶缓冲液pH6.8配制50mL(0.5M Tris-HCL pH6.8)：Tris 3.0g，部分去离子水溶解，并用 HCL 调 pH6.8，最后定容至 50 mL， 4℃保存。

4、 10%SDS： 5g/50 mL H2O，配制后4℃保存。

5、10%AP（过硫酸铵）：用时现配，溶解状态十分不稳定，0.1g/1mL H2O。.

6、电泳缓冲液：配1000 mL

Tris 3.0g，甘氨酸 14.4g， SDS1.0g，去离子水定容至1000 mL。

7、染色液：

（1）原液：配制200 mL：考马斯亮蓝（ R-250）：2.0g+200 mL 去离子水；

（2）染色液：配制 500 mL：原液 62.5mL，甲醇250mL ，冰乙酸50mL ，去离子水137.5mL 。

8、脱色液：1000 mL

甲醇 500 mL，冰乙酸 100 mL，去离子水定容至1000 mL。

9、 TEMED 原液

稳压： Stacking： 90V （ 20mA ）， Seperate： 120V （25mA ）。