7-1第七章 食品微生物检验-菌落总数测定
食品微生物检验方法
选择2~3个连续适宜稀释度 各取1mL分别加入灭菌平皿内
每个稀释度做两个平行
每皿内加入适量 12~15mL 平板计数琼脂 PCA ,
30±1 ℃ ,72 ±3 h
菌落计数
平板叠放不 超过6个
ISO4833-2003菌落计数方法
选择连续2个稀释度不超过300CFU的平板,且一个平板至 少含15CFU进行计数,计算公式如下：
食品微生物检验方法
内容提要
菌落总数检测 大肠菌群及大肠杆菌
检测 金黄色葡萄球菌检测 沙门氏菌检测 单核细胞增生李斯特
氏菌检测
菌落总数测定——菌落总数的概念
菌落总数是指在被检样品的单位重量 g 、容积 ml 或表面积 cm2 内,所含能于某种固体培养基 上,在一定条件下培养后所生成的菌落的总数，
每个样品从开始稀释到倾注最后一个平皿所用的时间不得超过 15min,主要为防止细菌增殖和产生片状菌落，样液与琼脂应充分 混合,避免将混合物溅到平皿壁和皿盖上，皿内琼脂凝固后,不要长 时间放置,然后倒置培养,可避免菌落蔓延生长，
检样过程中应用稀释剂做空白对照,用以判定稀释液、培养基、平 皿或吸管可能存在的污染，同时,检样过程中应在工作台上打开一 块空白平板计数琼脂,其暴露时间应与检样时间相当,以了解检样在 检验操作过程中有无受到来自空气的污染，
N=∑C/ n1+0.1*n2 *d 所有平板的菌落数都不足15CFU,计算2平板菌落的算术平
均值m,液体样品：NE=m 固体样品： NE=m×d-1
无菌生长：液体样品：less than 1; 固体样品：less than 1 ×d-1
最终结果保留前两位有效数字，
菌落总数测定几点说明
由于检样中采用30/35℃有氧条件下培养,因而并不是 样品中实际的总活菌数,一些特殊营养要求的细菌、厌 氧菌、微需氧菌、以及非嗜中温细菌,均难以反映出来，
常见微生物指标检测—菌落总数的测定(食品微生物检验技术课件)
36 3.6×103（cFu/mL）
（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2~3个适宜稀释度， 本次实验分别选取1：10；1：100；1：1000三个稀释液，以吸取该稀释度的吸 管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。 （ 5 ） 稀 释 液 移 入 平 皿 后 ， 应 及 时 将 凉 至 460C 营 养 琼 脂 培 养 基 注 入 平 皿 15ml~20mL，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml稀释 液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。 （6）等琼脂凝固后，翻转平板，置（36±1）0C恒温箱内培养（48±2）h取出， 计算平板内菌落数目乘以倍数，即得1g（1mL）样品所含菌落总数。
1、菌落总数检验程序
2、检样稀释及培养
（1）以无菌操作，将检样25mL放于含有225mL灭菌蒸馏水水的三角锥瓶 中，摇匀，做成1：10的均匀稀释液。 （2）另取1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭 菌水（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做 成1：100的稀释液。 （3）另取1ml的灭菌吸管，按上项操作顺序作10倍递增稀释液，如此每递 增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
3、菌落计算方法
（1）菌落计数方法 做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防
遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总 数。
（2）菌落计数的报告
酱油中细菌总数结果记录
稀释度 平板
10-1
1
2
10-2
12Biblioteka 10-312
菌落数 ＞300 ＞300
35 37
2
未检出
平均菌落数 细菌总数
食品微生物检验教案食品中真菌的检验（酵母菌和霉菌的检验）
第七章食品中真菌的检验（酵母菌和霉菌的检验）目的要求：掌握食品中霉菌、酵母菌总数的测定方法重点难点：菌落计数课时安排：2教学过程：一、检验程序检样→处理→稀释→平板分离培养→菌落计数→报告二、操作要点（一）采样1、粮食(包括粮库贮粮，粮店或家庭小量存粮)样品的采集，可根据粮囤或粮垛的大小和类型，分层定点取样，一般可分三层五点，或分层随机采取不同点的样品，充分混合后，取500g左右送检。
小量存粮可使用金属小勺采取上、中、下各部位的混合样品。
2、海运进口粮的采样：每一船仓采取表层、上层、中层及下层四个样品，每层从五点取样混合，如船仓盛粮超过10000t，则应加采一个样品。
必要时采取有疑问的样品送检。
3、谷物加工制品(包括熟饭、糕点、面包等)、发酵食品、乳及乳制品以及其他液体食品，用灭菌工具采集可疑霉变食品250g，装入灭菌容器内送检。
（二）样品处理（稀释）1、以无菌操作称取检样25g(或25mL)，放人含有225mL灭菌水的玻塞三角瓶中，振摇30min，即为1：10稀释液。
2、用灭菌吸管吸取1∶10稀释液10mL，注入试管中，另用带橡皮乳头的1mL灭菌吸管反复吹吸50次，使霉菌孢子充分散开。
3、取1mL1∶10稀释液注入含有9mL灭菌水的试管中，另换一支1mL灭菌吸管吹吸5次，此液为1∶100稀释液。
（三）培养倒置于25～28℃温箱中，3d后开始观察，共培养观察5d。
（四）、计数报告选取菌落数10～150之间的平板进行计数。
（稀释度选择和菌落报告方式参考菌落总数的测定）小结：主要介绍了食品中酵母菌和霉菌总数的测定方法思考题：列表说明霉菌、酵母菌数的测定与菌落总数的测定有什么相同的地方和不同的地方。
菌落总数的测定方法
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(二)、 菌落计数方法
• 做平板菌落计数时,可用肉眼观查,必要 时用放大镜检查,以防遗漏。在记下各平板 的菌落数后,求出同稀释度的各平板平均菌 落总数。
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2、菌落总数的快速测定方法
1. 适用范围用于各类食品及饮用水中菌落总数的测 定。
（3）从中间向周围轻轻推刮，使水分在圆圈内均 匀分布，并将气泡赶走。
（4）将加了样的检验纸片每6片叠放在仪器，放入 自封袋中，平放在37℃培养箱内培养15~24h。取 出纸片观察结果。
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(四)检验程序
• 菌落总数的检验程序如下
• ┌─────┐ │检样 │
└─────┘
↓
┌─────────────┐
│ 做成几个适当倍数的稀释液 │
└─────────────┘
↓
┌──────────────┐
│ 选择2～3个适宜稀释度
│
│ 各以1mL分别加入灭菌平皿内 │
└──────────────┘
我们计算出菌落数是培养基上 长出来的活的菌落数。
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（二）仪器设备
培养基箱，恒温水浴锅，天平，三角瓶，灭菌培 养皿，灭菌皿试管，玻璃珠，均质机，灭菌刀，镊 子;酒精灯。
（三）培养基和试剂
1.营养琼脂培养基：按GB 4789.28中4.7规定。 2.磷酸盐缓冲稀释液：按GB 4789.28中3.22规定。 3.生理盐水。 4.75%乙醇。
食品微生物学检验菌落总数测定
食品微生物学检验菌落总数测定一、定义菌落总数是指样品经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温度和时光、pH、需氧性质等)，所得1mL(g)检样中形成的微生物菌落总数。
菌落总数不等同于细菌总数，有两方面的缘由：一方面，每种细菌生长时对环境条件的要求都不太一样，如厌氧菌和嗜冷菌在菌落总数测定条件下难以生长繁殖，有特别养分要求的一些细菌也受到了限制，因此，所得的结果，只反映一群在一般养分琼脂中发育的、嗜温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。
另一方面，细菌细胞是以单个、成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在平板上浮现的菌落可能来源于单个细胞，也可能来源于细胞块。
二、卫生学意义菌落总数是食品卫生指标中的重要项目，主要作为判定食品被污染程度的标记。
通常认为，食品中菌落总数越多，被致病菌污染的可能性越大。
菌落总数的多少在一定程度上标记着食品卫生质量的优劣，但不能单凭菌落总数一项指标来评定食品卫生质量的优劣，必需协作大肠菌群和致病菌项目的检验，才干做出比较全面精确的评价。
三、检验办法根据GB4789.2-2016举行，标准规定了食品中菌落总数(aerobic plate count)的测定办法。
菌落总数的检验程序见图4-4。
图4-4菌落总数的检验程序四、注重事项 (1)要有“无菌操作”的概念。
所用玻璃器皿必需是彻低灭菌的，剪刀、镊子等器具要举行消毒处理，假如样品有包装，应用70%在包装开口处擦拭后取样，全部操作应该在超净工作台或经过消毒处理的无菌室中举行。
(2)应注重取样的代表性，液体样品取样前须先振摇，固体样品取样时宜多采几个部位，不要集中于一点。
(3)稀释液可选用灭菌生理盐水、蒸馏水或蛋白胨水(1g/L)，蛋白胨水最为合适，由于蛋白胨水对细菌细胞有更好的庇护作用。
假如对含盐量较高的样品举行稀释，则宜采纳蒸馏水。
(4)在做10倍递增稀释时，吸管或吸头插入样品匀液内不能低于液面2.5cm，以防吸管或吸头从稀释液内取出时有过多的液体黏附于管外。
食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项
食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项介绍如下：
在食品微生物检验中，菌落总数测定是非常重要的一项。
以下是菌落总数测定的注意事项：
1.样品的制备要求：样品制备应该遵循相应的样品处理方法，保证样品的代表性和可
检出性。
2.培养基的选择：选择适当的培养基，要求菌落总数检测的准确性和有效性。
3.培养条件：菌落总数的测定需要适宜的培养条件，包括适宜的温度、湿度、通气等。
4.培养时间：菌落总数的测定需要适宜的培养时间，过短或过长都可能影响检测结果
的准确性。
5.培养基的存放条件：培养基的存放条件应符合要求，以保证培养基的质量和菌落的
生长。
6.检测设备的清洁与消毒：仪器和设备应经常清洁和消毒，以防止交叉污染。
7.操作人员的卫生要求：操作人员应穿戴干净的工作服，戴手套，避免污染样品或检
测设备。
总之，菌落总数测定的注意事项主要涉及样品制备、培养基选择、培养条件、培养时间、培养基的存放条件、检测设备的清洁与消毒、操作人员的卫生要求等方面。
只有严格遵守相关的要求和规定，才能得到准确可靠的检测结果。
探究食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项
探究食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项1.样品密闭保存在取样过程中，要尽量避免空气等外界因素的影响，样品必须密闭保存。
一般样品应当在到达实验室后尽快进行检验，以免样品受外界影响导致结果不准确。
如果无法及时检验，则可以将样品冷藏或者冷冻，但是也需要注意将样品密封好，以避免外界细菌的污染。
2.采样量的重视采样量对于总菌落数的测定是非常重要的。
一般情况下，菌落总数的测定一般要求采样量在1-5g之间，但是如果样品比较稀疏，则需要增加采样量，以确保菌落总数的准确性。
另外，在进行样品采集的时候，需要使用无菌工具，并且避免手部与样品接触，以免造成样品的污染。
3.温度和时间的掌控细菌的生长繁殖受到温度和时间的影响，针对食品微生物检验中菌落总数测定，也需要掌控恰当的温度和时间，以获得准确可靠的结果。
通常情况下，菌落总数的测定需要在30°C ± 1°C的温度下进行，持续48个小时，如果菌落总数比较高，则可以适当延长测定时间，但是通常测定时间不应当超过48小时。
4.选择合适的培养基依据不同的食品种类和样品的特性，需要选择合适的培养基，以保证菌落总数的测定准确可靠。
在选择培养基的时候，需要考虑菌落总数测定的灵敏度和特异性，并且需要注意培养基的配制和保存条件，以避免培养基失效。
5.样品的处理和消毒在进行食品微生物检验中，样品的处理和消毒是非常重要的，以避免外界因素的干扰。
通常情况下，需要用适当的方法对样品进行消毒和处理，并确保采样和样品处理的全过程无菌操作。
如样品含有硬壳，应先将其表面用肥皂水清洗干净，并用70%的酒精或经消毒的火柴棒或火烤器在表面进行消毒。
如果样品是炊后食品，可用蒸汽或高压杀菌，使其达到消毒的效果。
如果样品含有高浓度的盐、糖或醋等食品添加剂，需要在消毒前进行浓度调整，以确保检验的准确性。
总之，食品微生物检验中菌落总数的测定需要全过程无菌操作，以确保样品不受外界因素的影响，并且需要在采样、培养基选择、样品处理和等方面注意细节，以保证检验结果的准确、可靠、科学和客观。
食品微生物检测：菌落总数测定标准要点解析
食品微生物检测：菌落总数测定标准要点解析一、称样（1）一般称量25g，由于称样量较大，标准中对于称样的准确性未作出明确规定，微生物室常用称样的电子天平最大允许误差为±0.1g，一般遵循“宜多不宜少”的原则，即实际称样时可根据样品情况称取超出25g（如硬质糖果等，检验人员应依据样品实际情况决定如何称样）；（2）对于部分食品添加剂已明确须称取1.0g的，则须严格精确称量。
二、样品稀释（1）固体或半固体：称取25g样品于均质袋中，加入已灭菌的生理盐水225g，稍捏碎（特别是糕点/面包及其他淀粉制品），放入拍击式均质器均质1min，此时即制备成1：10的样品匀液。
以移液器或灭菌吸取该液体至9mL灭菌生理盐水试管中，换上新的灭菌移液器枪头，缓缓吸取液体后反复吹打2次，此时即制备成1：100的匀液，以此类推，制备10倍系列稀释匀液。
（2）液体样品：直接吸取原液进行检验，稀释时可直接吸取1mL原液到9mL灭菌生理盐水试管中按照“固体或半固体”的方式稀释。
三、稀释度的选取液体样品可直接取原液进行检验；固体或半固体则必须依据检验经验，选取2-3个适宜稀释度进行检验（一般样品选取1：10，1：100，1：1000三个稀释度进行检验。
若遇到不常做的样品，可适当延长稀释度至1：100000甚至1：1000000）。
四、质量控制空白对照：分别吸取1mL灭菌生理盐水到平皿中做空白对照。
（若空白有菌落生长则该实验无效）。
五、平板计数琼脂（PCA）灭菌条件为121℃、15min。
一般情况下于500mL敞口锥形瓶（三角瓶）中配制400mL/瓶。
六、有时样品基质比较特殊，样品匀液有细小的颗粒与菌落不易区分，此时可采用如下方法进行区分：（1）配制1%的2,3,5-三苯基氯化四氮唑溶液（又称红四唑或红四氮唑，简称TTC），高压灭菌后避光冷藏备用。
红四唑灭菌条件为：121℃、20min；（2）待PCA琼脂培养基冷却至适宜倾注温度时，无菌加入上述TTC溶液2mL，充分摇匀（此时PCA中TTC浓度为0.005%）。
食品微生物检验方法(ISOFDA)
在生理盐水中自凝；
大肠菌群及大肠杆菌测定 ——MPN法检验流程（FDA BAM）
检样50g+450ml稀释液
适当十倍稀释样品
选择3个适宜的连续稀释度的样品稀释液， 每个稀释度接种三管LST肉汤（每管9mlLST肉汤并加有导管），
每管接种1mL 35℃ ，24 ± 2h ~48 ± 2h
检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌菌落发生混淆，可 作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4 ℃ 放置，以便在计数检样时用作对照。
大肠菌群的定义
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼 性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。
大肠菌群不是细菌学上的分类命名，而是根据卫生学 方面的要求，提出的与粪便污染有关的细菌，即作为 食品、水体等是否受过人畜粪便污染的指示菌，这些 细菌在生化及血清学方面并非完全一致。根据进一步 的生化试验，可将这群细菌再分为大肠艾希氏菌（俗 称大肠杆菌）、弗氏柠檬酸杆菌、肺炎克雷伯氏菌和 阴沟肠杆菌等。
大肠杆菌的定义
大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科， 归属于埃希氏菌属。
大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产 气、IMViC试验（靛基质、MR、V-P、柠檬酸盐试验 ）为++--或-+--的细菌。
与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括 五种：肠毒素性大肠杆菌（ETEC）、致病性大肠杆菌 （EPEC）、出血性大肠杆菌（EHEC）、侵袭性大肠 杆菌（EIEC）、黏附性大肠杆菌（EAEC）。
食品微生物检验方法 (ISOFDA)
内容提要
菌落总数检测 大肠菌群及大肠杆菌
检测 金黄色葡萄球菌检测 沙门氏菌检测 单核细胞增生李斯特
食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项
Apr. 2020 CHINA FOOD SAFETY 121分析与检测1 检验前的准备事项1.1 器皿灭菌处理为了保证测定结果的精确性，应当对检验所用的各类器皿、设备（如吸管、移液器等）做严格的消毒处理，避免这些器皿、设备携带细菌、微生物而影响检验结果。
另外，检验人员进入实验室前，应当换上经过严格消毒的防护服，戴上无菌口罩等，排除外界干扰因素[1]。
1.2 材料准备待检测的食品种类多样，有的是固体，还有的是液体；在固体中有的是溶于水的，还有的是不溶于水的。
为了方便检验，需要对这些样品材料提前做好准备。
例如将固体食品研磨成粉，提高其溶解性，避免菌落堆积，使菌落总数测定结果更加精确。
对于一些液体样品，还要检验其pH 值，如果pH 值明显偏酸性或偏碱性，也有可能会导致菌落难以在培养基上存活。
针对这种情况，检验人员应提前调节样品溶液的pH 值，使其尽量保持中性，为下一步的菌落培养与微生物检验提供良好的条件[2]。
2 制备稀释液的注意事项在制备稀释液之前，首先要准备好25 mL 的样品以及225 mL 经过灭菌处理的稀释液，将这两者进行混合并且搅拌均匀。
而后结合样品受污染程度以及食品卫生标准，来判断选择何种稀释度，并且围绕这一稀释度进行连续的递增稀释，其递增的幅度为10倍，在稀释时，为了保证稀释倍数的准确性，使用1 mL 的灭菌吸管进行稀释。
3 平板接种与培养的注意事项3.1 注入稀释液选取一个带盖的平底器皿，将制备好的稀释液注入到器皿中。
注意不要将器皿的盖子完全打开，而是打开一个小口。
先使用量筒，量取2 mL 稀释液，然后使用吸管吸取量筒内的稀释液，将吸管的一端从缺口处插入，约1 cm，让稀释液从缺口位置沿着器皿侧壁流下[3]。
3.2 加热琼脂块琼脂块是制作培养基的主要材料，需要将固体琼脂块加热融化。
高温会破坏琼脂块的营养，因此加热时应当选择50 ℃的水浴，保证温度适宜。
升温过程要缓慢，温度升高的过快会造成水汽凝结，这些冷凝水滴入培养基上，会加速细菌的繁殖。
微生物菌落总数的测定—菌落总数的计数方法
混合均匀。
•
6、 待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温
箱内培养48±2h，水产品30±1℃温箱内培养72±3h。
•
如样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生
长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼
脂培养基（约4毫升），凝固后培养。
• （二） 菌落记录方法 做平板菌落数记录时，可用肉眼观察，必要
菌落总数的测定
三 、 材料
1、 食品检样 2、 培养基 平板计数培养基，无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液 3、 其它 无菌培养皿，无菌吸管，电炉、恒温培养箱等。
四、 流程
• 1、检样 • 2、做几个适当倍数的稀释液 • 3、选择2~3个适宜稀释度各1 mL,分别加入
灭菌平皿内 • 4、平皿内倾注15～20 mL琼脂培养基，混匀 • 5、36 ±1℃培养48±2小时或（24±2）小时 • 6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量 • 7、 计算菌落总数 → 报告
10-4
3.1x106
• 2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜
计数范围内时，应以两者比值决定。若其比值小 于2，应报告两者的平均数；若大于等于2，则报 告稀释度较小的菌落数。
试样 稀释度
例次 10-2
10-3
1
380
52
平
2 均 526
205
菌
3 落 271
60
数
4
284
152
菌量
10-4 选定计数稀释度 /(个/g 或mL)
菌量
10-4 选定计数稀释度 /(个/g 或mL)
18
10-3
5.2x104
32
10-3，10-4
2.6x105
12
食品中菌落总数的测定
食品中菌落总数的测定(一)菌落总数与食品卫生质量食品中菌落总数的测定,目的在下了解食品在生产过程中,从原料加工到成品包装受外界污染的情况;也可以应用这一方法观察在食品中繁殖的动态,确定食品的保存期,以便对被检样品进行卫生学评价提供依据.食品有可能被多种类群的微生物所污染,每种细菌都有它一定的生理特性,培养里应用不同的营养条件及其生理条件(如温度、培养时间、ph值、需氧性质等)去满足其要求, 才能分别将各种细菌培养出来。
但在实际工作中, 一般都只用一种常用的方法去作菌落总数的测定, 所得结果, 只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌落数.国家标准所规定的菌落总数(Aerobic bacterialcount)就是指食品工业检样经过处理,在一定条件下培养后,所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数.食品中菌落的总数的多少,直接反映着食品的卫生质量.如果食品中菌落总数多于10万个,就足以引起细菌食物中毒;如果人的感官能察觉食品因细菌的繁殖而性变质时,细菌数大约已达到106~107个/g(或ml或cm2)。
食品的变质反映与菌落总数的增多有一定联系, 但有时食品中细菌含量很高, 即使已达到相当于同种食品已变质时的细菌数, 而食品并未有任何变质现象, 这种情况也是经常会遇到的。
有时食品遭受污染的程度不同特别严重严重, 食品中虽含有大量的细菌, 由于时间短暂或细菌系列条件不具备, 就见不到变质现象。
例如: 细菌难以生长的一些干制食品和冰冻食品, 它们含有细菌的多少, 就可以用表明这些食品在生产、运输、贮藏等过程中卫生管理的状况。
从食品卫生观点来看, 食品中菌落总数越多, 说明了食品质量越差, 也就应考虑到病原菌污染的可能性愈大；当菌落总数仅少量存在时, 则病原菌污染环境的可能性性就会降低, 或者几乎不存在。
但也有少数情况并不完全如此, 有人曾报道, 从市售的一批冰蛋制品中, 在所检出的菌落总数在5000个/g以下样品, 和其中仅含菌落总数380个/g的样品中, 均可分离出沙门氏菌, 并且都有大肠菌群存在。
微生物 菌落总数 测定详细讲解
菌落总数测定详细讲解一、茵落总数的概念和测定意义菌落(colony)是指细菌在固体培养基上发育而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。
菌落总数是指在被检样品的单位重量(g)、容积(m1)或表面积(clni)内，、所含能于某种周体培养基上，在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。
菌落总数主要是作为判定食品被细菌污染程度的标记，也可以应用这一方法观察食一中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态．以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据．二、茵落总数测定的几项说明1．菌落总数的测定。
是以检样中的细菌细胞和营养琼脂混合后，每个细菌细胞都能形成一个可见的单独菌落的假定为基础的。
由于检验中采用37℃于有氧条件下培养(空气中含氧约20％)，因而并不能测出每g或ml检样中实际的总活菌数，厌氧菌、微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制，因此所得结果，只包括一群能在普通营养琼脂中发育、嗜中温的、需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。
2．鉴于食品检样中的细菌细胞是以单个，成双、链状、葡萄状或成堆的形式存在，因而在营养琼脂平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可以来源于单个细胞，因此平板上所得需氧和兼性厌氧菌菌落的数字不应报告活菌数，而应以单位重量、容量或表面积内的菌落数或菌落形成单位数(colony forming units，CFU)报告之。
3．每种细菌都有它一定的生理特性，培养时，应用不同的营养条件及其他生理条件(如温度、培养时间、PH、需氧性质等)去满足其要求，才能分别将各种细菌都培养出来。
因此，要得到较全面的细菌菌落总数，应将检样接种到几种不同的非选择性培养基上，并培养在不同条件下，如温度，氧气供应等。
但国家颁发的食品卫生标准对不同食品的菌落总数的规定，都是根据用普通营养琼脂进行需氧培养所得的结果确定的，因此在食品的一般卫生学评价中并不要用几种不同的非选择性培养基培养。
食品中细菌菌落总数的测定
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试样 例次
稀释度
10-2
10-3
1
380
52
平
2 均 526
205
菌
3 落 271
60
数
4
284
152
菌量
10-4 选定计数稀释度 /(个/g 或mL)
18
10-3
5.2x104
32 10-3，10-4 （1.56） 2.6x105
12
10-2
（2.2） 2.7x104
37
10-2，10-3
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2、采样的代表性
如系固体样品，取样时不应集中一 点，宜多采几个部位。固体样品必须经 过均质或研磨，液体样品须经过振摇， 以获得均匀稀释液。
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3、稀释液
样品稀释液主要是灭菌生理盐水，或 磷酸盐缓冲液（或0.1％蛋白胨水），后 者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保 护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油） 进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。
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2、若有两个连续稀释度的平板菌落数在
适宜计数范围内时，应以两者比值决定。 若其比值小于2，应报告两者的平均数； 若大于等于2，则报告稀释度较小的菌落 数。
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试样 稀释度
菌落总数的测定 (GB 4789.2—2010)
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一、 目的
1、 学习并掌握食品中菌落总数测定方 法和原理。 2 、了解菌落总数测定在对被样品进行 卫生学评价中的意义 。
食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项
在 无 菌 条 件 下 进 行 操 作， 取 适 量 样品于经过杀菌的玻璃瓶中，剪碎， 振 荡 均 匀 后， 得 到 1/10 的 溶 液。 像 鱼、肉等固体样品，一般会对样品剪 碎、稀释后，用均质器再高转速下进 行处理，时间持续 1 min，最终也得到 1/10 的样品。在实际检测中，需要配 制逐渐递增 10 倍的稀释样品。每次稀 释时都要更换灭菌管，而且经过灭菌 的吸管不能与其他吸管相接触。为了 防止带入污染物，也不能触碰到装有
4 菌落计数
一 旦 培 养 时 间 达 到 要 求， 应 立 即 进行计数。如果此时不方便计数，可 以先将其放置在 5℃以下的环境中放置 24 h。对相同和不同稀释度的平皿分
别进行观察，记录每种菌落的生长状 态。一般情况下，两个平行实验具有 相似的菌落数。对于不同稀释度的被 检样品，稀释倍数越大则菌落数越少， 也就是说成反比例的关系。如果观察 到稀释度较高的样品中菌落数也很高， 则说明检测的过程出现了错误。
稀释液容器口的外侧；应该缓慢地加 入被检样品稀释液，避免稀释液被污 染；应该采用最小刻度在 0.1mL 以下 的吸管来取 1mL 的样品。
3 平板接种培养
在一定的器皿中，吸取 1mL 稀释 液加入样品中，配得 10 倍递增的稀释 液，在这个过程中要确保采用同样的 吸管，之后使吸管垂直以便稀释液完 全滴入。要提前加热融化器皿上的琼 脂，在 45 ℃的恒温水浴中保温，备用。 温度过低，则造成琼脂二次凝固，温度 过高，将会影响细菌的正常生长。器皿 的最佳侵入量应在 15mL 左右，要舍 掉带有沉淀的琼脂，以便于正常观察。
5 结论
民 以 食 为 天， 食 品 的 安 全 性 直 接 关系到人们的身体健康。如今，食品 检测技术迅猛发展，人们对检测的精 准度提出了更高的要求。检测人员应 采取谨慎的措施和认真的态度对菌落 总数进行检测，确保操作的精细化和 规范化，争取每个步骤零失误。实验 数据具有一定的可靠性，才能使检测 结果更有参考价值。 参考文献
食品微生物学检验 菌落总数测定
食品微生物学检验菌落总数测定1 范围本标准规定了食品中菌落总数（Aerobic plate count ）的测定方法。
本标准适用于食品中菌落总数的测定。
2 术语和定义2.1 菌落总数aerobic plate count 食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL ）检样中形成的微生物菌落总数。
3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。
3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
3.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。
3.4 天平：感量为0.1 g。
3.5 均质器。
3.6 振荡器。
3.7 无菌吸管：1 mL （具0.01 mL 刻度）、10 mL （具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
3.8 无菌锥形瓶：容量250 mL、500 mL。
3.9 无菌培养皿：直径90 mm。
3.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
3.11 放大镜或/和菌落计数器。
4 培养基和试剂4.1 平板计数琼脂培养基：见附录A 中A.1 。
4.2 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.2 。
4.3 无菌生理盐水：见附录A 中A.3 。
5 检验程序菌落总数的检验程序见图图1 菌落总数的检验程序6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。
食品中细菌菌落总数的测定
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（四） 菌落计数报告方法
1、菌落数在1～100时，按四舍五入报 告两位有效数字。
2、菌落数≥ 100时，第三位数字按四舍 五入计算，取前面两位有效数字，为了缩 短数字后面的零数，也可以10的指数表示。
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3、若所有平板上为蔓延菌落而无法计 数，则报告菌落蔓延。 4、 若空白对照上有菌落生长，则此次检 测结果无效。
同时分别取1ml稀释液（不含样品） 加入两个灭菌平皿内作空白对照。
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5 、稀释液移入平皿后，将冷却至 46℃琼脂培养基注入平皿约15～20ml， 并转动平皿，混合均匀。
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6、 待琼脂凝固后，翻转平板，置 36±1℃温箱内培养48±2h，水产品 30±1℃温箱内培养72±3h。
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2、若有个连续稀释度的平板菌落数在
适宜计数范围内时，应以两者比值决定。 若其比值小于2，应报告两者的平均数； 若大于等于2，则报告稀释度较小的菌落 数。
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三、食品卫生微生物检验
主要内容：
1.一般卫生状况指标菌检验：
细菌菌落总数、霉菌和酵母菌
2.粪便污染指标菌检验 ：
大肠菌群、粪大肠菌群
3.致病菌检验：
沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性 弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、蜡样芽胞杆 菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、肉毒梭菌 及肉毒毒素、产气荚膜梭菌、单核细胞增生李斯特氏 菌、变形杆菌等。
2、指示微生物的类型 1） 一般卫生状况指示微生物
最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌总数。 意义：评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性。 2） 粪便污染指示微生物
主要指大肠菌群，其他还有肠球菌、产气荚膜梭菌、噬菌体以 及脊髓灰质炎病毒等。 意义：标志着检品受过人、禽畜粪便的污染，同时也可表明有肠 道致病菌存在的可能。
稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别 在做10倍递增稀释的同时，吸取1.0 mL样品匀液于
无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取 1mL稀释液加入两个无菌平皿作空白对照。 1.6 样品匀液移入平皿后，应及时将凉至46℃平板 计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中 保温)注入平皿约15mL～20mL，并转动平皿使混合 均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入加有1.0 mL 空白稀释液的无菌平皿内作对照。
• 样品对照：加1mL样品稀释液，平皿注入平板计 数琼脂培养基，凝固后放冰箱，以区别样品中的 杂质
• 无菌操作对照：打开平板计数琼脂培养基平皿， 并在空气中暴露30min，反应空气质量和操作技术。
3）食品腐败与食品成分及微生物的关系
（1）食品腐败变质是以食品本身的组成和性质为基础，在环境 因素的影响下，主要由微生物的作用所引起的。是微生物、
环境因素和食物本身三方面相互影响和综合作用的结果。
（2） 成分不同，引起食品变质的微生物种类也可能不同： A.霉菌对蛋白质/脂肪/糖类的分解能力均强；
B.少数细菌能分解蛋白质/脂肪，多数能分解单双糖,少数能分解 多糖； C.酵母除多数能利用单双糖外，其他均弱； 根据食品的成分可以推测引起食品变质的主要微生物类群。
3）食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能 性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有 致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检 验，才能对食品做出较全面的评价。
二、食品微生物学检验 菌落总数测定
(GB 4789.2—2016)
（一）方法原理
每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同 的培养条件（如培养温度、培养时间、pH、需氧性质 等）满足其要求，才能分别将各种细菌培养出来。但 在实际工作中，细菌菌落总数的测定一般都只用一种 常用的方法去做，即国际标准规定的平板计数法，标 准检验方法多用倾注培养法。倾注法所得结果只包括 一群能在平板计数琼脂培养基（PCA） 上生长的嗜中 温需氧菌的菌落总数，并不表示样品中实际存在的所 有细菌菌落总数。
固
体
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样
品
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1
吹吸50次， 1mL
10-
2
吹吸5次， 1mL
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3
吹吸5 次，
1mL
1mL
灭 菌 生 理 水
25g+225m L灭菌生理水
10-1
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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提示：样品加入稀释液管后，要先吹吸， 后取1mL样液加入培养皿。
1.5 根据对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜
4.检测与检验
• 检测（test） 对给定的产品、材料、设备、生物体、物理现象、工
艺过程或服务，按规定程序确定一种或多种特性或性能的 技术操作。
从定义可以看出，“检测”仅是一种技术操作，它只 需要按规定程序的操作并提供所测结果。不需要给出所测 数据合格与否的判定。
• 检验（inspection） 对实体的一个或多个特性进行诸如测量、检查、试验
第七章 食品微生物检验
第一节食品微生物
生境： 指生物的个体、种群或群落生活地域的环境， 包括必需的生存条件和其他对生物起作用的生态因素。 生境是指生态学中环境的概念，生境又称栖息地。生境 是由生物和非生物因子综合形成的，而描述一个生物群 落的生境时通常只包括非生物的环境。 一、食品生境特征 • 丰富的营养物质 ：碳源、氮源、无机盐及维生素； • 基质条件：水、pH、渗透压； • 天然防御结构/抑菌物质：
e.生产环境与食品用具 。
2）继发性污染/二次污染:加工、运输、储存中污染
2、 食品腐败变质/变败
1）食品腐败变质/变败（food spoilage）
• 食品腐败变质，是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有 化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价 值的过程。如鱼肉的腐臭、油脂的酸败、水果蔬菜的腐烂和粮食 的霉变等。
3） 致病菌（控制菌）
食品、化妆品或药品等样品中规定一些不得检出的致 病菌，包括某些特定环境不能检出的菌类
例如 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、 致泻 大肠埃希氏菌 、铜绿假单胞菌 、溶血性链球菌 、 产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌 副溶血性弧菌、小肠 结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、肉毒梭菌、破伤风 芽胞杆菌 等 。
3、食品微生物种类
引起食品变败的常见细菌 假单胞菌属 黄杆菌属 产碱杆菌属 芽胞杆菌属 梭状芽胞杆菌
引起食品变败的常见霉菌 – 青霉 – 曲霉 – 镰刀菌 – 根霉 – 毛霉
2020/3/3
4、食源性疾病(food-borne disease)
WHO定义——由于摄入食物中带有的各种致病因子而 引起的感染性或中毒性疾病。
•食物是传播疾病的媒介，食物中的致病因子可分为 生物性、化学性、物理性三类。 •生物性致病因子
细菌及其毒素：包括食物中毒病原菌、肠道传染病 病原菌和人畜共患病病原菌； 霉菌及其毒素：如黄曲霉毒素、镰刀菌毒素等； 病毒：如甲肝病毒； 寄生虫及虫卵： 蛔虫、绦虫、旋毛虫等。
2020/3/3
第二节 卫生指示微生物
• 通常是细菌在固体培养基上（内） 生长发育，形成以母细胞为中心 的一团肉眼可见的、有一定形态、 构造等特征的子细胞的集团，称 之为菌落。
2、菌落总数的定义：
食品微生物学检验 菌落总数的测定 (GB 4789.2—2016)
是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培 养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样 中形成的微生物菌落总数。以 菌落形成单位 （colony forming units，CFU） CFU/g（mL）来表示。
2） 食品腐败变质/变败的原因
• 食品中含有蛋白质，脂肪，碳水化合物，这些成份是微生物的生 长基质，所以微生物在食品中能够生长繁殖。环境中无处不存在 微生物，食物在生产、加工、运输、储存、销售过程中，很容易 被微生物污染。只要温度适宜，微生物就会生长繁殖，分解食物 中的营养素。这时食物中的蛋白质就被破坏了，食物会发出臭味 和酸味，颜色也会发生变化从而造成食品变质。
1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液 1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试管中 （注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品 匀液。
1.4 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操 作顺序，做10倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次， 即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。
鸡蛋：壳胶膜-蛋壳-壳膜-蛋白-蛋黄； • 贮存条件/环境条件：温度、气体。
二、食品中微生物来源和种类
食品中微生物主要来自：
土壤
水
空气
人体活动
1、食品微生物来源及污染途径
1）原料污染/原发性污染/一次污染
a.土壤：土壤是微生物的天然培养基，它具备微生物正常发育 所必须的一切条件。含有大量的微生物，细菌来自天然生活 在土壤中的自养菌和腐物寄生菌以及随动物排泄物及其尸体 进入土壤的细菌；
菌落总数测定操作流程
（四）操作步骤
1.样品的稀释 1.1 固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，放入于装有22
5 mL磷酸盐缓冲稀释液或0.85％生理盐水的无菌均质杯内，于80 00r/min～10000 r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或 放入于225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1mi n～2min制成1:10的样品匀液。 1.2 液体样品：以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL磷酸盐缓 冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻 璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下， 36±1℃培养 48±2 h，水产品 30±1℃培养 72h±3h。能在平板计 数琼脂培养基（PCA）上生长发育的细菌菌落总数。所 以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温 的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以 繁殖生长
3、细菌总数
指一定数量或面积的食品样品．经过适当的 处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。 其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。 细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1 g 或1 mL样品中的细菌总数来表示。
• 在培养皿上编号
提示：培养皿上的标记为稀释倍数。
固体样品：稀释倍数为10-1、10-2、10-3
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-2
-2
-3
-3
空白
空白
0
0
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对照
• 空白对照：不加样品，只在平皿注入平板计数琼 脂培养基，反应培养基中的杂质及污染情况
• 稀释液对照：加1mL无菌稀释液，平皿注入平板 计数琼脂培养基，反映稀释液是否受到污染