7-1第七章 食品微生物检验-菌落总数测定

（二）设备和 材料
1、 食品检样 2、 培养基 ：平板计数琼脂培养基，无菌生理盐水
或磷酸盐缓冲液 。 3、 其它 ：无菌培养皿，无菌吸管（1ml，10ml），
量筒，烧杯，酒精灯，天平，电炉，恒温培养箱 等。
PCA与NA
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（三）检验程序
1、检样； 2、做几个适当倍数的稀释液； 3、选择2~3个适宜稀释度各1mL,分别加入灭菌平皿内； 4、平皿内倾注15～20mL平板计数琼脂培养基，混匀 ； 5、36±1℃培养48±2小时或30±1℃培养72h±3h ； 6、记录稀释倍数和相应的各平板菌落数量； 7、 计算菌落总数→报告；
•食物是传播疾病的媒介，食物中的致病因子可分为 生物性、化学性、物理性三类。 •生物性致病因子
细菌及其毒素：包括食物中毒病原菌、肠道传染病 病原菌和人畜共患病病原菌； 霉菌及其毒素：如黄曲霉毒素、镰刀菌毒素等； 病毒：如甲肝病毒； 寄生虫及虫卵： 蛔虫、绦虫、旋毛虫等。
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第二节 卫生指示微生物
4、菌落总数测定的卫生学意义
1）菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区 分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生 长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数， 所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等；
2）菌落总数主要作为判别食品被污染程度的标志，也可 以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便 对被检样品进行卫生学评价时提供依据；
3、食品微生物种类
引起食品变败的常见细菌 假单胞菌属 黄杆菌属 产碱杆菌属 芽胞杆菌属 梭状芽胞杆菌
引起食品变败的常见霉菌 – 青霉 – 曲霉 – 镰刀菌 – 根霉 – 毛霉
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4、食源性疾病(food-borne disease)
WHO定义——由于摄入食物中带有的各种致病因子而 引起的感染性或中毒性疾病。
• 样品对照：加1mL样品稀释液，平皿注入平板计 数琼脂培养基，凝固后放冰箱，以区别样品中的 杂质
• 无菌操作对照：打开平板计数琼脂培养基平皿， 并在空气中暴露30min，反应空气质量和操作技术。
意义：这些指示菌，在不同的样品中有不同的指示意 义。
三、食品卫生微生物检验
主要内容：
1.一般卫生状况指标菌检验：
细菌菌落总数、霉菌和酵母菌
2.粪便污染指标菌检验 ：
大肠菌群、粪大肠菌群
3.致病菌检验：
沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性 弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、蜡样芽胞杆 菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、肉毒梭菌 及肉毒毒素、产气荚膜梭菌、单核细胞增生李斯特氏 菌、变形杆菌等。
2） 食品腐败变质/变败的原因
• 食品中含有蛋白质，脂肪，碳水化合物，这些成份是微生物的生 长基质，所以微生物在食品中能够生长繁殖。环境中无处不存在 微生物，食物在生产、加工、运输、储存、销售过程中，很容易 被微生物污染。只要温度适宜，微生物就会生长繁殖，分解食物 中的营养素。这时食物中的蛋白质就被破坏了，食物会发出臭味 和酸味，颜色也会发生变化从而造成食品变质。
e.生产环境与食品用具 。
2）继发性污染/二次污染:加工、运输、储存中污染
2、 食品腐败变质/变败
1）食品腐败变质/变败（food spoilage）
• 食品腐败变质，是指食品受到各种内外因素的影响，造成其原有 化学性质或物理性质发生变化，降低或失去其营养价值和商品价 值的过程。如鱼肉的腐臭、油脂的酸败、水果蔬菜的腐烂和粮食 的霉变等。
4.检测与检验
• 检测（test） 对给定的产品、材料、设备、生物体、物理现象、工
艺过程或服务，按规定程序确定一种或多种特性或性能的 技术操作。
从定义可以看出，“检测”仅是一种技术操作，它只 需要按规定程序的操作并提供所测结果。不需要给出所测 数据合格与否的判定。
• 检验（inspection） 对实体的一个或多个特性进行诸如测量、检查、试验
和度量，并将其结果与规定的要求进行比较，以确定每项 特性的合格情况所进行的活动。
从定义可以看出，“检验”不仅提供数据，还须对规 定要求进行比较后，作出合格与否的判定。
第三节食品微生物学检验 菌落总数测定
一、菌落总数
1、菌落的定义：
• 菌落（colony）是由单个细菌 （或其他微生物）细胞或一堆同 种细胞在适宜固体培养基表面或 内部生长繁殖到一定程度，形成 肉眼可见的子细胞群落。
3）食品腐败与食品成分及微生物的关系
（1）食品腐败变质是以食品本身的组成和性质为基础，在环境 因素的影响下，主要由微生物的作用所引起的。是微生物、
环境因素和食物本身三方面相互影响和综合作用的结果。
（2） 成分不同，引起食品变质的微生物种类也可能不同： A.霉菌对蛋白质/脂肪/糖类的分解能力均强；
B.少数细菌能分解蛋白质/脂肪，多数能分解单双糖,少数能分解 多糖； C.酵母除多数能利用单双糖外，其他均弱； 根据食品的成分可以推测引起食品变质的主要微生物类群。
• 在培养皿上编号
提示：培养皿上的标记为稀释倍数。
固体样品：稀释倍数为10-1、10-2、10-3
-1
-1
-2
-2
-3
-3
空白
空白
0
0
-1
对照
• 空白对照：不加样品，只在平皿注入平板计数琼 脂培养基，反应培养基中的杂质及污染情况
• 稀释液对照：加1mL无菌稀释液，平皿注入平板 计数琼脂培养基，反映稀释液是否受到污染
鸡蛋：壳胶膜-蛋壳-壳膜-蛋白-蛋黄； • 贮存条件/环境条件：温度、气体。
二、食品中微生物来源和种类
食品中微生物主要来自：
土壤
水
空气
人体活动
1、食品微生物来源及污染途径
1）原料污染/原发性污染/一次污染
a.土壤：土壤是微生物的天然培养基，它具备微生物正常发育 所必须的一切条件。含有大量的微生物，细菌来自天然生活 在土壤中的自养菌和腐物寄生菌以及随动物排泄物及其尸体 进入土壤的细菌；
3） 致病菌（控制菌）
食品、化妆品或药品等样品中规定一些不得检出的致 病菌，包括某些特定环境不能检出的菌类
例如 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、 致泻 大肠埃希氏菌 、铜绿假单胞菌 、溶血性链球菌 、 产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌 副溶血性弧菌、小肠 结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、肉毒梭菌、破伤风 芽胞杆菌 等 。
2、指示微生物的类型 1） 一般卫生状况指示微生物
最常用的是菌落总数、霉菌和酵母菌总数。 意义：评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性。 2） 粪便污染指示微生物
主要指大肠菌群，其他还有肠球菌、产气荚膜梭菌、噬菌体以 及脊髓灰质炎病毒等。 意义：标志着检品受过人、禽畜粪便的污染，同时也可表明有肠 道致病菌存在的可能。
菌落总数测定操作流程
（四）操作步骤
1.样品的稀释 1.1 固体和半固体食品：以无菌操作称取25g样品，放入于装有22
5 mL磷酸盐缓冲稀释液或0.85％生理盐水的无菌均质杯内，于80 00r/min～10000 r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或 放入于225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1mi n～2min制成1:10的样品匀液。 1.2 液体样品：以无菌吸管吸取样品25mL放入装有225mL磷酸盐缓 冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻 璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
3）食品中细菌菌落总数越多，则食品含有致病菌的可能 性越大，食品质量越差；菌落总数越小，则食品含有 致病菌的可能性越小。须配合大肠菌群和致病菌的检 验，才能对食品做出较全面的评价。
二、食品微生物学检验 菌落总数测定
(GB 4789.2—2016)
（一）方法原理
每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同 的培养条件（如培养温度、培养时间、pH、需氧性质 等）满足其要求，才能分别将各种细菌培养出来。但 在实际工作中，细菌菌落总数的测定一般都只用一种 常用的方法去做，即国际标准规定的平板计数法，标 准检验方法多用倾注培养法。倾注法所得结果只包括 一群能在平板计数琼脂培养基（PCA） 上生长的嗜中 温需氧菌的菌落总数，并不表示样品中实际存在的所 有细菌菌落总数。
固体样品称量
• 用镊子取酒精棉消毒桌子、擦手，点燃酒精灯； • 打开稀释瓶盖，放在天平上，等显示屏上的数字稳定
后，按“去皮”键，当数字显示为“0”时，开始称量。
去 皮 键
无 菌 取 样
样 品 均 质
• 用量筒量取225mL灭菌生 理盐水至稀释瓶中。（注 意：稀释瓶、带塞锥形瓶 开盖前要过火，量筒、装 有灭菌生理盐水的锥形瓶 及其塞子应放在酒精灯周 围15cm的范围内）
一、微生物检验的目的 1、 临床微生物检验：
1）为诊断提供病原学依据； 2）为治疗提供参考用药的信息。 2、 卫生微生物检验： 通过指示微生物的检测，判断水、空气、 食品、化妆品以及各类公共场所等的卫生状 况。
二、卫生指示微生物
1、定义：是在常规卫生监测中，用以指示样品卫生状况及安全 性的（非致病）微生物（或病毒）。
b.空气：在冬春季节，更容易发生感冒等传染病，就是因为空 气的传播；
c.水：水也是微生物存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、 尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等；
d.人与动物：人与动物自出生后，外界的微生物就逐渐进入人 体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种通道（如口腔、 鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，都存在着微生物群。
固
体
10mL
样
品
10-
1
吹吸50次， 1mL
10-
2
吹吸5次， Hale Waihona Puke BaidumL
10-
3
吹吸5 次，
1mL
1mL
灭 菌 生 理 水
25g+225m L灭菌生理水
10-1
-1
-2
-3
空白
-1
-2
-3
空白
提示：样品加入稀释液管后，要先吹吸， 后取1mL样液加入培养皿。
1.5 根据对样品污染情况的估计，选择2～3个适宜
按国家标准方法规定，即在需氧情况下， 36±1℃培养 48±2 h，水产品 30±1℃培养 72h±3h。能在平板计 数琼脂培养基（PCA）上生长发育的细菌菌落总数。所 以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温 的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以 繁殖生长
3、细菌总数
指一定数量或面积的食品样品．经过适当的 处理后，在显微镜下对细菌进行直接计数。 其中包括各种活菌数和尚未消失的死菌数。 细菌总数也称细菌直接显微镜数。通常以1 g 或1 mL样品中的细菌总数来表示。
稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别 在做10倍递增稀释的同时，吸取1.0 mL样品匀液于
无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取 1mL稀释液加入两个无菌平皿作空白对照。 1.6 样品匀液移入平皿后，应及时将凉至46℃平板 计数琼脂培养基(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中 保温)注入平皿约15mL～20mL，并转动平皿使混合 均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入加有1.0 mL 空白稀释液的无菌平皿内作对照。
第七章 食品微生物检验
第一节食品微生物
生境： 指生物的个体、种群或群落生活地域的环境， 包括必需的生存条件和其他对生物起作用的生态因素。 生境是指生态学中环境的概念，生境又称栖息地。生境 是由生物和非生物因子综合形成的，而描述一个生物群 落的生境时通常只包括非生物的环境。 一、食品生境特征 • 丰富的营养物质 ：碳源、氮源、无机盐及维生素； • 基质条件：水、pH、渗透压； • 天然防御结构/抑菌物质：
• 通常是细菌在固体培养基上（内） 生长发育，形成以母细胞为中心 的一团肉眼可见的、有一定形态、 构造等特征的子细胞的集团，称 之为菌落。
2、菌落总数的定义：
食品微生物学检验 菌落总数的测定 (GB 4789.2—2016)
是指食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培 养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样 中形成的微生物菌落总数。以 菌落形成单位 （colony forming units，CFU） CFU/g（mL）来表示。
1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液 1.0 mL，沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试管中 （注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品 匀液。
1.4 另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操 作顺序，做10倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次， 即换用1次1mL灭菌吸管或吸头。