构建全长cDNA文库

合集下载

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。

（2）cDNA第一条链的合成。

（3）cDNA第二条链的合成。

（4）双链cDNA的修饰。

（5）双链cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文库的扩增。

（7）cDNA文库鉴定评价。

一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。

）。

2. 混匀后，70℃反应10分钟。

3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。

4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。

6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。

7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。

二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。

花生果皮全长cDNA文库的构建及初步分析

福建农林大学学报（自然科学版）
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｕｊｉａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）
（ＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｉｌａＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｙｒｏｆＣｒｏｐＭｏｌｅｃｕｌａｒｎｄａＣｅｉｌＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆｕｚｈｏｕ，Ｆｕｊｊ衄３５０００２，Ｃｈｉｎａ）
ｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＤＨ５ａｂｙｅｌｅｃｔｍｐｏｍｔｉｏｎ．Ｔｈｅｅｎｔｒｙｉｌｂｒａｒｙｃｏ￣ｔｍｃｔｅｄｈａｓａｈｉｇｈｔｉｔｅｒｆｏ１．３ｘ１０ｃｆｕ．ＰＣＲｒｅｓｌ１ｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎ．ｓｅｒｔｓｖａｒｉｄｅｆｒｏｍ７５０ｔｏ２０００ｂｐｗｉｔｈａｖｅｒａｇｅｓｉｚｅｌａｒｇｅｒｔｈａｎ１０００ｂｐｎｄａ９５．５％ｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ．Ａｓｅｓｒｅｔｓｂｉｏｉｎｆｏｍａｒ－ｉｔｃｓｎａａｌｙｓｉｓ，ａｂｏｕｔ６８％ｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｅｒｆｕｌｌ — ｌｅｎｇｔｈ．ＴｈｉｒｔｅｅｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓｉｔｗｈｋｎｏｗｎｆｕｎｃｔｉｏｎｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｉｅｆｄｂｙＢｌａｓｔＸｓｅａｒｃｈｄｅａｇａｉｎｓｔｔｈｅＮＣＢＩｎｏｎ — ｒｄｕｅｎｄｎｔａｐｒｏｔｅｉｎｄａｔａｂａｓｓ．Ｔｅｈｅｓｅ￣ｓｌｔｕｓｗｉｌｌｂｅｕｓｅｆｕｌｆｏｒｓｃｅｅｒｎｉｎｇｎｄａｃｌｏｉｎｎｇｐｅｒｉｅａｒｐｓｐｅｃｉｌａｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

全长cDNA文库的构建—SMART技术

【共享】全长cDNA文库的构建—SMART技术全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA 的末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。

但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。

常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。

但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。

另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。

SMART技术的出现是一个新的里程碑。

这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析目的：为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。

方法：以SMART（switching mechanism at 5′ end of RNA transcript）方式合成全长cDNA，结合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术，构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA 文库。

结果：该文库重组率为93.9%，文库滴度1.3×106 cfu·mL-1，插入片段平均大小1.5 kb 左右。

随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序，通过生物信息学分析，获得150个单一序列，其中147个序列与相应的同源蛋白匹配，GO（gene ontology）分类表明这些序列参与各种生化途径。

8个序列包含了完整编码框，可判断为全长基因。

结论：成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA 文库，为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。

标签：铁皮石斛；均一化；cDNA 文库；序列分析铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科Orchidaceae石斛属多年生草本植物，具有独特的药用价值，为我国名贵中药材。

铁皮石斛以其茎入药，其主要药用成分是石斛多糖、石斛碱、石斛次碱及多种氨基酸及微量元素，有生津益胃、清热养阴及增强人体免疫活性等功效，主要分布于我国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区[1]。

铁皮石斛种子小无胚乳，自身繁殖力低，在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，加上人为的过度采挖，其自然资源濒临枯竭[2]。

近些年铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术的突破性发展[3]，使得人工栽培铁皮石斛逐渐成为一个新兴产业。

由于对天然药物需求的不断增加，解决药物资源匮乏问题一直存在，从20世纪90 年代开始，药用植物功能基因的克隆呈现发展势头[4]。

通过确定药用植物的功能基因，发展药用植物的基因工程，获取药用植物的药用成分，这些都依赖药用植物的功能基因研究开发。

构建cDNA文库应注意的事项

构建全长cDNA文库时应当注意事项构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。

但都应当注意以下四个方面：一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。

构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。

老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。

虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。

至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。

如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。

二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。

这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。

反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。

反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。

少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。

Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。

大豆叶片全长cDNA文库的构建与鉴定

维普资讯
作物杂志Ｃｏｓｒ英慧张宝石关荣霞常汝镇邱丽娟
摘要以大豆绥农ｌ４第一个三出复叶幼叶
为材料提取ｍＮ利用ＳＡＲＲＡ，ＭＴ技术合成了全长ｃＮ经限制性内切酶ｓａ和日消化后的ｃＮＤＡ，ｉｆＤＡ
３０Ｎ
Ｎ一 ’Ｎ＝Ａ，Ｃ或Ｔ；３（Ｇ，Ｎ一，＝Ａ，或Ｃ）Ｇ，
ＳＭＡＲＶｌｏ（Ｔ）５ＴＩＯｉｄ： ’一ＡＡＣＣＴｇＡＧＧＧＴＴ了ＤＡ测解生物体结构和功能的一种重要方法之一。全长ｃＮＤＡ有助于鉴定其基因组序列中的外显子一内含子的边界，析基因编码区和理解基因在转录和翻分译水平的功能，是分析植物基因表达图谱、能和结功构的重要资源。日本的研究人员在拟南芥和水稻基因组测序后，后完成了拟南芥、稻全长ｃＮ先水ＤＡ文
ＣＣＧ（ＧＣＡＩＡＧＣＧＧ一３。ｃＮ第ＧＡＡＧＣｒＣＧＣＧＴＴ ’ ＤＡ二链合成５ＰＲ引物５ ’Ｃ ’一ＡＧＡＴＧＡＡＣＧＧＴＴ
ＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ一３’ 。ＲＮｅｓｌｎｔｋｔＯｌｇｔｘｍＲＮＡｉ — ｃｌｍｎａｙＰａｉ，ｉｏｅＳｐｎｏｕ
室种植，当第一个三出复叶完全展开时，取其三出复
入片断大小范围为０２２０ｂ主要集中在０５～．５～．ｋ，．

滇紫草培养细胞全长cDNA文库的构建、基因序列及表达分析的开题报告

滇紫草培养细胞全长cDNA文库的构建、基因序列及表达分析的开题报告一、研究背景和意义滇紫草（Lithospermum erythrorhizon）是一种广泛分布于我国西南地区的药用植物，其根部可提取出红根素等具有重要药理活性的天然产物。

近年来，由于其丰富的生物活性及广泛应用价值，滇紫草的研究引起了广泛关注，研究重点主要集中在其生物合成及调控机制、基因组学和代谢组学等方面。

全长cDNA文库是一种重要的基因组学研究工具，可以全面反映物种的基因表达情况和基因组结构特点，为分子生物学研究提供了一个有力的手段。

目前，关于滇紫草的全长cDNA文库构建和基因表达分析研究还较为缺乏。

因此，本研究拟从滇紫草中筛选出一批与其生长发育、次生代谢等相关的差异表达基因，构建滇紫草全长cDNA 文库，并利用生物信息学手段进行基因序列分析和表达规律的研究，为深入探讨滇紫草生物合成与代谢调控机制等方面奠定基础。

二、研究内容和步骤（一）构建滇紫草全长cDNA文库1. 提取滇紫草总RNA，并采用Oligo(dT)选育法获得poly(A) mRNA；2. 将poly(A) mRNA反转录为cDNA，加入适量的Adaptor连接器，通过PCR扩增得到cDNA片段；3. 将cDNA片段插入载体pEASY-T1，并将其转化入大肠杆菌DH5α中，进一步筛选获得滇紫草全长cDNA文库。

（二）基因序列分析1. 对所获得的滇紫草全长cDNA文库进行测序；2. 利用生物信息学方法，对所得序列进行拼接和比对分析；3. 针对部分关键基因，进行进一步的序列结构和结果预测分析。

（三）基因表达规律的研究1. 利用实时荧光定量PCR技术，研究滇紫草不同组织和生长期的基因表达规律；2. 结合全长cDNA文库测序结果和基因表达实验数据，以及生物统计学方法，筛选出滇紫草关键基因并对其进行功能分析。

三、预期研究成果1. 成功构建滇紫草全长cDNA文库，并获得大量高质量的cDNA序列信息；2. 对部分基因进行序列结构和结果预测分析，揭示其生物学功能；3. 通过实时荧光定量PCR技术，获得滇紫草不同组织和生长期的基因表达规律，并筛选出关键基因；4. 对滇紫草的生物合成和代谢调控机制等方面进行深入研究，为其开发和利用提供基础和参考。

cDNA文库构建知识

全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。

但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA 文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。

另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。

SMART技术的出现是一个新的里程碑。

这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA 的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo （dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。

[木奈]褐变果实均一化全长cDNA文库的构建及部分ESTs序列分析

ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆｌｏｎｇｄｉｓｔａｎｃｅＰＣＲ，ＤＳＮ（Ｄｕｐｌｅｘ— Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
热带作物学报２０１３，３４（２）：２９２ — ２９６
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＣｒｏｐｓ
榇列分析
１０４ｐｆｕ／ｍＬ，重组率为９９％，插入片段大小平均为１．８ｋｂ，文库质量良好。随机挑取７２０个阳性克隆进行５ＥＳＴ测
序，共获得６８４条有效的ＥＳＴｓ序列；并将６８４条有效序列拼接后，５８条被组装成２１个重叠群（ｃｏｎｔｉｇｓ），单拷贝（ｓｉｎｇｌｅｔｓ）因有６２６条，共得到６４７个单基因簇（ｕｎｉｇｅｎｅｓ），文库冗余率为８．４％。用Ｂｌａｓｔ２ｇｏ在线软件对测序结果进行功能注释和归类分析，结果显示，已知功能基因与能量代谢、蛋白质合成与降解、次生代谢物质、细胞壁代谢和转录因子有关。该文库的构建有利于从分子水平上研究檫果实褐变发生的机制。关键词檫；褐变；均一化全长ｃＤＮＡ文库；表达序列标签

人正常垂体组织全长cDNA文库的构建及初步鉴定

关键词：体；因文库；转录聚合酶链反应；垂基逆ＲＮＡ；ＤＮＡ，补互
Ｃｏｓｒｃｉｎａｄｐｒｌｍｉｒｄｎｔｆｃｔｏｆｆｌ—ｅｇｈｃｎｔｕｔｏｎｅｉｎａｙｉｅｉｉａｉｎｏｕｌｌｎｔＤＮＡｌｂａｙｏｍａｔｉａｙｔｓｕｉｒｒｆｈｕｎｐｉｕｔｒｉｓｅ
基础研究．
人正常垂体组织全长ｃＤＮＡ文库的构建及初步鉴定
蔡英，慧玲黄
摘要：应用ＳＡ术构建人正常垂体组织的全长ｃＡ文库。方法用ＴＩｏ试剂提取组织总Ｒ目的ＭＲＦ技ＤＮＲｚｌＮＡ，利用逆转录酶的末端转移酶活性，先加入Ｓ预ＭＡＲ引物，Ｃｓ Ⅲ／ＰＲ引物的引导下合成ｃＡ第一链，Ｔ在Ｄ３ＣＤＮ
ＭｅｈｄＴｈｅｔａＮＡａｘｔａｔｄｆｒｓｎｔｅｉｉｇｔｉｓｔａｆｃＮＡｓｎｇＳＭＡＲＴｔｏｓｏｔｌＲｗｓｅｒｃｅｏｙｈｓｚｎｈｅｆｒｔｓｒｎｄｏＤｕｉｔｃｎｉｕｅＴｈｅｄｂｌｔａｄｃＮＡａｍｐｉｉｄｂｙＬＤ— ｅｈｑ．ｏｕｅｓｒｎＤｗｓａｌｆｅＰＣＲｎｄｄｇｅｔｄｂｙＳｆＩｒｓｒｃｉｎｅ — ａｉｓｅｉｅｔｉｔｏｎ
华老年心腑血戗：杂志２病０１０年１２月第１２卷第１２期

全长cDNA文库的构建方法

全长cDNA文库的构建方法全长cDNA文库的构建是基因组学研究中的重要步骤，它能够捕获一个生物体所有的转录本，为基因表达、功能研究和基因组注释提供有用的信息。

下面将介绍一种常用的全长cDNA文库构建方法。

样本准备需要准备含有目标转录本的细胞或组织样本。

这些样本可以是新鲜或冷冻的，只要它们的质量和数量能够满足后续步骤的需求。

对于一些需要特殊处理的样本，如动物组织，需要按照相关法规进行采集和处理。

RNA提取从样本中提取高质量的RNA是构建全长cDNA文库的关键步骤。

常用的RNA提取方法是Trizol法或RNAiso Plus法。

这些方法能够有效地分离出RNA，并且可以去除大部分的蛋白质和基因组DNA。

在提取RNA后，需要对其质量和浓度进行检测，以确保其适用于后续步骤。

反转录将RNA进行反转录，生成cDNA，是构建全长cDNA文库的另一个关键步骤。

常用的反转录方法是 oligo(dT)引物法和随机引物法。

oligo(dT)引物法利用了mRNA特有的poly(A)尾，能够捕获mRNA进行反转录。

随机引物法则利用了引物结合在RNA的任意位置，也能捕获全长的cRNA。

在反转录完成后，需要检测cDNA的浓度和特异性，以确保其适用于后续步骤。

文库构建在得到全长cDNA后，需要将其克隆到载体中，构建成文库。

常用的载体有质粒、噬菌体和BAC等。

这些载体都能够在细菌中进行复制和扩增，使得文库的规模得以扩大。

在构建文库时，需要确保cDNA的插入率和多样性，以避免后续步骤中的误差。

文库质量检测在构建完全长cDNA文库后，需要对其质量进行检测。

随着生物技术的不断发展，基因组学和蛋白质组学研究取得了突破性进展。

在此基础上，研究者们开始mRNA转录本的全长序列，即cDNA。

cDNA文库的构建对于基因表达、功能研究和比较基因组学等领域具有重要意义。

本文将探讨全长cDNA文库的构建方法及其应用研究。

全长cDNA文库构建的关键问题包括如何获取全长的、完整的mRNA转录本，以及如何将这些转录本有效克隆到表达载体中。

烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定

烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定以《烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定》为标题，近年来以CDNA技术为主要研究技术的生物识别领域发展迅速，烟草，作为世界上最常见的特殊作物，是基因工程实验的重要模式植物。

因此，烟草优质品种的花全长cdna文库构建和质量鉴定是非常重要的。

本文基于现有技术和数据，综述了烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定的原理、方法和实践。

由于烟草作物具有特殊的结构和分子特性，烟草花蕊组织是花全长cdna文库构建的主要材料，其具有高等生命特性。

因此，构建烟草优质品种花全长cdna文库的技术原理主要有以下四点：（1）采集和筛选烟草花蕊组织;（2）烟草花蕊组织的破裂、抽提、纯化和检测;（3）烟草花蕊组织cdna的文库构建;（4）文库的质量检测和鉴定。

在烟草优质品种花全长cdna文库的构建方法中，采用烟草花蕊抽提cdna的方法来构建文库，这是一种新型的cdna文库构建方法。

该方法可以有效提高文库构建的效率，避免无效cdna的异常累积。

在质量鉴定方面，主要通过计算文库深度和宽度，鉴定全长文库的覆盖率，检测文库中的cDNA来进行鉴定，以保证烟草优质品种花全长cdna文库的质量。

目前，烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定技术已取得了较好的效果，成功构建了大量的花全长cdna文库，将用于今后烟草基因工程实验等研究。

然而，在构建和质量鉴定过程中，仍然存在着不少问题，比如文库构建效率低、文库覆盖率不足等，需要进一步改进和完善技术流程，以提高文库构建效率和质量鉴定的准确性。

综上所述，烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定是烟草基因工程实验的重要前提，也是进行后续研究的基础。

未来，研究者将开展更多的实验研究以改善文库构建和质量鉴定技术，更深入地研究烟草基因工程实验。

cDNA文库及其构建.

cDNA文库科技名词定义中文名称：cDNA文库英文名称：cDNA library定义：含一种生物体所有基因编码的cDNA分子的克隆群。

应用学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

概述cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA （cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA 克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。

cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。

cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。

但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA 文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。

高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。

cDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

烟草基因组计划进展篇：1.烟草全长cDNA文库的构建及分析

分离分值，鉴定了大量的编码区ＳＮＰ（ｃｏｄｉｎｇＳＮＰ，ｃＳＮＰ）【９］。共
计３１７１７５条普通烟草ＥＳＴ拼接成至少包含４个读长的重叠群１５４２９个，鉴定出５３４７７个冗余度大于２的候选ＳＮＰ，烟草中出现ＳＮＰ的频率为Ｏ．３４％。其中ＳＮＰ的转换率大于颠换率，插入／删除表现出Ａ／Ｔ偏
中国烟草科学
ＣｈｉｎｅｓｅＴｏｂａｃｃｏＳｃｉｅｎｃｅ
烟草基因组计划进展篇：
１．烟草全长ｃＤＮＡ的构建及分析龚达平
（中国农业科学院烟草研究所，青岛２６６１能提供完整的基因编码区信息，揭示基因的表达水平，特别是基因组测序完成后对辅助基因注释和开展功能基因研究具有重要作用。普通烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
（ｓｉｎｇｌｅｔｓ）４２９３条，共得到５７０１个非冗余基因，其中全长基因数量为１６１１条。对绒毛状烟草共测序１１２９３个克隆，获得长度大于１００ｂｐ的高质量序列１０４５０条，平均序列长度为６４１ｂｐ；通过组装得到重叠群１２０２条，单一序列３６０６条，共得到４８０８个非冗余基因，其中全长基因数量为１６３９条。
烟草材料因信息和筛选重要功能基因，同时还开展了绒毛状烟草、林烟草、耳状烟草
（ Ⅳｏｔｏｐｈｏｒａ）和栽培烟草的根、茎、叶、花等主要组织共１６个样品的转录组测序及分析。

芝麻全长cDNA文库的构建及序列分析

ＤＯＩ：１０．３９６９／ｍｐｂ．０１１．０００６１７
ＡｂｓｔｒａｃｔＡｓｅｓａｍｅｆｕｌ１．１ｅｎｇｔｈｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙ（ＳｉＦｃＤＮＡ）ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｐｌａｎｔｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
４．７８ｋｂ／ＳＳＲ：ＡＧ／ＣＴ类型ＳＳＲ出现次数最多，占总ＳＳＲ的１９．０８％。高功能基因组学研究奠定基础。ＳＳＲ
ＴｈｅｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙｃａｐａｃｉｔｙｒｅａｃｈｅｄａｔｏｔａｌｏｆ５．６ｘ１０ｃｌｏｎｅｓａｎｄｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｔｉｔｅｒｏｆ１．１２ｘ１０ｃｆｕ／ｍＬ．ＡｎａｌｙｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｏｆｓｅｌｅｃｔｅｄｃｌｏｎｅｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｍａｉｎｃＤＮＡｒａｆｇｍｅｎｔｓｒａｎｇｅｄｒｏｆｍ１．０－３．０ｋｂｗｉｔｈａｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆ
９６．８８％．ａｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｏｆｆｕｌ１．１ｅｎｔｈｇｃＤＮＡｓｗａｓ８８％．１１５２ｃｌｏｎｅｓｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｒａｎｄｏｍｌｙｒｏｆｍｔｈｅＳｉＦｃＤＮＡ

文库构建

cDNA基因文库的构建2009-10-11 17:56:18| 分类：||一、cDNA文库的特征和发展：cDNA (complementary DNA):以mRNA为模板，在反转录酶的作用下合成的与之反向互补的DNA链(单链cDNA，反义链)，以单链cDNA为模板还可以合成其反向互补链(取代mRNA的DNA链，正义链)，得到双链cDNA。

将生物某一组织细胞中的总的mRNA分离出来作为模板，在体外用反转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到合适的载体上，并转入宿主细胞。

这种方法所形成的所有克隆的集合体叫cDNA文库。

1）cDNA只含有对应于成熟mRNA的转录区，不含启动子、终止子、内含子、基因间隔区等。

2）cDNA一般较短，平均长度1.5kb左右，多数为100bp至10kb。

3）表达谱的时空动态性决定了cDNA文库的多样性。

4）不同基因的cDNA间存在丰度上的差异。

二、cDNA文库的构建：1、RNA的分离mRNA是构建cDNA文库的起始材料。

总RNA中绝大多数是tRNA和rRNA，而mRNA只占总RNA的1﹪-5﹪，平均为2%，mRNA的比例取决于细胞类型和细胞的生理状态。

由于mRNA在总RNA中所占比例很小，因此从总RNA中富集mRNA是构建cDNA文库的一个重要步骤。

通过降低rRNA和tRNA含量，可大大提高筛选到目的基因的可能性。

利用Poly(A)尾巴纯化或直接提取mRNA。

1）根据研究目标合理选择器官、组织和细胞类型以及合理的环境条件，用于提取RNA。

2）保持mRNA的完整性，是构建全长cDNA文库的核心。

3）选取合适的提取方法，除完整性外，mRNA还要求纯度高、DNA污染少，最好是采用无RNase的DNase去除杂质DNA。

4）RNA定量准确，保存合理。

5）根据目标和条件决定是否需要纯化mRNA或直接使用总RNA。

2、第一链cDNA的合成由mRNA到cDNA的过程称为反转录(reverse transcription,RT)，由反转录酶(reverse transcriptase, RTase)催化。

cDNA文库构建原理以及技术路线

CDNA文库1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA，重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。

CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势，从而使它在个体发育，细胞分化，细胞周期调控2. CDNA文库得质量（1）文库的代表性CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息（即mrna种类），它是体现文库质量地最重要标本。

文库地库容量，它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。

具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。

具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数N=ln(1-p)/ln(1-n/t)，P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率，通常设为99％，N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数，n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数，t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数，以人类细胞为列，人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种，具体到某一特定类型地细胞中，表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15％。

因此对于巨大部分地人类细胞，每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种，全体mrna序列地总拷贝约为500000个，而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。

因此，用人类细胞来构建CDNA文库时候，要以99％概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息，构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5)一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10（6）以上的库容量3．MRNA是由5‘端非编码区，中间地编码序列和3’端非翻译区。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。

无论怎样，应当注意如下几个方面：
一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。

构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA 后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。

老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。

至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。

如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA 相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。

二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。

这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。

反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。

少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。

反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。

三、反转录后至包装到噬菌体外壳蛋白之前的诸多步骤的操作相对容易，但其中的层析柱cDNA分级很关键。

这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。

这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。

获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。

四、噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。

连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。

一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。

一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。

有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。