吸光光度法知识点
吸光光度法概述(一)
吸光光度法概述（一）10.1.1吸光光度法概念许多物质本身具有显然的色彩，例如，高锰酸钾溶液呈紫红色，硫酸铜溶液呈蓝色。
有些物质本身无色或是浅色，但碰到某些试剂后，变成了有色物质，如淡黄色的Fe3+与SCN-反应生成血红色的协作物，淡绿色的Fe2+与邻二氮菲作用生成橙红色的协作物等。
物质展现不同的色彩是因为物质对不同波长的光挑选性汲取的结果，而色彩的深浅是山于物质对光的汲取程度不同而引起的。
基于物质对光的挑选性汲取而建立起来的分析办法称为吸光光度法。
对于有色溶液来说，溶液色彩的深浅在一定条件下与溶液中有色物质的含量成正比关系。
吸光光度法利用这一关系，通过分光光度计测得溶液中有色物质对光的汲取程度而对物质举行定性和定量分析。
与经典化学分析办法相比，吸光光度法的特点有：①敏捷度高。
吸光光度法适用于测定微量物质，被测组分的最低浓度为10-5～10-6mol/L。
②精确度高。
吸光光度法的相对误差通常为2％～5％，常量组分的精确度的确不如滴定分析法和分量分析法高，但对微量组分，化学分析法是无法举行的，而吸光光度法则彻低能满足要求。
③操作简便。
吸光光度法的仪器设备容易，操作简便。
若采纳敏捷度高、挑选性好的显色剂，再采纳相宜的掩蔽剂消退于扰，有的样品可不经分别挺直测定。
完成一个样品的测定普通只需要几分钟到十几分钟，有的甚至更短。
④应用范围广泛。
几乎全部的无机离子和许多有机化合物均可挺直或间接地用吸光光度法测定。
吸光光度法已经成为生产、科研、环境监测等部门的一种不行缺少的测试手段。
通常状况下，吸光光度法可以分为以下几种：①可见吸光光度法。
基于物质对420～760 nm可见光区的挑选性汲取而建立的分析办法，也称为可见分光光度法，是微量分析的简便而通用的办法。
②红外吸光光度法。
利用物质对0.78～1000um红外光区电磁辐射的挑选性汲取的特性来举行结构分析、定性分析和定量分析的一种分析办法，又称为红外汲取光谱法和红外分光光度法。
吸光光度法
第20 章吸光光度法吸光光度法(light absorption method)是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。
包括比色法（colorimetric method）和分光光度法（spectrophotometry）。
前者是通过比较有色溶液颜色深浅来确定有色物质的含量；后者是根据物质对一定波长光的吸收程度来确定物质的含量的。
分光光度法包括紫外分光光度法（ultraviolet spectrophotometry）、可见光分光光度法（visible spectrophotometry）、红外分光光度法（infrared spectrophotometry）。
本章主要讨论可见光分光光度法。
20.1 概述20.1.1 物质对光的选择性吸收1. 光的性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。
光的偏振、干涉、衍射、折射等现象就是其波动性的反映，波长λ与频率ν之间的关系式：λν=c （c为光速）亦反映光的波动性。
光又是由大量具有能量的粒子流所组成，这些粒子称为光子。
光子的能量则反映微粒性，光子的能量E 与波长λ的关系：E = hν = hc/λ（h为普朗克常量）亦可用来表示光的微粒性。
由上述关系可知，光子的能量与光的波长（或频率）有关，波长越短，光能越大，反之亦然。
光的能量范围很广，在波长或频率上相差大约20个数量级。
不同光的波长范围及其在分析化学中的应用情况见表20-1。
表20-1 各种光的波长范围及其在分析化学中的应用情况光的名称波长范围跃迁类型分析方法X-射线远紫外光近紫外光可见光近红外光中红外光远红外光微波无线电波10-1~ 10nm10 ~ 200nm200 ~ 400nm400 ~ 750nm0.75 ~ 2.5μm2.5 ~ 50μm50 ~ 1000μm0.1 ~ 100cm1 ~ 1000mK和L层电子中层电子价电子价电子分子振动分子振动分子振动和低位振动分子转动X射线光谱法真空紫外光度法紫外光度法比色及可见光度法近红外光谱法中红外光谱法远红外光谱法微波光谱法核自旋共振光谱2. 物质的颜色与其对光的选择性吸收光可分为单色光与复合光，单色光（chromatic light）是仅具有单一波长的光，而复合光（polychromatic light）是由不同波长的光（不同能量的光子）所组成。
第10章 吸光光度法(5)
8
每一种物质的吸收曲线都有一个最大吸收峰，与之 所对应的波长称为最大吸收波长，用lmax表示。
9
（二）关于吸收曲线的两点说明：
1、不同物质吸收曲线的形状、lmax不同
10
2、同一种物质，吸收曲线的形状、lmax不随浓 度改变而改变，但峰高随浓度增加而增高。
11
§3 光吸收的基本定律—朗伯－比尔定律
的跃迁，它们一起构成分子吸收光谱。
4
由于分子的能级是不连续的，是量子化 的，所以只有当光的能量满足： hn＝E激-E基 时，电子才能产生跃迁，这一频率的光 才能被吸收, 所以物质对光的吸收具有选 择性。 因为分子的结构不同，其能级间的能量 差也不同，故它们各自的吸收光谱不同。
5
三、物质颜色与吸收光颜色的关系
Ar＝-lgTr
Tx Tr T0
41
（三）示差光度法比普通光度法准确的原因
例：设有一浓度较大的试样，以纯溶剂作参比 测得Tx＝5％。现取一浓度稍低于试样的标准 溶液，同样以纯溶剂作参比，测得Ts＝10％。 如果用此标准溶液调透光度＝100％，问此时 再测试样，其透光度为多少？ 解：
Tx 5% Tr 0.5 50% T0 10%
40
（二）定量的依据
c0＜cx 普通光度法测得： Ax＝ebcx A0＝ebc0 示差光度法测得：Ax- A0＝ebcx-ebc0 即 Ar＝eb（cx-c0）=eb△c Ar与△c成正比。 配制一系列标准溶液，并测量相对吸光度，以Ar为 纵坐标，△c为横坐标作图，即可得一条直线。 再在同样的条件下测得待测试液的相对吸光度，从 该直线上查出对应的△c，则cx＝△c+c0。
§7 吸光光度法的应用
一、高含量组分的测定—示差分光光度法 （一）方法
第九章 吸光光度法
发生相互作用。 假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)时才基本符合。 当溶液浓度c >10 －2 mol/L 时，吸光质点间可能发 生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。 故：朗伯—比耳定律只适用于稀溶液。 溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的 形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化 ，影响吸光度。
度的乘积成正比。 朗伯——比耳定律不仅适用于有色溶液，也适 用于其它均匀、非散射的吸光物质(包括液体、气 体和固体)，是各类吸光光度法的定量依据。
A bc
式中，A：吸光度，描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol· －１； L
无线电波 11000m
光谱名称 波长范围 X射线 0.1—10nm 远紫外光 10—200nm
跃迁类型
辐射源
分ห้องสมุดไป่ตู้方法 X射线光谱法
真空紫外光 度法
K和L层电子 X射线管 中层电子 氢灯 氢灯 钨灯
碳化硅热棒
近紫外光 200—400nm 价电子 可见光 400—750nm 价电子
近红外光 0.75—2.5μ m 分子振动 中红外光 2.5— 分子振动 5.0μ m
A总 lg(I01 I02 ) /(I01 10
1bc
I02 10
2bc
)
讨论: A总 lg(I0 I0 ) /(I0 10
1 2 1
1bc
I02 10
2bc
)
(1) 1= 2 = 则： A总 ＝lg（Ｉo/Ｉt）＝ bc
(2) 若 2≠ 1 ；A与C则不成直线关系。 2与 1
I0 A lg I t A Kbc
吸光光度法
A ＝ lg（I0 / It) = a b c ； a ＝ A / b c
式中， c：溶液的浓度 g ·L-1 a：吸光系数 L·g-1 ·cm-1
a与ε的关系为： a =ε/M （M为摩尔质量）
(3)、吸光系数的意义
a、单位浓度、单位光程的吸光物质，对某一波长的 入射光，所产生的吸光度。分质量吸光系数（a） 和摩尔吸光系数（ε ）。（定义）
★ 光度分析法，根据吸光物质的不同，可分为：
原子吸收分光光度法、分子（或离子）吸光光度法。 本章主要讲授的吸光光度法，属于：分子（或离子）吸收。 吸光波长：可见和近紫外（主要在可见光区）。
二、吸收曲线
物质对光的选择性吸收，可用吸收曲线来表示！
★ 吸收曲线的讨论：
(1) 吸光度最大处对应 的波长称为最大吸 收波长λmax
吸光系数可反映出吸光化合物的吸光本性！
吸光系数定义：单位浓度、单位光程的吸光物质,对某一 波长的入射光，所产生的吸光度。
(1)、摩尔吸光系数
A ＝ lg（I0 / It) = εb c
ε＝ A /bc
式中， b：液层厚度(光程长度) cm； c：溶液的摩尔浓度 mol ·L-１； ε：摩尔吸光系数 L·mol-1 ·cm-1；
① ε 是吸物光质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；
② 不随浓度 c 和光程长度 b 的改变而改变。温度和波长等
条件一定时，ε 仅与吸收物质本身的性质有关，与待测
物浓度无关,可作为定性鉴定的参数；
③ 同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。λmax处的 摩尔吸光系数最大，常以εmax 表示。εmax 表明了该
b、吸光系数是表示吸光物质 吸光能力的特征常数。吸光
系数越大，表示该物质吸光能力越强。其在吸收峰值 最大处对应的波长，叫最大吸收波长，此处吸光系数
第8章吸光光度法
MR + H+
显然，增大酸度对显色 反应不利。 ⑴影响显色剂浓度和颜色； ⑵影响Mn+的存在状态;
⑶影响配合物的组成。
实际工作中，作 A ～ pH 曲线，寻找适宜 pH 范围。
A
pH
3、显色温度的选择： 一般在室温，有时需加热，通过实验确定
4、显色反应时间：制作吸光度-时间曲线
(c(M)、 c(R) 、 pH一定)
一、显色反应的选择：
1、显色反应的类型：配位反应和氧化还原反应。 2、对显色反应的要求： ⑴灵敏度足够高:κ＞105 超高灵敏，κ=(6~10)104 高灵敏,κ=(2~6)104中等，κ＜2×104不灵敏 ⑵显色剂在测定波长处无明显吸收，试剂空白小。 对比度：两有色物质最大吸收波长之差 Δλ=|λMAXMR-λMAXR|≥60nm
2、吸收曲线：测量某 种物质对不同波长单色 光的吸收程度，以波长 为横坐标，吸光度为纵 坐标，得到的一条吸收 光谱曲线。
（1）用途： ①进行定性分析； ②进行定量分析； ③选择吸收波长； ④判断干扰情况。
9
定性分析与定量分析的基础
不同物质吸收光谱的形状以及max 不同
B 定性分析基础 物质对光的选择 吸收
练习题
1、人眼能感觉到的光称为可见光，其波长范围 是 A。400~780nm B。200~320nm C。200~780nm D。200~1000nm 答案： A 2 、符合比尔定律的一有色溶液，当其浓度增大 时，最大吸收波长和吸光度分别是 A。不变，增加 B。不变，减少 C。增加，不变 D。减少，不变 答案： A
Ia
透光率 （透射比）Transmittance
第一节 吸光光度法的基本原理第二节 光吸收的基本定律第三节 吸光
第二节 光吸收的基本定律
一、Lambert-Beer 定律 二、偏离 Lambert-Beer 定律的原因
一、Lambert-Beer 定律
吸光度和透光率的定义分别为：
A def lg I0 I
T def I I0
吸光度与透光率的关系为：
A =－lgT
1760 年， Lambert 指出：一束平行单色光通 过有色溶液后，光的吸收程度与溶液液层的厚度 成正比。
吸光度与显色剂用量的关系
2. 溶液的酸度 溶液的酸度对显色反应的影响主要表现在
以下三个方面： （1）溶液的酸度对被测组分存在状态的影
响： 大多数被测金属离子易水解，当溶液 pH 增大时，可能生成各种类型的氢氧基配合物， 甚至生成氢氧化物沉淀，使显色反应不能进行 完全。
（2）溶液的酸度对显色剂的平衡浓度和颜 色的影响：大多数显色剂是有机弱酸或有机弱 碱，当溶液的 pH 变化时，将影响显色剂的平 衡浓度，并影响显色反应的完全程度。另外， 有一些显色剂本身就是酸碱指示剂，它们在不 同 pH 的溶液中具有不同的结构，而产生不同 的颜色，所以对显色反应也有影响。
（3）仪器设备简单，操作简便、快速，选 择性好。由于新的显色剂和掩蔽剂不断发现， 提高了选择性，一般不需分离干扰物质就能进 行测定。
（4）应用广泛。几乎所有的无机离子和具 有共轭双键的有机化合物都可以直接或间接地 用吸光光度法进行测定。
第一节 吸光光度法的基本原理
一、光的基本性质 二、物质对光的选择性吸收 三、吸收曲线
三、吸收曲线
如果将不同波长的光通过一定浓度的某一溶 液，分别测定溶液对各种波长的光的吸光度。以 入射光的波长 λ 为横坐标，相应的吸光度 A 为 纵坐标作图，可得到一条吸光度随波长变化的曲 线，称为吸收曲线或吸收光谱。
第9章吸光光度法(2)。
60nm
二、 显色条件的选择
吸光光度法是测定待测物质的吸光度或显色 反应平衡后溶液的吸光度，因此为了得到准确的 结果，必须控制适当的条件，使显色反应完全和 稳定。
显色条件包括: 溶液酸度，显色剂用量，显 色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存 离子的干扰等。
1、溶液酸度（pH值及缓冲溶液）
在相同条件下测的试液的吸光度， 从工作曲线上就可查到试液的浓 度, 该方法称为工作曲线法。 注意什么？ a. 标准溶液浓度必须在线性范围内，即符合A= bc
b. 试液的吸光度必须在标准曲线范围内，即A1≤ Ax ≤An
五、光度分析法的误差（准确度）
对朗伯－比尔定律的偏离
在实际分析中，常会发现标准曲线发生弯曲，尤其当溶液
2.有机显色剂
有机显色剂分子中含有某些含不饱和键的基 团如偶氮基、对醌基和羰基等生色团（ chromophoric group）和含孤对电子的基团如氨 基 、 羟 基 和 卤 代 基 等 助 色 团 （ auxochrome group）。
生色团：－N＝N－，－N＝O，
O
C=S,－N
（共轭双键）πe
为避免铁的干扰，可以选择波 长 520 nm进行测定，虽然而测镍的 灵敏度有所降低，但酒石酸铁不干 扰镍的测定。
二、参比溶液的选择
为什么要使用参比溶液？ 目的：扣除非待测组分（吸收池和各种试剂）对光的吸收， 使测得的的吸光度真正反映待测物对光的吸收。
测定时，采用两个材质、厚度相同的比色皿进行测量，其中 一个作为参比池，装入参比溶液，调节仪器使透过参比池的吸光 度为零。则测得待测溶液的吸光度为：
显色剂的用量来消除干扰。 g. 采用预先分离的方法。
三、三元配合物在光度分析中的应用特性简介（自学）
第七章吸光光度法
第七章吸光光度法第七章吸光光度法1.与化学分析法相⽐，吸光光度法的主要特点是什么？答：①灵敏度⾼②仪器设备简单，操作简便，快速③准确度较⾼④应⽤⼴泛2.何谓复合光、单⾊光、可见光和互补⾊光？⽩光与复合光有何区别？答：⑴复合光指由不同单⾊光组成的光；单⾊光指其处于某⼀波长的光；可见光指⼈的眼睛所能感觉到的波长范围为400-750 nm 的电磁波；将两种适当颜⾊的光按照⼀定的强度⽐例混合若可形成⽩光，它们称为互补⾊光；⑵⽩光是是⼀种特殊的复合光，它是将各种不同颜⾊的光按⼀定的强度⽐例混合⽽成有复合光。
3.简述朗伯-⽐尔定律成⽴的前提条件及物理意义，写出其数学表达式。
答：确定前提为：①⼊射光为平⾏单⾊光且垂直照射；②吸光物质为均匀⾮散射体系；③吸光质点之间⽆相互作⽤；④辐射与物质之间的作⽤仅限于光吸收过程，⽆荧光和光化学现象发⽣。
其物理意义如下：当⼀束单⾊光垂直通过某⼀均匀⾮散射的吸光物质时，其吸光度A 与吸光物质的浓度c 及吸收层厚度 b 成正⽐。
其数学表达式为： Kbc TI I A t ===1lg lg 04.摩尔吸收系数κ在光度分析中有什么意义？如何求出κ值？κ值受什么因素的影响？答：⑴摩尔吸光系数κ在光度分析中的意义：当吸光物质的浓度为1mol/L 和吸收层厚度为 1cm 时，吸光物质对某波长光的吸光度。
(2)在吸光物质的浓度适宜低时，测其吸光度A ，然后根据bcA =κ计算⽽求得。
(3) κ值受⼊射光的波长，吸光物质的性质、溶剂、温度、溶液的组成、仪器灵敏度等因素的影响。
5.何谓吸光度和透射⽐，两者的关系如何？答：吸光度A 是指⼊射光强度I 0与透射光强度I t 的⽐值的对数值。
透射⽐T 是指透射光强度I t 与⼊射光强度I 0的⽐值。
两者的关系如下：TI I A t 1lg lg 0== 6.在光度法测定中引起偏离朗伯-⽐尔定律的主要因素有那些？如何消除这些因素的影响？答：⑴物理因素：①⾮单⾊光引起的偏离②⾮平⾏⼊射光引起的偏离③介质不均匀引起的偏离。
第七章 吸光光度法
三、吸光度范围的选择 研究表明，当T=0.368，即A=0.434，测量 的相对误差为最小。当T=15%-65%时，即 A=0.2-0.8时测量的相对误差≤±2%，能满 足分析测定的要求，故吸光度在0.2-0.8为 测量的适宜范围。
2、化学因素： ①、Beer定律要求在稀溶液的情况下才适用，当待测液浓度过
高（M>10-2mol.l-1）时，则会引起误差。
②溶液的吸光物质常因解离、综合或互变影响或产生副反应而 改变其浓度，导致偏离。 3、其它因素：如待测试样是胶体溶液，新溶液或有悬浮物质时， 使得吸光物质不均匀，当λ射光透过溶液时，除了部分被吸收
第七章 吸光光度法
内容提要 概述（理解） 吸光光度法的基本原理（掌握） 显色反应及显色条件的选择（了解） 测量条件的选择（掌握） 目视比色与分光光度计（了解） 吸光光度法的应用（掌握）
§7-1 概 述
前面所学滴定分析和质量分析都属于化学分析法，适用于含
量高于1%常量组分的测定，测定结果的相对误差可控制
物质吸光能力大小的量度，它表示浓度为1mol.l-1的溶液，在1cm的比
色皿中，在一定温度和一定波长下的吸光度。
在吸光光度法中，有时也用透射比T来表示物质吸收 I 光的能力： T
I0
因此引出A与T之间存在以下关系： A lg I 0
I
lg
1 T
lg T
即：
A lg
1 T
KbC
综合考虑液层厚度与浓度对光吸收的影响，即得到朗伯-比尔的 数学表达式：
A lg
I0 I
KbC
它的物理意义是：当一束单色光平行照射到均匀，非散射性的吸光物质的
溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度C和液层厚度b的乘积成正比。
第7章吸光光度法
19.7.21
31
有机显色剂:
生色团（生色团） 能吸收紫外-可见光的基团 有机化合物：具有不饱和键和未成对电子的基团产生
n→ π*跃迁和π→ π*跃迁, 跃迁E较低
－N＝N－，－N＝O，
O
C=S,－N
O
（共轭双键）πe
注：当出现几个生色团共轭，则几个生色团所产生的 吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长 将比单个生色团的吸收波长长，强度也增强
注：一般可用空白对比校正消除
19.7.21
45
二、化学因素
浓度过高，吸光质点之间作用 改变 化学反应,浓度发生变化 以C代替平衡浓度 解离 络合 使C与平衡浓度的正比关系破坏 缔合
19.7.21
46
三、干扰及消除
1.干扰情况： 干扰物质本身有颜色 干扰物质与显色剂反应有吸收 干扰物质与显色剂反应虽没吸收，但消耗显色 剂 干扰物质生成沉淀
19.7.21
15
A,T,C之间的关系
A = lg (I0/It)
A = lg(1/T)
19.7.21
16
吸光度(A)、透光率(T)与浓度(c)的关系
A
T
T = 10-kbc
A=kbc
线性关系
c
19.7.21
17
二、摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度
1.摩尔吸光系数： : L·mol-1·cm-1
单色光的装置。 棱镜:玻璃350 ～ 3200 nm, 石英185 ～ 4000 nm 光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使用方便
19.7.21
24
单色器
棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同
白光 入射狭缝 准直透镜
第11章 吸光光度法
k——比列系数
分析化学
其中，浓度c的单位有两种表示方法： 1、以质量浓度（g· -1）为单位，相应k称 L
为吸收系数用“a”表示，则：A=abc
2、以物质的量浓度（mol· -1）为单位，相 L
应k称为摩尔吸收系数，用“κ”表示，则：
A=κbc
较常用，下面 的讨论均为此 种关系
分析化学
分析化学
不同的物质，对光的吸收性能不同，其κmax 也不同。显然，κmax越大的物质，在相同浓度下 的吸光度越大，其测定的灵敏度也越高。即： κmax∝灵敏度。 通常情况下，为获得较好的测量效果，一般 要求：κmax＞104 L· -1· -1 mol cm
吸光光度法的灵敏度除用摩尔吸收系数κmax表示外， 还常用桑德尔灵敏度表示。其定义见P280，常用符号S表示， S与κmax的关系为：
S=M/κ
M——被测物的摩尔质量
分析化学
二、吸光度A—浓度c的关系曲线：
按朗伯—比尔定律，当物 质一定，波长一定，吸收层 厚度一定时，A—c应呈线性 关系（如右图）： 但实践中，若处理不好， 关系曲线常有偏离——分正偏 差、负偏差两种情况： 正偏差（A测＞A理）； 负偏差（A测＜A理）。
分析化学
A A A
t0
t
t0
t
t1
t2
t
稳定型：产物一 旦产生，便非常 稳定（最理想的 类型，可在t0以 后测定）
不稳定型：产 物形成后逐渐 分解（不能用 于吸光分析）
半稳定型：产物较 稳定，经一段时间 放臵后才逐渐分解 （应抓紧时间在t1 至t2测定）
分析化学
④温度： 不同的显色反应需不同的温度，有的常温下即可 进行，有的需加热，有的在高温下要分解，故应根 据不同情况选择适宜温度。
分析化学第九章吸光光度法
3. 分光光度计及其基本部件：
光源－单色器－比色皿（吸收池）－检测器－显
（1）光源 : 钨丝灯:可见、红外 400－1000nm氢灯或 氘灯：紫外 160－350nm （2）单色器： a.滤光片：有机玻璃片或薄膜，利用颜色互补原理。 b.棱镜：根据物质的折射率与光的波长有关。玻璃 棱镜:可见,石英棱镜:紫 外、可见。 c.光栅：在玻璃片或金属片上刻划均匀的线，1200 条/mm, 衍射、干涉原理。
吸收光谱有原子吸收光谱和分子吸收光谱 单色 单一波长的光 光 光 复合光 由不同波长的光组合而成的光
两种不同颜色的单色光按一定的强度比 光的互补 例混合得到白光，那么就称这两种单色 光为互补色光
光的互补示意图
KMnO4溶液的 吸收曲线 (cKMnO4:a<b<c <d)
分子、原子、离子具有不连续的量子化能级，仅 能吸收当照射光子的能量hv与被照射粒子的 E激 － E基 ＝（hv）n因为不同物质微粒的结构不同， 共有不同的量子化能级，其能量差也不相同,因此 对光的吸收具有选择性。若固定某一溶液的浓度 C 和液层厚度 b ，测量不同 λ下的 A ，以吸光 度 A 对吸收波长λ 作图，就得到－吸收曲线， 即吸收光谱。 初步定性分析：不同物质吸收曲线的形状与最大 吸收波长不同。 定量分析：不同 C 的同一物质在吸收峰附近的 A 随 C ↑而增大，吸收曲线是吸光光度法中选择测 定波长的主要依据。
3.温度：通过实验确定温度范围，通常在室温下 进行。 4.溶剂：一般螯合物在有机溶剂中溶解度大，提高 显色反应的灵敏度。如Cu(SCN)42－在水中大 部分离 解，几乎无色；在丙酮中呈蓝色。
5.显色时间：通过实验找出适宜的显色时间。
6.干扰组分：共存组分与显色剂生成有色络合物， 正干扰；生成无色络合物，负干扰。 干扰的消除：
第九章 吸光光度法
2
§8-1 吸光光度法基本原理
比色法介绍
3
一、物质对光的选择性吸收
1．光的基本性质 光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波 长、频率、光速c、波数（cm-1）等参数来描述： = c ； 波数 = 1/ = /c 光是由光子流组成，光子的能量： E=h=hc/ （Planck常数：h=6.626 × 10 -34 J .S ) 光的波长越短（频率越高），其能量越大。 白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光,是连续光谱。 单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成) 可见光区：400-750 nm 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm 远紫外区10 - 200 nm （真空紫外区）
将Mn2＋ 氧化成紫红色的MnO4- 后，在525 nm处进行测 定。
23
4.显色剂 无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：种类繁多 偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜色发 生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、 对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂Ⅲ、PAR等。 三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
21
§ 8-3 显色反应及显色条件的选择
一、显色反应的选择 1.选择显色反应时，应考虑的因素 灵敏度高(ε值104~105)、选择性好、生成物稳定、显色 剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大吸收波长之 差：“对比度”，要求△ > 60nm。 2.配位显色反应 当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生 电荷转移跃迁，产生很强的紫外—可见吸收光谱。 例如:Cu2+与双硫腙配位形成的双硫腙铜在 λ=533nm 处的ε=5×104
27
2. 选择合适的参比溶液
为什么需要使用参比溶液？ 调节参比的A=0，使测得的的吸光度真正反映待测物的吸光强 度。扣除待测物的吸收之外的其他所有吸收。 参比溶液的选择一般遵循以下原则： ⑴ 若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其 它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水) 作参比溶液； ⑵ 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液 其它组分无吸收，用“试剂空白”(不加试样溶液)作参比溶液；
第十一章_吸光光度法[1]
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第⼗⼀章_吸光光度法[1]第⼗⼀章吸光光度法第⼀节吸光光度法概述吸光光度法是光学分析法的⼀种，也称为吸收光谱法。
它是基于物质对光的选择性吸收⽽建⽴起来的分析⽅法。
吸光光度法包括⽐⾊法、可见光分光光度法、紫外分光光度法、红外光谱法和原⼦吸收分光光度法。
吸光光度法根据分⼦的特征吸收光谱可以进⾏定性分析, 根据分⼦的吸光程度⼤⼩可以进⾏定量分析。
吸光光度法的特点如下：（１）灵敏者度⾼可⽤于测定微量组分的含量，测定下限可达10-5~10-6mol·L-1。
若被测组分在测定前先进⾏分离和富集，实验的灵敏度还可以提⾼。
（２）准确度较⾼⽐⾊法的相对误差为5%~20%，分光光度法的相对误差为2%~5%。
吸光光度法的准确度虽然不如滴定分析法⾼，但对微量组分的测定，已完全能满⾜要求。
（３）简便快速吸光光度法所使⽤的仪器设备简单，价格便宜，⼀般实验室都能具备。
仪器的操作简单，易于掌握。
（４）应⽤范围⼴⼏乎所有的⽆机离⼦和有机化合物都可直接或间接的⽤分光光度法进⾏测定。
⽬前分光光度法在实验室中是⼀种常规的分析⽅法。
本章主要介绍其中的⽬视⽐⾊法和可见光分光光度法。
第⼆节基本原理⼀、光的本质与溶液的颜⾊光是⼀种电磁波，通常⽤频率或在真空中的波长来描述。
不同波长（或频率）的光，能量不同。
波长短的光能量⼤，波长较长的光能量⼩。
如按波长⼤⼩顺序排列即得表11－1所⽰的电磁波谱。
表11－1 电磁波谱区域波长范围跃迁类型光谱类型ｘ射线10-3~10（nm）内层电⼦跃迁ｘ射线吸收、发射、衍射，荧光光谱、光电⼦能谱远紫外10~200（nm）价电⼦和⾮键电⼦跃迁远紫外吸收光谱，光电⼦能谱紫外200~400（nm）紫外-可见吸收和发射光谱可见光400~750（nm）近红外0.75~2.5（µm）分⼦振动近红外吸收光谱红外 2.5~1000（µm）分⼦振动红外吸收光谱微波0.1~100（cm）分⼦转动、电⼦⾃旋微波光谱，电⼦顺磁共振⼈的⾁眼可按颜⾊分辨在可见光区域内不同波长的光，在可见光区各种有⾊光与波长范围如表11-2所⽰。
第十三章 吸光光度法
Ax cx cs As
二、多组分的测定
对于含有多种被测组分的试液，如果吸光 物质之间没有相互作用，且服从 Lambert-Beer 定律，此时系统的吸光度等于各组分的吸光度 之和。 吸收光谱通常有以下两种情况。 （1）吸收峰互不重叠： （2）吸收峰重叠：
吸收峰不重叠
吸收峰重叠
A( 2)
其中，A:吸光度，T:透光率，
κ :摩尔吸收系数，d:溶液厚度，cB:溶液摩尔浓度
1 A lg κ T
•
d • cB
注意：平行单色光
均相介质 无发射、散射或光化学反应
摩尔吸收系数κ的讨论
κ 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1dm时溶
液在某一波长下的吸光度(单位：dm2 •mol-1)
def
I0 lg I
T def
A 与 T 的关系为：
I I0
A =－lgT
2、朗伯－比尔定律
朗伯定律(1760年): 光吸收与溶液层厚度成正比 比尔定律(1852年): 光吸收与溶液浓度成正比
当一束平行单色光垂直照射到样品溶液时，溶 液的吸光度与溶液的浓度及光程（溶液的厚度） 成正比关系－－朗伯比尔定律(光吸收定律) 数学表达：
第十三章 吸光光度法
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 吸光光度法的基本原理 光吸收的基本定律 吸光光度法分析条件的选择 分光光度计 吸光光度法的测定方法
本章重点
吸收曲线 朗伯－比尔定律
根据物质对光吸收的波长的不同，吸光 光度法主要可分为:
☺比色法 ☺可见吸光光度法（400～750nm） ☺紫外吸光光度法（10～400nm） ☺红外光谱法（760～1×106nm ）
KMnO4 的吸收曲线
吸光光度法
第十章 吸光光度法
第1讲
第十章 吸光光度法
吸光光度法（ 吸光光度法 （ Absorption Photometry） 是一 ） 种基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一种 分析方法。包括可见吸光光度法、紫外-可见吸光 分析方法 。 包括可见吸光光度法 、 紫外 可见吸光 光度法和红外光谱法等。 光度法和红外光谱法等。 吸光光度法同滴定分析 重量分析法相比，有以下一些特点： 法、重量分析法相比，有以下一些特点： (一)灵敏度高 吸光光度法测定物质的浓度下 一 灵敏度高 最低浓度)一般可达 的微量组分。 限 (最低浓度 一般可达 最低浓度 一般可达1-10-3%的微量组分 。 对固 的微量组分 体试样一般可测到10 体试样一般可测到 -4%。如果对被测组分事先加 。 以富集，灵敏度还可以提高1-2个数量级 个数量级。 以富集，灵敏度还可以提高 个数量级。
第30讲 30讲第十章 吸光度法第1讲在分光光度测定中， 在分光光度测定中，盛溶液的比色皿都是采用相 同质且的光学玻璃制成的， 同质且的光学玻璃制成的，反射光的强度基本上是不 变的(一般约为入射光强度的 一般约为入射光强度的4％ 其影响可以互相抵消 其影响可以互相抵消， 变的 一般约为入射光强度的 ％)其影响可以互相抵消， 于是可以简化为 I0＝It+Ia 纯水对于可见光的吸收极微， 纯水对于可见光的吸收极微，故有色液对光的吸 收完全是由溶液中的有色质点造成的。 收完全是由溶液中的有色质点造成的。 当入射光的强度I 一定时，如果I 越大， 就越小， 当入射光的强度 0一定时， 如果 a越大 ， It就越小 ， 即透过光的强度越小， 即透过光的强度越小，表明有色溶液对光的吸收程度 就越大。 就越大。 实践证明，有色溶液对光的吸收程度， 实践证明，有色溶液对光的吸收程度，与该溶液 的浓度、液层的厚度以及入射光的强度等因素有关。 的浓度、液层的厚度以及入射光的强度等因素有关。 如果保持入射光的强度不变， 如果保持入射光的强度不变，则光吸收程度与溶液的 浓度和液层的厚度有关。 浓度和液层的厚度有关。
第九章 吸光光度法 (工)
12
Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱
1.0 0.8 Absorbance 0.6
第九章 吸光光度法
9.1 9.2 9.3 9.4 9.5
吸光光度法的基本原理 光度计及其基本部件 显色反应及显色条件的选择 吸光度测量条件的选择 吸光光度法的应用
1
9.1 吸光光度法的基本原理
吸光光度法是基于被测物质的分子对光具 有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。
一、概述： 比色法：比较溶液颜色的深浅确定组分含量的一种 方法。
38
722型分光光度计结构方框图
光 源
分光 系统 吸收池 检测系统
39
分光光度计的主要部件
光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够
的光强度,稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)
单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的
装置。
棱镜:玻璃350～3200nm, 石英185～4000nm 半宽度 5～10nm 光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使
6
与物质作用
电场向量 Y
Z 磁场向量 传播方向
7
微粒性 光量子，具有能量。
E h
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J· s －频率 E－光量子具有的能量
单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)
8
波粒二象性
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第九章吸光光度法知识点
吸光光度法是基于分子对光的选择性吸收而建立的一种分析方法，包括比色法、紫外一可见吸光光度法、红外光谱法等。
1．吸光光度法的基本原理
①物质对光的选择性吸收：当光照射到物质上时，会产生反射、散射、吸收或透射。
若被照射的物质为溶液，光的散射可以忽略。
当一束白光照射某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过，溶液的颜色由透射光的波长所决定。
吸收光与透射光互为补色光(它们混合在一起可组成白光)。
分子与原子、离子一样，都具有不连续的量子化能级，在一般情况下分子处于最低能态(基态)。
当入射光照射物质时，分子会选择性地吸收某些频率的光子的能量，由基态跃迁到激发态(较高能级)，其能级差E激发态一E基态与选择性吸收的光子能量hv的关系为Hv=E激发态一E基态
分子运动包括分子的转动、分子的振动和电子的运动。
分子转动、振动能级间隔一般小于1 eV，其光谱处于红外和远红外区。
电子能级间的能量差一般为1～20 eV，由电子能级跃迁而产生的吸收光谱位于紫外及可见光区，其实验方法为比色法和可见-紫外吸光光度法。
②吸收曲线：以波长为横坐标，以吸收光的强度为纵坐标绘制的曲线，称为吸收光谱图，也称吸收曲线。
它能清楚地描述物质对不同
波长的光的吸收情况。
③光的吸收定律——朗伯一比尔定律：当一束平行单色光垂直通过一厚度为b、非散射的均匀吸光物质溶液时，吸光物质吸收光能，致使透射光强度减弱。
若用I。
表示入射光强度，I t表示透射光强度，I。
与I t之比称为透光率或透光度T，T=I。
/I t，吸光物质对光的吸收程度，还常用吸光度A表示，A=lgT=log I。
/I t。
实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A与溶液浓度c和液层厚度b的乘积成正比，此即朗伯一比尔定律，其数学表达式为
A=lgT=log I。
/I t =abc
式中，a为吸收系数。
溶液浓度以g·L-1为单位、液层厚度以cm 为单位时，a的单位为L·g-1·cm-1。
当溶液浓度以mol·L-1为单位、液层厚度以cm为单位时，此时吸收系数称为摩尔吸收系数，用符号k表示，其单位为L·mol-1·cm-1。
此时朗伯一比尔定律可写为A—Kbc。
摩尔吸收系数k是吸光物质在给定波长和溶剂下的特征常数，k越大，表示该物质对某波长光的吸收能力越强，测定方法的灵敏度也就越高。
根据朗伯一比尔定律，当吸光物质光程一定时，吸光度与吸光物质的浓度成线性关系，因此可以根据直接比较法和标准曲线法测定试样溶液中待测物质的浓度。
需要注意的是，在某些情况下，A—c关系并不严格遵守朗伯一比尔定律，这种现象称为偏离朗伯一比尔定律。
引起偏离朗伯一比尔定律的主要原因是，仪器不能提供真正的单色光和吸光物质的浓度过大。
一般说来，朗伯一比尔定律只适用于稀溶液。
2．吸光光度计的基本结构
①仪器的基本部件：尽管比色计、分光光度计的种类和型号繁多，但它们都是由图9—1所示的基本部件组成的。
②各部件的作用及性能：光源的作用是提供所需波长范围内的连续光，光源要有足够的光强度和稳定性，电源电压的微小波动会引起灯光强度的很大变化，因此需要用稳压电源。
可见分光光度计的光源多属热光源，如钨灯、碘钨灯等。
钨灯发射光的谱波长范围在可见和近红外区。
单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光。
比色计的单色器一般是滤光片，分光光度计的单色器通常由棱镜或光栅等色散元件及狭缝和透镜等组成。
可见分光光度计常用玻璃棱镜，紫外一可见分光光度计常用石英棱镜，这是由于玻璃对紫外光有较强吸收的缘故。
光栅是利用光的衍射与干涉作用制成的色散元件，它具有适用波长范围宽、色散率大和色散均匀等优点。
吸收池用来盛放试液，按制作材料可分为石英吸收池和玻璃吸收池，前者用于紫外和可见区，后者仅用于可见区。
检测系统由检测器与显示器组成。
检测器的功能是检测光信号，
并将光信号转变为电信号。
在简易型可见分光光度计中，广泛使用光电池或光电管作检测器，中、高档紫外一可见分光光度计中，常用光电倍增管或光电二极管阵列替代单个检测器。
常用的显示器有检流计、电位计、数字显示装置和自动记录仪等。
3．显色反应及显色剂
可见吸光光度分析中，对于颜色较深的溶液可直接测量吸光度；对于无色或色泽很浅的物质，必须先使之显色。
将待测组分变成有色化合物的反应称为显色反应，与待测组分形成有色化合物的试剂称为显色剂。
显色反应多为配位反应和氧化还原反应。
显色剂有无机显色剂和有机显色剂。
①显色反应的条件：显色反应一般应符合以下条件，如灵敏度高、选择性好、形成的有色物质应组成恒定并性质稳定；另外，显色剂在测定波长处最好无吸收或吸光值低。
显色反应的影响因素较多，一般应进行反应酸度、显色剂用量、溶剂、显色时间与温度、显色产物的稳定性等条件实验。
还应对共存物质的可能干扰情况进行考察，并选择适当的消除干扰物质的方法。
②显色剂：显色剂有无机显色剂和有机显色剂，无机显色剂应用不多，原因是其生成配位化合物不稳定，灵敏度及选择性不高。
有机显色剂应用广泛，多是含有生色团和助色团的化合物，大多能与金属离子生成极其稳定的螯合物，具有特征颜色，其选择性、灵敏度均高。
不少螯合物易溶于有机溶剂，可以进行萃取比色。
4．吸光光度法的测量技术
(1)测量波长的确定
根据吸收光谱图，按照灵敏度高、干扰少的原则选择测量波长。
(2)参比溶液的选择
①参比溶液的作用：为了扣除吸光光度法测量中因比色皿、溶剂或试剂等多种非待测组分对光吸收的影响，采用扣除参比溶液吸光度的方法，以保证分析方法的准确性。
②参比溶液的选择原则：若试液、显色剂和所加的试剂均无色，则可选用纯溶剂(若溶剂是水，可选用蒸馏水)作参比溶液；若试液无色，而显色剂或所加的试剂有色，则可选用不加试液的空白溶液作参比溶液；若试液中其他组分在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应，且显色剂无色，则可用试液作参比溶液；若显色剂和试液均有色，则可将一份试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，以此溶液作参比溶液。
(3)吸光度的测量范围的选择
为了使测量有较高的准确度，应将测量值控制在测量的相对误差较小的范围内。
当吸光度在0．15～1．0时，浓度测量的相对误差为1．4％～2．2％。
(4)工作曲线的绘制
工作曲线法是吸光光度法中最常用的一种定量分析手段。
即在选择的实验条件下，从低浓度到高浓度分别测量一系列(aq少于5个)不同含量的标准溶液的吸光度，以标准溶液中待测组分的含量为横坐标，吸光度为纵坐标作图，绘得的直线称为标准曲线(或工作曲线)。
然后
在相同条件下，测量待测溶液的吸光度，在标准曲线上查到与之相对应的被测物质的含量。
5．吸光光度法的应用
(1)吸光光度法的特点
①灵敏度高。
吸光光度法测定物质的浓度下限一般可达1％～o．001％的微量组分，比前面介绍的化学分析法灵敏。
如果对待测组分事先加以富集，灵敏度还可以提高1～2个数量级。
②准确度较高。
一般吸光光度法的相对误差为2％～5％，其准确度虽不如滴定分析法及重量分析法，但对微量组分来说，还是比较满意的。
③操作简便，测定速度快。
④应用广泛。
几乎所有的无机离子和有机化合物可直接或间接地用吸光光度法进行测定。
(2)吸光光度法的应用
①示差法：当待测组分的浓度过高或过低时，可采用示差法测定。
用得较多的是高浓度示差法。
即选用浓度稍低于试液的标准溶液作参比溶液，测定试液的吸光度，从而求出它的含量。
②多组分分析：可用双波长法、多波长法，或与计量方法结合的光度法消除共存组分的可能干扰，同时测定多组分的含量。
③吸光光度法在研究化学平衡、配合物的组成(如络合物形成常数、酸碱离解常数的测定)、摩尔质量的测定、光度滴定分析等方面都有广泛的应用。
④紫外分光光度法的应用：利用紫外吸收光谱的最大吸收波长或吸收光谱的形状，可以进行有机物的定性分析或分子结构的推断。
该方法广泛用于有机化合物的各种异构体，诸如顺一反异构体、互变异构体和旋光异构体的判别，以及有机化合物分子量的测定。
在有机物的定量测定中该方法也有广泛的应用。