PCR的退火温度选择
引物设计之退火温度
Tm值就是DNA熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。
不同序列的DNA，Tm值不同。
DNA中G－C含量越高，Tm值越高，成正比关系。
退火温度（Annealing Temperature）为引物和模板结合时候的温度参数，当50%的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度·它是影响PCR特异性的较重要因素。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候，可使引物和模板发生结合。
由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。
计算方法核酸Tm值（解链温度）计算评价标准是核酸所吸收的光线量达到其所增加吸收260nm光线的量的两倍达到的温度，当核酸达到Tm值时，其260nm吸收量可增加百分之四十（紫外吸收量随解体程度而增加，直至完全解体。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
2温度时间退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。
引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)+2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。
复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
引物设计退火温度,gc含量,长度
引物设计退火温度,gc含量,长度
本文将讨论如何设计引物的退火温度、GC含量以及长度。
引物
是PCR反应中的重要组成部分，其设计质量直接影响PCR反应的成功率和特异性。
因此，合理的引物设计对于PCR实验的成功至关重要。
首先，引物的退火温度是影响PCR反应特异性的重要因素。
退火温度过高会导致引物与非特异性的DNA结合，从而降低PCR反应特异性。
退火温度过低则会导致引物无法与目标DNA结合，影响PCR反应的灵敏度。
因此，引物的退火温度应该在50℃-65℃之间，一般情况下，引物的退火温度应该以引物的长度、序列及GC含量等因素为基础，根据实验者的经验和调整，最终确定。
其次，引物的GC含量也是影响PCR反应特异性的重要因素。
GC
含量过高或过低都会影响引物与目标DNA的互补性，从而影响PCR反应的特异性和灵敏度。
一般情况下，引物的GC含量应该在40%-60%
之间，如果引物长度较短，可降低GC含量，反之，则可增加GC含量。
需要注意的是，引物序列中不应该出现连续的GC或AT碱基，这会影响引物的互补性。
最后，引物的长度也是影响PCR反应特异性和灵敏度的重要因素。
引物长度过短会导致引物与非特异性DNA结合，影响PCR反应的特异性。
引物长度过长则会影响PCR反应的灵敏度。
一般情况下，引物长度应该在18-24个核苷酸之间。
综上所述，引物的退火温度、GC含量和长度是影响PCR反应特
异性和灵敏度的关键因素，实验者需要根据引物设计的目的和实验需
求，合理设计引物的这三个参数。
PCR仪缓慢降温怎么设置
PCR仪缓慢降温怎么设置什么是PCR仪？PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的基因分析技术，它能够在体外复制DNA片段，并通过温度的周期性变化来引发DNA的复制。
PCR技术在生物学和医学领域有着广泛的应用，对于研究基因组学和分子生物学等领域非常重要。
PCR仪是进行PCR技术的关键设备，它通过控制温度变化来实现DNA的复制过程。
PCR仪内部配备了一个热盖，能够提供恒定的温度环境，同时也能确保反应混合物的蒸发。
PCR过程中的缓慢降温PCR技术通常包括三个主要步骤：变性、退火和延伸。
其中，在退火步骤中的缓慢降温对于PCR反应的成功至关重要。
在退火过程中，引物结合到目标DNA序列上，启动DNA链的合成。
缓慢降温可以提高引物与目标序列的特异性结合，减少非特异性杂交的可能性。
缓慢降温的设置可以通过PCR仪的温度程序控制来完成。
下面是一个常见的缓慢降温设置方案：1.将PCR仪的温度设置为目标DNA序列退火温度的5°C。
2.将PCR反应体系放入PCR仪中。
3.启动PCR仪的程序，让温度从初始变性温度快速升高到95°C，进行变性步骤。
4.当温度达到95°C时，缓慢降低温度至目标退火温度的5°C，保持一段时间。
5.在缓慢降温阶段，引物与目标DNA序列结合。
6.缓慢降温时间结束后，提高温度至延伸步骤所需的温度。
7.完成PCR反应。
缓慢降温的重要性为什么缓慢降温在PCR技术中如此重要呢？这是因为在缓慢降温的过程中，引物与目标DNA序列结合的特异性增强。
这是由于在较低温度下进行退火，引物需要更长的时间和更低的温度来正确结合到目标序列上，从而减少了非特异性杂交的可能性。
此外，缓慢降温还有助于避免产生二聚体和伪二聚体等不良反应，这些反应可能会降低PCR反应的特异性和产量。
总结PCR仪的缓慢降温设置对于PCR反应的成功至关重要。
通过合理设置PCR仪的温度程序，可以在退火步骤中提高引物与目标DNA序列结合的特异性。
同源重组pcr引物退火温度-概述说明以及解释
同源重组pcr引物退火温度-概述说明以及解释1.引言1.1 概述同源重组PCR是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因工程、基因组学和生命科学研究中。
在同源重组PCR反应中，引物的设计和退火温度的选择是非常关键的步骤。
引物退火温度的选择直接影响了PCR反应的特异性和扩增效率。
引物退火温度是指PCR反应中的温度条件，用来使引物与模板DNA 序列结合，以便进行DNA扩增。
引物的退火温度应适当高于其Tm（退火温度）值，以保证退火反应能够充分进行。
同时，引物退火温度也需要低于DNA链的解链温度，以避免在退火过程中引物与DNA链的解链，影响扩增效率。
引物退火温度的选择需要考虑多个因素。
首先，应根据引物的序列特性来确定其Tm值。
Tm值是DNA双链解链的温度，通常由引物的碱基组成、长度和浓度来决定。
较长的引物和富含GC碱基的引物通常具有较高的Tm值。
其次，引物的退火温度应根据模板DNA的GC含量来进行调整。
高GC含量的模板DNA需要较高的退火温度，以增加引物与模板DNA 的结合力。
最后，应该考虑反应体系的缓冲条件、引物浓度和DNA模板浓度等因素，以获得最优的引物退火温度。
通过合理选择引物退火温度，可以提高同源重组PCR反应的特异性和扩增效率。
较高的退火温度可以增加引物与目标序列的结合力，减少非特异性扩增产物的形成。
同时，适当的退火温度可以提高扩增效率，加快PCR 反应的速度。
总之，引物退火温度在同源重组PCR反应中起着至关重要的作用。
合理选择引物退火温度可以提高反应的特异性和扩增效率，为基因工程和生命科学研究提供有力的技术支持。
1.2文章结构文章结构指的是文章的整体框架和组织方式。
在本文中，我们将遵循以下结构来撰写和组织文章内容：1) 引言部分:a. 概述：介绍同源重组PCR的基本原理和应用背景；b. 文章结构：说明本文的整体组织结构和各个章节的内容；c. 目的：明确文章的研究目标和意义。
2) 正文部分：a. 同源重组PCR引物的意义：介绍同源重组PCR引物在相关研究领域的重要性和作用；b. 引物退火温度对同源重组PCR反应的影响：探讨引物退火温度在同源重组PCR反应中的作用机制和影响因素。
PCR程序设计原则
PCR程序设计原则PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，广泛应用于基因检测、疾病诊断和基因工程等领域。
对于PCR实验，一个良好设计的程序可以提高反应效率、准确性和重复性。
以下是一些PCR程序设计的原则。
温度和时间的优化PCR反应在不同的温度下进行，其中最重要的是变性、退火和延伸的温度。
变性温度通常设定在94至98摄氏度，以使DNA双链解开成为单链。
退火温度根据引物设计的熔解温度（Tm值）确定，通常为50至65摄氏度。
延伸温度则为50-75摄氏度，具体取决于扩增片段长度和聚合酶的反应特性。
此外，在PCR反应中，温度保持和时间控制也是非常重要的。
温度过低会导致引物无法结合到目标DNA上，温度过高会使引物结合不稳定。
时间控制则可以在特定的阶段完成DNA复制的不同步骤。
通过优化温度和时间，可以提高PCR反应的效率和特异性。
引物设计引物是PCR反应中的关键因素之一。
引物设计要求具有独特性和特异性，避免与非目标DNA序列结合。
引物应具有合适的长度、Tm值和碱基组成，以确保在PCR反应中的特异性和稳定性。
通常情况下，引物的长度应在18-25个碱基对之间，Tm值应在50-65摄氏度之间。
合理的引物设计可以提高PCR反应的特异性和灵敏性，减少非特异扩增的产生。
DNA模板的选择和纯化DNA模板是PCR反应的起始物质，其质量和纯度对PCR反应结果至关重要。
选择高质量的DNA模板可以减少PCR反应中的假阳性和假阴性结果。
通常使用基因组DNA、cDNA或质粒DNA作为模板，并通过DNA提取和纯化技术去除潜在的PCR抑制物质和杂质。
防止污染和交叉污染在PCR实验中，污染和交叉污染是常见的问题。
为了避免这些问题，实验操作需要严格按照无菌操作的要求进行。
使用无菌工具和试剂，定期换手套和使用单次性试剂，以防止样品之间的交叉污染。
此外，为了避免污染，可以设置阴性对照组，确保反应管中没有外源性DNA污染。
必要时，还可以使用UV辐射消毒仪器和试剂等措施。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
退火温度的选择
另一种说法：熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
具体从多少度到多少度，要看你这对引物的Tm值，如果两个引物Tm值不高，可以设置48-60的梯度；否则可以设置58-70度的梯度；如果两个引物的Tm中等，则可以设置53-65的梯度范围，具体情况灵活掌握。
传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的，需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的，尤其是第2、3孔与第1孔接近，第10、11孔与第12孔接近。可以舍弃第2、2、10、11孔，只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品，孔间温度变化几乎呈真正的梯度状。
或者为了提高特异ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
另外，由于PCR仪的不同，注意其退火温度的设定：一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围，所以你的梯度范围尽可能设置宽一点，争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度。
梯度pcr寻找临界退火温度
梯度PCR寻找临界退火温度梯度PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于扩增DNA的技术，通过在不同温度下进行PCR反应，可以实现在同一个反应体系中同时扩增多个目标序列。
而临界退火温度则是指PCR反应中的最低温度，该温度下引物与模板DNA之间的杂交达到最大稳定性，以保证扩增效果。
PCR反应原理PCR是一种体外快速扩增特定DNA片段的技术，它通过反复进行三步循环来实现：1. 反应体系中加入DNA模板、引物和酶。
2. Denaturation（变性）：将反应体系加热至94-98℃，使DNA双链解开成两条单链。
3. Annealing（退火）：将反应体系降温至引物与目标序列互补碱基配对。
4. Extension（延伸）：将反应体系升高至酶的最适工作温度，使酶沿着模板链合成新的DNA链。
以上三步循环通常会重复20-40次，每次循环会产生指数级别的DNA扩增。
引物设计在PCR中，引物是起到识别目标序列并引导DNA合成的关键因素。
引物的设计需要满足以下几个要求： 1. 引物长度通常为15-30个碱基，较短的引物可以提高扩增效率。
2. 引物的GC含量应在40-60%之间，以保证稳定性。
3. 引物之间的Tm （退火温度）差异应在2-6℃之间。
梯度PCR原理梯度PCR是一种改进的PCR方法，它可以在同一个反应体系中同时扩增多个目标序列。
梯度PCR通过在反应体系中设置温度梯度，使得不同目标序列的退火温度能够被满足。
梯度PCR有两种常见的形式： 1. 温度梯度PCR：在反应体系中设置一个温度梯度，使得不同区域具有不同温度。
这样就可以同时进行多个PCR反应，在不同温度下扩增不同目标序列。
2. 退火时间梯度PCR：在反应体系中设置一个退火时间梯度，使得不同区域具有不同退火时间。
这样就可以根据目标序列与引物结合的稳定性，在最佳退火时间下扩增特定目标序列。
寻找临界退火温度寻找临界退火温度是为了确定PCR反应中引物与目标序列之间的最佳结合条件，从而提高PCR扩增效率。
引物退火温度
1、退火温度低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃。
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值（Tm值=4(G+C)
+2(A+T)）为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。
然后在此次实验基础上做出预估。
退火温度对PCR的特异性有较大影响。
2、延伸时间：1min/kb(10kb内）。
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。
但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。
扩展资料
PCR的过程：
1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA
2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。
3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。
引物与模板结合的温度
引物与模板结合的温度
在PCR过程中，温度循环包括变性、退火和延伸三个阶段。
在退火阶段，温度会降低以使引物与模板结合。
引物与模板结合的温度对PCR的特异性和效率都有很大影响。
如果退火温度过高，引物与模板结合不充分，扩增产物数量会减少；如果退火温度过低，引物可能与非特异性的DNA序列结合，导致非特异性扩增。
确定引物与模板结合的温度通常需要考虑引物的长度、序列和GC含量，以及待扩增的DNA模板的特性。
一般来说，引物的退火温度应该在50-65摄氏度之间，具体的退火温度可以通过计算引物的Tm值（熔解温度）来确定，Tm值是引物在退火过程中解离的温度。
总的来说，引物与模板结合的温度在PCR反应中起着至关重要的作用，合适的退火温度能够确保PCR扩增的特异性和效率，因此在进行PCR实验时需要仔细考虑和优化引物与模板结合的温度。
PCR反应的引物和退火温度的设计与优化
PCR反应的引物和退火温度的设计与优化PCR反应是一种常用的分子生物学技术，它可以利用引物和DNA聚合酶来扩增特定的DNA片段。
PCR反应的效率和特异性很大程度上取决于引物的设计和选择，以及PCR程序的设置。
本文将介绍一些关于引物和PCR程序的基本知识和常见问题，以及如何通过梯度PCR来优化PCR反应的退火温度。
引物是一种短的单链DNA分子，它可以与模板DNA上的互补序列结合，从而为DNA聚合酶提供起始位点。
引物的长度一般在18～25个碱基之间，引物的碱基组成应该尽量平衡，避免出现过多的GC或AT碱基。
引物的3’端应该避免出现互补或回文序列，以防止引物自身形成发夹结构或二聚体。
引物的浓度也会影响PCR反应的效果，一般建议使用0.1～0.5μM的引物浓度。
引物的退火温度是指引物与模板DNA之间的互补结合所需要的温度，它取决于引物的长度、碱基组成和浓度。
引物的退火温度可以通过一些公式或软件来计算，例如Tm值(解链温度)=4 (G+C)＋2 (A+T) 。
PCR程序是指PCR反应中设置的不同步骤和参数，它包括预变性、变性、退火、延伸、最终延伸和保持等步骤。
每个步骤都有相应的温度和时间，这些温度和时间会影响PCR反应的效率和特异性。
PCR程序中最重要的一个参数是退火温度，它是指PCR反应中实际设置的退火温度，它影响着引物与模板DNA之间的亲和力。
PCR程序的退火温度一般要比引物的退火温度低一些，以便引物能够有效地结合到模板DNA上。
PCR程序的退火温度也要根据不同的PCR酶、缓冲液和靶序列来调整，一般在40℃～60℃之间选择一个合适的温度。
如果退火温度过高，引物可能无法结合到模板DNA上，导致PCR产量低或无产物；如果退火温度过低，引物可能会发生非特异性结合，导致PCR 产生多条带或杂带。
梯度PCR是一种在同一反应板上同时设置不同的退火温度来进行PCR反应的方法，它可以快速地筛选出最适合特定引物和模板DNA的退火温度。
PCR的退火温度选择
熔解温度(Tm）是引物的一.个重要参数..这是当50。
％的引物和互。
补序列表现为双链DNA 分子时的。
温度.Tm对于设。
定PCR退火温度是必。
需的。
在理想状态。
下，退火温度足.够低，以保证引物。
同目的序列。
有效退火，同时还要足够高，以减少非特。
异性结合。
合理的退火。
温度从55℃到70℃。
退火温度一.般设定比引.物的 Tm低5℃.设定Tm有。
几种公式。
有的是来源。
于高盐溶液中的杂交，适用于小于。
18碱基的.引物。
有的是根据.GC含量估.算Tm.确定引物T。
m最可信的方法是近邻。
分析法.这种方法从.序列一级结。
构和相邻碱。
基的特性预。
测引物的杂交稳定性.大部分计算。
机程序使用。
近邻分析法.根据所使用.的公式及引.物序列的不.同,Tm会差异。
很大。
因为大部分公式提供一。
个估算的T。
m值,所有退火温度只是一个。
起始点。
可以通过分.析几个逐步.提高退火温.度的反应以。
提高特异性。
开始低于估。
算的Tm5。
℃,以2℃为增量，逐步提高退。
火温度.较高的退火。
温度会减少。
引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳。
结果，两个引物应.具有近似的.Tm值。
引物对的T。
m差异如果.超过5℃，就会引物在循环中使用。
较低的退火温度而表现。
出明显的错。
误起始。
如果两个引。
物Tm 不同,将退火温度。
设定为比最.低的Tm低.5℃或者为了提。
高特异性,可以在根据。
较高Tm设。
计的退火温。
度先进行5个循环，然后在根据.较低Tm设计的退火温度进行剩余。
的循环。
这使得在较为严紧的条.件下可以获。
得目的模板.的部分拷贝。
当引物长度.低于20个。
bp可以根据Tm=3GC+2AT，对于更长的。
寡聚核苷酸。
，Tm计算公.式为：Tm = 81.5 + 16。
6 x Log10。
［Na+] + 0.41 (%GC）– 600/size公式中，Size = 引物长度.退火温度取.决于引物长.度及序列，GC含量越。
高退火温度。
越高，引物的Tm。
值减去5—8度即是引物的退火温。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
PCR技术的温度范围
PCR技术的温度范围引言PCR（Polymerase Chain Reaction）技术是一种基于DNA重复复制的方法，可以在实验室中快速扩增特定DNA序列。
PCR技术的应用广泛，包括基因测序、遗传疾病诊断、犯罪解剖等领域。
在PCR过程中，温度的控制非常重要，适当的温度范围可以保证PCR 反应的成功进行。
PCR反应的温度控制PCR反应一般包括三个重复的步骤：变性、退火和扩增。
在不同步骤中，需要不同的温度来完成特定的DNA反应。
1.变性（Denaturation）：这一步骤需要将双链DNA解开成单链DNA。
温度通常需要在94℃至98℃之间，高温可以帮助断裂氢键，使双链DNA分离。
2.退火（Annealing）：在这一步骤中，引物（primers）结合到DNA的特定区域上。
引物结合的温度通常在50℃至65℃之间，具体取决于引物的碱基序列。
3.扩增（Extension）：这一步骤中，酶（如Taq聚合酶）将新的DNA链合成。
反应温度一般在68℃至72℃之间，取决于Taq聚合酶的最佳工作温度。
温度范围的重要性PCR反应的温度范围对扩增效率和特异性都有重要影响。
高温帮助分离DNA链，确保每个PCR周期都能够成功进行变性；适当的退火温度可以保证引物正确结合到目标DNA上，从而避免非特异扩增；最佳的扩增温度可以保证酶能够有效合成新的DNA 链。
然而，温度过高或过低都可能影响PCR反应的结果。
温度过高可能导致引物和DNA 非特异结合，进而引起非特异扩增；温度过低则可能导致DNA链无法充分分离，从而影响扩增效率。
因此，在PCR反应中，精确控制温度范围非常重要。
温度范围的优化策略为了获得最佳的PCR反应结果，研究人员可以通过以下几个步骤来优化温度范围：1.温度梯度实验：在PCR反应中设置温度梯度来确定最佳的退火温度。
通过在一系列反应管中设置不同的退火温度，然后观察PCR产物的数量和特异性，可以找到最适合的温度范围。
2.引物设计：合适的引物设计可以更好地适应特定的温度范围。
PCR的退火温度选择
熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
PCR温度怎么设置高低
PCR温度怎么设置高低PCR（聚合酶链反应）是一种用于扩增DNA的基本技术，温度设置是PCR过程中非常重要的因素之一。
合理设置PCR温度可以确保扩增反应的高效进行，同时避免不必要的问题和失误。
本文将介绍PCR温度设置的原则和方法，帮助读者正确进行PCR实验。
温度梯度的选择对于每个PCR实验来说，首先需要确定所需扩增片段的特性和反应条件。
根据目标片段的长度、GC含量、Tm值等特征，可以选择合适的温度范围作为PCR反应的温度梯度。
常用的温度梯度范围为50°C至70°C，可根据需要酌情调整。
初始变性温度在PCR反应开始时，需要对DNA模板进行变性，使其双链解开形成单链。
这一步骤一般在94°C至98°C的高温下进行，以确保DNA的完全变性。
一般情况下，94°C即可满足变性需求。
如果目标片段较长或含有高GC含量，可以适当提高初始变性温度，但不要超过98°C，避免DNA的损伤。
延伸引物的退火温度在PCR反应的下一步中，引物将与DNA模板序列的特定区域进行结合。
这一步骤称为引物的退火。
优选的退火温度通常比引物的Tm值低3°C至5°C。
一般而言，引物的合成商会提供引物的Tm值，可以据此选择退火温度。
DNA扩增温度在PCR反应的主要扩增步骤中，需要将DNA引物的末端与DNA模板序列结合，并使用聚合酶进行DNA链的合成。
此时的温度应根据DNA引物的退火温度而定，一般会选择与其相同或稍高的温度。
有时，一些研究人员会尝试较高温度以增加扩增特异性，但这也容易导致非特异性扩增产物的形成。
最终延伸温度最后，PCR反应需要进行DNA链的延伸，即在DNA模板的5’端和引物末端之间合成新的DNA链。
这一步骤一般在50°C至70°C的温度下进行。
我们可以根据引物的Tm 值以及目标片段的长度来选择合适的延伸温度。
综上所述，PCR温度设置的关键是结合DNA模板和引物的特性，根据不同的反应步骤选择相应的温度范围。
荧光定量退火温度用基因温度
荧光定量退火温度用基因温度
荧光定量退火温度（Fluorescence Quantitative Annealing Temperature）是一种用于PCR（聚合酶链反应）的温度调节
方法，其目的是在PCR反应中准确确定DNA引物的退火温度。
在PCR中，引物的退火温度是非常关键的，它决定了引物与
待扩增DNA靶标序列的特异性配对，从而影响PCR扩增的效率和特异性。
荧光定量退火温度的实质就是通过观察PCR反
应体系中荧光信号的强度变化，找到合适的温度来进行DNA
引物的退火。
基因温度指的是引物需要达到的退火温度，其选择与待扩增的DNA靶标序列有关。
基因温度可以根据引物的序列长度、GC
含量、碱基组成等因素进行计算或预测。
常用的计算方法包括Wallace规则、Nearest Neighbor法等。
在PCR反应中，合适的基因温度可以确保引物与靶标序列的
特异性配对，最大限度地提高PCR扩增的效率和特异性。
因此，在PCR实验设计和优化过程中，准确确定引物的基因温
度是非常重要的一步。
水的挥发点是100摄氏度。
pcr中温度最低的
pcr中温度最低的PCR（聚合酶链式反应）是一种重要的分子生物学技术，常用于DNA的扩增和分析。
PCR中的温度控制对反应的成功与否至关重要，而温度最低的环节是延伸温度。
PCR通常包括三个基本步骤：变性、退火和延伸。
变性温度通常在90-95°C之间，用于使DNA双链解开，退火温度在50-65°C之间，用于引导引物结合到目标DNA区域，而延伸温度则是最低的。
延伸温度决定了DNA聚合酶的活性，也是DNA的扩增过程中最重要的步骤之一。
在延伸温度下，DNA聚合酶将合成新的DNA链，以使扩增反应进行下去。
延伸温度一般在68-72°C之间，这是聚合酶的最佳工作温度。
为什么延伸温度是PCR中温度最低的环节呢？这是因为延伸温度不仅要保持聚合酶的活性，还要防止非特异性扩增的发生。
在延伸温度较高的情况下，聚合酶的活性可能会受到抑制或失活，导致扩增反应失败。
而延伸温度低于正常体温，则可以避免这种情况的发生。
此外，延伸温度的选择还与引物的设计有关。
引物是PCR反应中的关键组成部分，它们的长度、序列和结构都会影响扩增效果。
在延伸温度较低的情况下，引物更容易结合到目标DNA的序列上，提高特异性。
而在延伸温度较高的情况下，引物可能会结合到非特异性的DNA区域上，导致非特异性扩增。
延伸温度的控制在PCR实验的设计中非常重要。
通常，通过试验和优化，可以确定最适合特定引物和DNA模板的延伸温度。
此外，延伸时间和周期数也是需要优化的参数，以确保扩增反应的准确性和特异性。
总之，在PCR中，温度最低的环节是延伸温度。
它对DNA聚合酶的活性和特异性扩增都至关重要。
延伸温度的正确控制是PCR反应成功的关键之一，也为后续的DNA分析提供了可靠的基础。
在实验中合理选择延伸温度，并结合其他参数进行优化，将有助于提高PCR反应的成功率和效果。
1。
图文讲解如何在PCR仪上设置退火温度梯度
图文讲解如何在 PCR仪上设置退火温度梯度
TProfessional热循环仪（红色PCR仪）如何设置退火温度梯度
设定梯度 ①设定梯度最简单的方法是输入模块的两端温度(左边或者移动光标到下一个 位置。
②另外一种做法是移动光标到设定温度的位置并且按软键[Gradient] 在梯度的界面上您可以输入一个新的梯度或者编辑现有的梯度。在01行(左边)和第12行(右边)输入新的设定值，并且按[Enter] 确认。 要回到表格模式，按软键[Table]。
pcr三个关键温度设定的依据不包括
pcr三个关键温度设定的依据不包括PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链反应，是一种在分子生物学领域中被广泛应用的技术。
PCR通过共轭酶酶的作用，可以在体外快速扩增特定的DNA片段，从而使我们能够获得大量的目标DNA，以便进行后续的分析和研究。
PCR的关键步骤之一就是在不同的温度下进行反应，其中有三个关键温度的设定对于扩增反应至关重要。
本文将详细介绍PCR三个关键温度设定的依据。
1. 反应体系的解离温度：变性温度（Denaturation Temperature）在PCR反应中的第一个关键温度是反应体系的解离温度，也称为变性温度。
这个温度通常设置在90-95°C，其主要作用是将DNA的双链分离成两条单链。
由于DNA的酸性磷酸基团在高温下会失去电荷，双链结构的氢键断裂，从而使两条DNA链分离。
这样一来，DNA的两条链就可以作为模板，为后续的扩增提供条件。
2. 引物的结合温度：退火温度（Annealing Temperature）第二个关键温度是引物的结合温度，也称为退火温度。
在PCR反应中，引物是扩增特定DNA片段的关键因素。
引物必须与目标DNA的特定序列互补配对，才能在退火过程中结合到目标DNA上。
因此，退火温度的选择对于引物的特异性至关重要。
如果退火温度过高，引物不能完全与目标DNA结合，反应效率会降低；如果退火温度过低，引物与非特异序列的结合会增加，引起非特异性扩增。
因此，正确选择退火温度可以保证PCR反应的特异性和产量。
3. DNA聚合酶的最适温度：延伸温度（Extension Temperature）第三个关键温度是DNA聚合酶的最适温度，也称为延伸温度。
在PCR反应的每个循环中，延伸温度用于DNA链的合成。
DNA聚合酶的最适工作温度通常在65-75°C之间，该温度下酶能够高效地与模板DNA结合，并且具有较高的DNA链合成速率。
延伸温度的选择不仅取决于聚合酶本身的特性，还取决于所扩增的DNA片段的长度。
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熔解温度（Tm）是引物的一个重要参数。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm 值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
当引物长度低于20个bp可以根据Tm=3GC+2AT,对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
退火温度取决于引物长度及序列，GC含量越高退火温度越高，引物的Tm值减去5-8度即是引物的退火温度，引物的Tm值一般都会在引物合成单上体现，如果没有的话可以在网上搜个引物退火温度计算器输入序列就可以了。
退火时间一般都是30秒。
试试下载一个Oligo6.0，这个软件挺不错的，在计算出来的退火温度基础上上下幅度一点是没有什么问题的bioxm2.6 更专业软件很小很方便更能还挺强大我们刚做了PCR实验，当引物长度小于25bp时，退火温度通过（Tm-5）℃计算，Tm=4（G+C）+2（A+T）增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。
理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60%c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMERf. 避免3'端的错配g. 避免内部形成二级结构h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用兼并引物,并使用较高的引物浓度(1uM-3uM)j. 最好学会使用一种design software. PP5,Oligo6,DNAstar, Vector NTI, Online desgin et al.* 引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。
这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。
在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。
合理的退火温度从55℃到70℃。
退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。
有的是来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。
有的是根据GC含量估算Tm。
确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。
这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。
大部分计算机程序使用近邻分析法。
根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。
因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。
可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。
开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。
较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。
为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。
引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。
如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。
这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
2. stability of primers定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的。
引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。
定制引物以干粉形式运输。
最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。
TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。
引物的稳定性依赖于储存条件。
应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。
以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。
干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
3. optimize reactants concentrationa. magnesiom ionsMg离子的作用主要是dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用并能影响Polymerase的活性，一般的情况下Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg 离子的浓度，对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液b. 其他的离子NH4+ K+都会影响PCR，增加K+的浓度后, 会因为中和了核酸骨架上磷酸基团的负电荷而影响退火的温度,从而降低了PCR的严谨性(stringency)，NH4+也有相同的作用. MBI公司的TAQ酶就提供了两种BUFFER, 一种是加Mg的一种是已经混合了(NH4)2SO4的，当然, 过高的阳离子浓度(KCL>0.2M)时, DNA在94度根本不会发生变性, 当然也就无从谈起PCR了.c. polymerase不同公司的酶效有所不同,需要operator自己掌握适合的酶的浓度，一些高保真没的效率要远远低于Taq polymerase,所以可能需要的酶的量也要大一些. 另外, 一般的情况下, 变性的温度可以使用90~92度, 变性的时间也可以缩短,从而保证polymerase的活性d. template50ul PCR SYSTEM================================human gDNA 0.1ug-1ugE.Coli 10ng-100ngLamadaDNA 0.5ng-5ngPlasmid DNA 0.1ng-10ng================================4. termperaturea. denaturation常规是94度5分钟, GC Rich的摸板是95度5分钟除了GC Rich外, 常规的APPLICATIONS可以将这部分时间缩短到1到2分钟, 或者在CYCLE 1时给予较长的时间,而取消开始的denaturationb. annealing重点到了：一般情况下, 是从55度开始.根据情况配合以Mg离子浓度进行调整. 有条件的可以做gradient pcr. 退火的时间在30-60S, 时间短一些可以得到更好的效果. 因为, polymerase 在annealing temp.时也会有一些活性. 所以在A.T.的时间过长, 会极大的增加非特异性扩增的风险，另外,在对于一些困难户, 比如从gDNA里扩增大片段, 还可使用two step PCR.5. touchdown PCR原理很简单,但的确是一个很有用的方法。
举个例子，ANNEALING TEMP. 55度94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min 2cycles 94 30s51 30s 72 1min 2cycles 94 30s 50 30s72 1min 20cycles 72 5min6. hot start PCR热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。
尽管Taq DNA 聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。
因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。
这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。
在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如site-directed 突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。
这种方法简单便宜，但并不能完成抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。
包括延缓加入Taq DNA聚合酶，在反应体系达到90度时，PAUSE，将温度保持在70度以上，手工加入polymerase，但这个方法过于烦琐，尤其是对高通量应用，并容易造成污染。
其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，入镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。
在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。
有很多公司提供这样的酶。
=======================ampliwax PCR Gems (Perkin Elmer)Taq Bead Hot Start Polymerase (Promega)Magnesium wax beads (Stratagene).=========================象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
还有一种方法是使用inactive DNA Polymerase. polymerase被抗体抑制失活，当变性温度超过70度时，抗体也变性了，这样polymerase又被激活了。
7. Booster PCR我们知道1ug human genomic DNA 大约在3X10 5幂个模板分子,这样的模板分子数目可以是引物与模板很好的结合. 当模板的浓度过低,比如低于100个分子时, 引物和模板之间就很难发生反应. 引物容易自身进行反应形成二聚体.这样就有来了个booster PCR 我一直找不到合适的词来翻译这个booster.具体是这样的.开始几个cycles保持primer的低浓度,保证primer:template的molar ratio在10 7~ 10 8. 以确保开始扩增的准确性.然后booste Primer的浓度到正常的水平8. 循环数和长度确定循环数的基本原理是: 产物能够保证你进一步分析操作的最小循环数.因为过多的循环数容易造成ERRORS和非特异性产物的积累产物的量不够, 优化的方法有:1. 增加TEMPLATE2. 增加循环数如何确定循环数,有一个方法.做一个PCR体系,40循环,50ul, 分别在20,25,30,35循环时从体系中取5ul,一起跑电泳分析.从而确定最佳的循环数另一个会影响PCR特异性的是PCR cycling时在两个温度间变化的速率(ramping rate).当然是越高越好.不过咱们大部分条件有限,就那么几台PCR仪,也没有多少挑选的余地9. thermal cyclerPCR仪的因素我们经常容易忽视.长时间的使用后需要调整PCR仪,以保证其能够到达正确的温度.现在的PCR仪基本上都有自检功能(self-diagnosis).10. PCR additives附加物或者说enhancer实在是多种多样. 基本上包括几类, 能够增加反应退火效率的化学因子, DNA结合蛋白和一些商业试剂. 基本的原理不外是增加引物退火特异性,减少错配, 增加产物的长度和产量.在GC Rich情况中, additive可以造成配对碱基间的的不稳定,从而提高扩增的效率.而在另一种情况下,additive由于造成错配的primer-template复合物的极大的不稳定, 而提高了扩增的忠实性.要注意的是,没有万能的enhancer全部通用,需要你根据自己的情况,最好结合gradient pcr选择最优条件.====================================================dimethyl sulfoxide(DMSO) up to 10%formamide at 5%trimethylammonium chloride 10-100uMdetergents such as Tween 20 0.1-2.5%polyethylene glycol (PEG)6000 5-15%glycerol 10-15%single stranded DNA binding proteinsGene 32 protein 1nME.coli single-stranded DNA binding protein 5uM7 deaza-dGTP(for GC rich) 150uM with 50uM dGTPTaq Extender (stratagene)Perfect Match PCR Enhancer(stratagene)Q-solution(Qiagen)====================================================要注意的是,DMSO,GLYCEROL等会抑制polymerase的活性,所以需要scouting出最适的浓度11. Template DNA preparation提取DNA时的试剂会抑制PCR反应的顺利进行.因此需要对TEMPLATE DNA进行纯化.特别是SDS(<0.01%) 的情况下就能强烈抑制PCR的进行. 可以加入一些nonionic试剂,如Tween, Nonid, Trition之类的反过来抑制SDS. 还有proteinase K也要除干净, 不然会降解polymerase.12. Nested PCR简单点说设计两对引物, 一对是长的, 一对是包含在长引物内的, 用长引物扩增的产物作为第二次扩增的模板,这样可以增加产物的量. 而且可以减少非特异性带和错配的情况.增加PCR的保真性高保真酶高温DNA POLYMERASE是以单链DNA或RNA为模板，在dNTP和一些阳离子的存在情况下，在特定的引物指导下按3'-5'方向合成DNA.包括3种类型a.5'-3'方向的DNA合成能力,没有3'-5'方向的外切酶特性.如Taq及其突变体.这类酶的合成能力强,因为他不纠正合成中出现的突变b.与a类似,有合成活性,没有3-5的外切活性.但他们能以RNA为模板,合成DNA. 如Tth DNA Polymerasec.有DNA聚合活性,没有逆转录活性,但有3-5方向的外切酶活性.如pfu DNA Polymerase.可以提高忠实性。