DNA的粗提取和分离

（二）、DNA的鉴定原理 ① DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色， 因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂 ②甲基绿 （绿色）
利用该特点，选择适当的盐浓度就能
使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相
反，以达到分离的目的。 DNA不溶于酒精，但细胞中某些蛋白
质则溶于酒精。利用这一原理，可以将
DNA与蛋白质进一步地分离。
讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？ 答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋 白，从而使提取的DNA与蛋白质分开； 方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性 的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离.
2、 DNA的鉴定 鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的 浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管 中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯 胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸 水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试 管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶 液是否有蓝色．
溶 解 度
0.14mol/L
NaCl浓度
②如何通过控制NaCl溶液的浓度使 DNA在盐溶液中溶解或析出？ 当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol ／L时，DNA的溶解度最大，浓度为 0．14 mol／L时，DNA的溶解度最低。 利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中 溶解或析出
2、DNA在酒精溶液中的溶解性
曲线解读： 1、在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解 二、DNA的溶解性 度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低； 2、在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小； DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl 3、当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又 溶液中溶解度不同。 逐渐增大。
①植物细胞需要先用一定的洗涤剂 和食盐溶解细胞膜. 讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶 解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要 成分是NaCl，有利于DNA的溶解
②实例：提取洋葱DNA时，在切碎的 洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行从 分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液
提取DNA的方法
一、提取生物大分子的基本思路
选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理 或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而 言．就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物 理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成 分。
问题思考与讨论：
①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲 线图，思考在什么浓度下， DNA的溶解度 最小？ DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何 变化的？
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除 去血液中的上清液？ 答：血液分为两部分，一部分是血浆， 一部分是血细胞，除去的上清液是血浆.
2、破碎细胞，释放DNA
向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并且搅拌，从 而使血细胞膜和核膜胀破。用玻璃棒搅拌可以加 速细胞的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌， 但也不能太快太猛，防止打碎DNA。 蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体， 水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂， 释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质 再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的 结合在一起，应用3～4层纱布进行过滤，除去一 破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。 些颗粒较大的杂质。
1、制备鸡血细胞液
提 取 的 具 体 步 骤
2、破碎细胞，释放DNA 3、溶解细胞核内的DNA 4、DNA的析出——提取
DNA
5、DNA的初步纯化——提纯
6、DNA的鉴定
1、制备鸡血细胞液 取质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液100 mL，置于500 mL烧杯中，注入新鲜的鸡血（约 柠檬酸钠可防 180 mL），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸 止血液凝固 钠溶液充分混合，以免血液凝结。将烧杯中的血液 置于冰箱内，静置1d，使血细胞自行沉淀。用吸管 除去上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。
案例一：
以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取
为什么用鸡血细胞做实验材料？ 本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因： 能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？ 一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得； 不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞 核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实 二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作 验中很难提取到。 实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高， 操作繁琐，历时较长。
2、原则：凡是含有DNA的生物材料都可 以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组 织，成功的可能性更大
（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 1、动物细胞 动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细 胞液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻 璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可
讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
2、植物细胞
讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产 生怎样的影响？ 答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释 放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结 果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定 不显示蓝色等.
（三）去除滤液中的杂质
讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够 去除杂质？ 答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除 去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度 使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂 质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能 够除去与DNA溶解度不同的多种杂质.
DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的 某些蛋白质则可以溶于酒精。利用这一原 理，可以将DNA与蛋白质进一步分离 3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响
②大多数蛋白质不能忍受60－80°C的高 温，而DNA在80°C以上才会变性 ③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂 质和蛋白质,但对DNA没有影响
与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等 条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空
间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白
质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋 白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。
三、DNA的粗提取与鉴定的实验设计 （一）实验材料的选取 1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、 鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、 豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆 菌。（从中选取2～3种实验材料）