第三章 工业发酵菌种

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第三章发酵工程与食品产业第四节 菌种的活化与扩大培养

第三章发酵工程与食品产业第四节 菌种的活化与扩大培养

2. 种子罐级数的确定
依据: 依据 菌种的性质和菌体生长速度及发酵设备的合理应用 种子制备目的: 形成一定数量和质量的菌体。 种子制备目的 形成一定数量和质量的菌体。 发酵的目的: 发酵的目的 获得大量的发酵产物 并达到一定生长阶段后形成的, 产物是在菌体大量形成 并达到一定生长阶段后形成的, 需要在大型发酵罐内才能进行。 需要在大型发酵罐内才能进行。同时若干发酵产物的产生 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此, 菌其不同生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。因此,将 两个目的不同、 两个目的不同、工艺要求有差异的生物学过程放在一个大罐 内进行,既影响发酵产物的产量,又会造成动力和设备的浪费。 内进行,既影响发酵产物的产量,又会造成动力和设备的浪费。
2.2 生产车间种子制备
1.种子罐种子制备 种子罐种子制备 种子罐种子制备的工艺过程,因菌种不同而异,一般 种子罐种子制备的工艺过程,因菌种不同而异, 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 1) 孢子 或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中,经培 孢子(或摇瓶菌丝 被接入到体积较小的种子罐中 或摇瓶菌丝 被接入到体积较小的种子罐中, 养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子. 养后形成大量的菌丝,这样的种子称为一级种子 把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。 把一级种子转入发酵罐内发酵,称为二级发酵。 2) 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内,经过培养形 如果将一级种子接入体积较大的种子罐内, 成更多的菌丝,这样制备的种子称为二级种子. 成更多的菌丝,这样制备的种子称为二级种子 将二级种子转入发酵罐内发酵,称为三级发酵。 将二级种子转入发酵罐内发酵,称为三级发酵。 同样道理,使用三级种子的发酵,称为四级发酵。 同样道理,使用三级种子的发酵,称为四级发酵。

第三章 新技术育种原理

第三章 新技术育种原理

(3)移码突变的诱变剂
移码突变是指由一种诱变剂引起DNA分子中的一个或少数 几个核苷酸的插入或缺失,从而使该部位后面的全部遗传密码 发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变产生的突变体称 为移码突变体。
吖啶类染料(原黄素、吖啶黄、吖啶橙及α -氨基吖啶等) 和溴化乙锭(EB、核酸染色剂,用于DNA凝胶染色)都是移码突 变的有效诱变剂
0.5%甘氨酸) 溶菌酶和EDTA处理 溶菌酶和EDTA处理 溶菌酶处理(生长时补充0.41M蔗糖及
0.3u/ml青霉素)
纤维素酶或真菌中分离的溶壁酶
蜗牛酶
添加甘氨酸:菌体较易被酶解。提高细胞壁对溶菌酶的 敏感性作用机理并不十分清楚,有人认为甘氨酸渗入细 胞壁肽聚糖中代替D-丙氨酸的位置,影响细胞壁中各组 分间的交联度。不同菌种对甘氨酸的最适需求量各不相 同。
(1)与核酸碱基化学反应的诱变剂
烷化剂(alkylating agent) 带有一个或多个活性烷基,带 一个活性烷基称单功能烷化剂,带二个或多个的分别称为双功能或 多功能烷化剂。它们的烷基可转移至其它分子中电子密度高的位置, 它们的诱变作用是其与DNA中的碱基发生磷酸作用。
常见的烷化剂有硫酸二乙酯(EDS)、甲基磺酸乙酯(EMS)、N甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)、亚硝基甲基脲(NMU)、氮芥、乙 烯亚胺和环氧乙酸等。
B淋巴细胞(B-lymph) 骨髓瘤细胞(myeloma)
原生质体融合 杂交瘤细胞 MAB
主要步骤为:选择亲株、制备原生质体、原生质体融合、原生质体再生 及筛选优良性状的融合子。
3.2.1 选择亲株
为了获得高产优质的融合子,首先应该选择遗传性状稳定且具有 优势互补的两个亲株。 同时,为了能明确检测到融合后产生的重组子并计算重组频率,参与 融合的亲株一般都需要带有可以识别的遗传标记,如营养缺陷型或抗 药性等。可以通过诱变剂对原种进行处理来获得这些遗传标记。

发酵工业菌种概述

发酵工业菌种概述

分离:利用分离技术得到纯种。
发酵性能测定:进行生产性能测定。这些特性包 括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。
二、新种分离与筛选的步骤 1. 采样
(1)采样对象
以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼 泽土中,以细菌和放线菌为主,富含碳水化合物 的土壤和沼泽地中,酵母和霉菌较多,如一些野 果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物, 腐败物品,某些水域等。
二、新种分离与筛选的步骤 3. 培养分离 尽管通过增殖培养效果显著,但还是处于微生 物的混杂生长状态。因此还必须分离,纯化。 在这—步,增殖培养的选择性控制条件还应进 一步应用,而且控制得细一点,好一点。纯种 分离的方法有划线分离法、稀释分离法。
二、新种分离与筛选的步骤 4. 筛选 这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件, 通过三角瓶的容量进行小型发酵试验,以求得适 合于工业生产用菌种。
四、基因工程育种 基因重组育种:是运用体外 DNA 各种操作或修 改手法获得目的基因,再借助于病毒、细菌质 粒或其他载体,将目的基因转移至新的宿主细 胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表 达,或者通过细胞间的相互作用,使一个细胞 的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另 —个细胞的方法。
四、基因工程育种
三、诱变育种
3. 紫外线的诱变育种
被照射的菌悬液细胞数,细菌为106个/ml 左右,霉菌孢子和酵母细胞为106~107个 /ml。由于紫外线穿透力不强,要求照射液 不要太深,约0.5~1.0cm厚,同时要用电 磁搅拌器或手工进行搅拌,使照射均匀。 由于紫外线照射后有光复活效应,所以照 射时和照射后的处理应在红灯下进行。

2.发酵工业菌种

2.发酵工业菌种

发 酵 工 程 — 菌种
亚硝基胍诱变曲霉菌
三 、 优 良 菌 种 选 育 常 规 育 种
N-甲基 甲基-N'-硝基 亚硝基胍 硝基-N-亚硝基胍 甲基 硝基 亚硝基胍(NGN,MNNG , 或TG)对真核或原核微生物都有强烈的诱变 对真核或原核微生物都有强烈的诱变 作用。其精确的作用机制尚不很清楚, 作用。其精确的作用机制尚不很清楚,据认 为是伴随着重氮甲烷的生成及在酸性条件下 生成亚硝酸,直接作用于细胞内的DNA复制 生成亚硝酸,直接作用于细胞内的 复制 系统,从而诱发了变异。 系统,从而诱发了变异。MNNG的诱变作用 的诱变作用 的升高而增强。 随pH的升高而增强。 的升高而增强
发 酵 工 程 — 菌种
三 、 优 良 菌 种 选 育 细 胞 工 程 育 种
(二)原生质体的制备 二 原生质体的制备 原生质体的制备主要是在高渗压溶液中加 入细胞壁分解酶,将细胞壁分离剥离, 入细胞壁分解酶,将细胞壁分离剥离,结 果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞, 果剩下由原生质膜包住的类似球状的细胞, 它保持原细胞的一切活性。 它保持原细胞的一切活性。 在放线菌和细菌中, 在放线菌和细菌中,制备原生质体主要采 用溶菌酶; 用溶菌酶;酵母和霉菌一般可用蜗牛酶或 纤维素酶等。 纤维素酶等。
发 酵 工 程 — 菌种
三 、 优 良 菌 种 选 育 细 胞 工 程 育 种
原生质体融合育种的要点 (一)标记菌种的选择 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种, 获得标记菌种的方法是采用常规诱变育种, 筛选出营养缺陷型或/和抗药性菌株 和抗药性菌株。 筛选出营养缺陷型或 和抗药性菌株。这里最 重要的是标记必须稳定。 重要的是标记必须稳定。 采用抗药性菌株除可作标记外, 采用抗药性菌株除可作标记外,在实验室中 还可排除杂菌污染的干扰。 还可排除杂菌污染的干扰。为的是确证融合 的成功,可以采用多标记菌种。 的成功,可以采用多标记菌种。

2.发酵工业菌种

2.发酵工业菌种

二 ①施加选择性压力
、 发
压力的选择 营养、环境条件

工 ②随机分离法

菌 种
抗生素产生菌的分离:如抑菌圈法、稀释法、
的 分
扩散法、生物自显影法
离 筛
酶抑制剂产生菌的分离 体外
选 抗病毒药物产生菌的分离 噬菌斑
发 酵 工 程 — 菌种
6.发酵性能测定
二 、
对筛选出的菌种进行生产性能测定。这些特
发 酵 工
菌 种
须非常谨慎,要避免化学诱变剂与皮肤接触,
选 育
且切勿吸入其蒸气,有人对某些诱变剂极其
常 敏感,甚至未直接接触就会过敏,这就更要
规 当心。


发 酵 工 程 — 菌种
诱变剂的选择
①碱基类似物和羟胺具有很高的特异性,但
三 、
很少使用,回复突变率高,效果不大。
优 良 菌
②亚硝酸和烷化剂应用的范围较广,造成的 遗传损伤较多。其中亚硝基胍和甲基磺酸乙
三 前体或产品的耐受力。
、 优
(4)抑制或消除产品分解酶。
良 菌 种
(5)改进菌种外泌产品的能力。 (6)消除代谢产品的反馈抑制。


发 酵 工 程 — 菌种
具体来讲,有以下途径:
㈠提高特定基因的表达水平
三 、
(1)引入强转录及翻译信号,可通过在一高效
优 良 菌
表达载体上克隆靶基因;在靶基因的上游引 入强启动子;修改现有表达信号,提高基因
二、发酵工业菌种的分离筛选
二 、
典型步骤:样品采集→样品预处理→目标菌 富集→初筛→复筛→发酵性能测试→菌种鉴
发 酵
定→菌种保藏

业 菌

工业发酵菌种选育

工业发酵菌种选育

2、发酵工业菌种的分离筛选
工业生产对菌种的要求
(1)能在廉价原料制成的培养基上生长,且生成的目的产 物产量高、易于回收; (2)生长较快,发酵周期短; (3)培养条件易于控制; (4)抗噬菌体及杂菌污染的能力强; (5)菌种不易变异退化,以保证发酵生产和产品质量的稳 定; (6)对放大设备的适应性强; (7)菌种为非病原菌,不产生任何有害的生物物质和毒素。
问题?
1、如何控制营养成分,分离自养型微生物、固氮菌、纤 维素酶菌、几丁质酶菌? 2、如何控制培养基pH 分离产柠檬酸的黑曲霉? 3、分离放线菌、细菌、霉菌时,选择哪些抑制剂? 4、在培养基中添加去氧胆酸钠的作用是什么?厌氧培养 中加入焦性没食子酸与NaOH的作用是什么? 5、如何分离芽孢菌?
2.2.5 筛 选(生产能力的考察)
从自然界获得菌种的基本过程
采样
(P15)
预处理
富集培养
菌种分离
初筛和复筛
性能鉴定
菌种保藏
2.2.1 样品采集
总原则是:
(1) 样品来源越广,获得新菌种的可能性越大;
(2)要了解目标产物的性质和可能产目标产物的
微生物种类及其生理特征。
①了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本相同,但通常丝 状菌及产芽孢细菌才能进行次级代谢。
②考虑微生物的生理特征。如营养类型、生长环境等。
1 ) 土样选择 酵母菌 果园 产蛋白酶菌 鱼、肉加工厂 高温酶产生菌 火山或温泉 耐压菌 油井或海洋深处 纤维素酶 森林
2)采土方式:在选好适当地点后,用小萨子除去 表土,取离地面5-25cm处的土约10-25g,盛入无 菌的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,标记,记录采 样时间、地点、环境条件等,以备查考。
(2)酶合成的阻遏

发酵工业菌种选育 菌种保藏方法

发酵工业菌种选育 菌种保藏方法
保护剂
保存期:4℃冰箱,保存5~10年适用:广泛缺点:繁琐,设备技术要求高
低温保藏法
真空冷冻干燥保藏法
保存期:-150℃~-169℃,保存15年适用:最为广泛优点:高效缺点:购置设备、费用高
干燥-载体保藏法
干燥-载体保藏法
寄主保藏法、基因工程菌保藏法
此方法适用于一些难以用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。
基因工程菌的保藏法
寄主保藏法
取细菌培养物,加入灭菌甘油(甘油应在1.034×105Pa高压下蒸汽灭菌20min),振荡培养物使甘油分布均匀,然后转移至标记好的、带有螺口和空气密封圈的保存管内,在乙醇-干冰或液氮中冻结后转至-70℃长期保存。复苏菌种时,用灭菌的接种针刮拭冻结的培养物表面,然后立即把黏附在接种针上的细菌划于含适当抗生素的LB琼脂平板表面于37℃培养过夜。
01
02
03
缺点:存活率低
矿物油浸没保藏法
矿物油浸没保藏法
悬液保藏法
原理
保藏时间
适用
悬液保藏法
寡营养保藏,是将微生物混悬于不含养分的媒液中,如蒸馏水、生理盐水、0.25mol/L磷酸缓冲液(pH6. 5)等,加以保藏的方法。
1年左右
大部分的放线菌、酵母菌、霉菌以及肠道科细菌等
真空冷冻干燥保藏法
2. 工业发酵菌种的选育
2.3.3 菌种保藏方法
斜面保藏法
斜面保藏法
适用:细菌、放线菌、酵母菌
保存期:1~6个月
条件:4℃冰箱,相对湿度50%~70%
影响因素:培养基和培养条件
优点:简单、成本低,随时观察菌株性状
缺点:自发突变、染:数年
适用:产孢子或形成孢芽的微生物

发酵工业菌种

发酵工业菌种

I
II
无试样时(不含棒酸时),I对II菌作用不大 有试样时(含棒酸时),I对II菌恢复药效,棒酸抑制水解酶活性
试验菌
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
菌种不易变异退化; 对放大设备的适应性强; 菌种不是病原菌,不产生任何有害的生
物活性物质和毒素。
1. 筛选的两种指导思想
先分离纯化,再结合工艺要求进行筛选。 分离纯化同时富于筛选条件,一步得出所需菌株。
结果有两种可能:
▪ 获得适于工业发酵菌株 ▪ 只获得选育所需的出发菌株
2.分离筛选工作在实际中应用的几个方面
选择性分离
无选择性特征 根据产物的特征进行
随机分离
▪ 选择性分离的关键:生长培养条件的选择与控 制,从而实现定向富集筛选。
选择性分离原理和技术
生长条件的选择与控制原理 控制营养成分 控制培养基酸碱度 添加抑制剂 控制培养温度 控制通气条件
选择性分离技术 富集液体培养技术 施加选择压力,进行定向筛选 固体培养技术
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板(copy 法)
平板培养,其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落
随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离)
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
含微生物样品的采集

工业常用酵母菌种及生产概况

工业常用酵母菌种及生产概况

工业常用酵母菌种及生产概况酵母产业的发展史随着人类社会的发展和科学技术水平的提高,酵母的生产水平不断提高,生产规模逐步扩大,产品的品种也从单一的面包酵母发展到酿酒用酵母、特种酵母等多种。

目前工业常用酵母菌种:酒精酵母、啤酒酵母、假丝酵母、红酵母、面包酵母、药用酵母。

主要用途:生产酒精、啤酒、石油发酵、脱蜡、制取蛋白质、生产脂肪。

从酵母在人类历史的发展过程中的作用来看,可以分为三个阶段。

第一是利用啤酒和酒精生产副产物-废酵母的阶段。

在专业的活性酵母生产厂建立以前,人们就开始用烤面包所剩余的面团,即俗称“老酵”进行面团的发酵。

长期以来,人们一直利用啤酒生产中产生的废酵母泥用于发面,制作发面食品。

但是由于新鲜的啤酒酵母泥不易保存,且易发生腐败变质,加上运输和使用的问题,因此该产品的商品化受到很大的限制,人们开始致力于寻找使啤酒酵母活性保持更为持久的方法。

第二是专业化商品酵母生产的阶段。

1846年,在奥地利维也纳建立了世界上第一个酒精酵母生产厂,同时生产酒精和压榨酵母。

从19世纪末至20世纪中期约50年期间,压榨酵母的生产在欧洲得到了快速的发展,生产工艺和生产装备逐步完善,生产原料从粮食改为废糖蜜,使面包酵母的生产水平大幅度提高。

在此期间,荷兰、德国、奥地利等国家建立了一些专门生产面包酵母的工厂,使活性酵母的生产得到了迅速的发展,基本上形成了一套较为完整的酵母生产工艺。

该时期内,生产的面包酵母的产品以鲜酵母为主,是具有活性的压榨酵母,含水分70%~73%。

为了保持它的发酵活性,需要在低温下运输和贮藏,因而保存期较短。

第三是活性干酵母产业的发展阶段。

从20世纪20年代开始至今,随着生物化学、遗传工程和机械制造等学科的发展,酵母生产技术和生产装备的水平迅速提高。

从20世纪60年代开始,随着酵母活性保护剂的研发成功、生物制品干燥技术的进一步成熟和提高,加上采用真空或充氮气包装,活性干酵母产品的质量明显提高。

20世纪60年代末,荷兰Gist公司首先开发成功并生产出发酵活性高、保质期长、可直接与面粉混合制成面团的干酵母,产品被称为高活性干酵母,发酵活性一般可以保持在1~2年。

发酵工程--第三章-工业微生物的菌种选育PPT优秀课件

发酵工程--第三章-工业微生物的菌种选育PPT优秀课件
22
3、组成型突变株的筛选
在酶制剂的发酵生产中,常采用在发酵过程中分 批限量加入诱导物的方法,提高诱导酶的活性,为了 解除对诱导物的依赖,可通过诱变改变菌种的遗传特 性,筛选组成型突变株。突变发生在调节基因或操纵 基因,都可获得组成型突变株。
筛选的方法是设计某种有利于组成型菌株生长, 并限制诱导型菌株生长的培养条件,造成组成型菌株 生长的优势或适当的分辨两类菌落的方法,选出组成 型突变菌株。
• 3)工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)
中国食品发酵工业科学研究院,北京,(IFFI)
• 4)医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)
中国医学科学院皮肤病研究所,南京; 卫生部药品生物制品检定所,北京;中国医学科学院病毒研究所
• 5)抗生素菌种保藏管理中心(CACC)
中国医学科学学院抗生素研究所,北京 四川抗生素工业研究所,成都 华北制药厂抗生素研究所,石家庄
• ③ 菌种的保藏: 一切生产菌种 都要使它避免死亡和生产性能的下降, 这是菌种保藏工作的任务。
• ④ 退化菌种的复壮: 如果发现 菌种的生产性能下降,就要设法使它 恢复,这便是菌种复壮工作的任务。
一、工业微生物的菌种选育的原因
1 天然菌种生产能力低 2 生长繁殖过快
二、菌种选育的目的:改良菌种的特性,使其符合工
23
第三节 杂 交 育 种 技 术
杂交育种:一般是指两个不同基因型的菌 株通过接合或原生质体融合使遗传物质重 新组合,再从中分离和筛选出具有新性状 的菌株。
理论基础-基因重组 操作方法复杂、技术要求较高,因此推广和应用受到
一定程度的限制。

第四节 分子育种
分子育种:在分子水平上,根据需要,用 人工方法取得供体DNA上的基因,在体外重 组于载体DNA上,在转入受体细胞,使其复 制、转录和翻译,表达出供体基因原有的 遗传性状

发酵工业菌种.

发酵工业菌种.

酿酒酵母
假丝酵母
红酵母
(3)霉菌 是一群在营养基质上形成绒毛状、网状、 絮状菌丝真菌的通称。分布于偏酸性环境中, 常用的有根霉、毛霉、青霉等
根霉
曲霉
青霉
(4)放线菌 因其菌落呈放射状而得名。属原核微生物 类群。分布于有机质丰富的微碱性环境中,大 多腐生,少数寄生 。最大价值在于能生产多 种抗生素,从微生物中发现的抗生素有60%以 上的是来自于放线菌。 常用的有链霉菌属、小单孢属等。
分离某种产生有机酸的菌株时,也通常采用 透明圈法初筛
在选择培养基中加入碳酸钙,使平板呈混浊 状,产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解,形 成清晰的透明圈

透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的 依据,因为在深层培养中的产酶单位与平板 上圈的大小之间并不完全成正比。
但作为初筛的手段是有意义的
2.2.2 样品的预处理 预处理可提高菌种的分离效率,常使 用的方法有: (1) 物理方法: ① 热处理:常用来减少样品中的细菌数。 ② 膜过滤和离心法:用来浓缩水中的微生 物细胞。 (2) 化学方法: 在培养基中添加某些化学成分来增加 特定微生物数量。
(3)诱饵法: 将一些固体物质加到待分离的土壤或 水中做成诱饵富集目的菌。 2.2.3 富集培养 利用不同微生物生长繁殖对环境和营 养的要求不同,投其所好取其所抗,使目 的菌成为人工环境下的优势菌。
①了解微生物的代谢规律。如初级代谢基本 相同,但通常丝状菌及产芽孢细菌才能进 行次级代谢。 ②考虑微生物的生理特征。如营养类型、生 长环境等。
1 土样选择 如酵母菌 果园 产蛋白酶菌 鱼、肉加工厂 高温酶产生菌 火山或温泉 耐压菌 油井或海洋深处
2 采样深度 离地表5-25cm处较好。
3 季节条件 避免雨季,一般以秋季最理想。 4 采样方法 用无菌器具按规范取样,记录采样地 点、时间、环境情况等以备考证。

发酵工程-工业发酵常见菌种

发酵工程-工业发酵常见菌种

放线菌(链霉素四 环素;红霉素等)
真菌(青霉素、头孢等) 一些产芽孢的细菌
植物或动物来源
50、60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵,是发酵 工业发展历史上的一个转折点:
代谢控制发酵:用人工诱变的方法,有意识地改变微生物 的代谢途径,最大限度地积累产物,这种发酵形象地称为 代谢控制发酵,最早在氨基酸发酵中得到成功应用。
α—淀粉酶:黑曲霉、米曲霉、米根酶、枯草牙孢杆菌和 地 衣 牙 孢 杆 菌 , 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 , 嗜 热 脂 肪 芽 孢 杆 菌 -----GB2760-2011
(一)原核生物:大肠杆菌(1977年Boyer)、芽孢杆菌、 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高; 表达蛋白的纯化、分离及分析快速; 外源基因的导入相对容易; 已建立了整套表达理论及技术 操作简单,费用低廉
(二) 真核细胞表达系统 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速,营养要求不高,易培养; 安全性好; 比哺乳动物细胞操作简单; 具有一定的修饰蛋白的能力; 理想的分泌型表达载体
与抗生素生产有关 与氨基酸生产有关的微 与酶制剂生产有
的微生物
生物
关的微生物
大约80%抗生素来 源于放线菌,而这 些放线菌大多是链 霉菌,其他来源于 霉菌和细菌。
AK:天冬氨酸激酶 HD:高丝氨酸脱氢酶 HT:高丝氨酸转乙酰酶
氨基酸生产菌的要求:代谢途径比较清楚, 代谢途径比较简单
谷氨酸发酵的菌种: 棒杆菌属,短杆菌属、节杆 菌属或小杆菌属的棒型细菌
其它氨基酸生产菌:常规菌种一般也是以谷氨酸生 产菌选育而成;工程菌,大肠 杆菌,枯草芽孢杆菌
开发一个新酶,都要经过一系列研究的毒理试验。关于食 品用酶,美国需要得到FDA的批准。目前已同意使用的仅 仅少数微生物能用于生产食品用酶。

发酵工业菌种PPT课件

发酵工业菌种PPT课件

随机分离方法
(用筛选方案- 检测系统进行间接分离)
富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛)
菌种纯化
复筛
菌种纯化
初步工艺条件摸索
再复筛 生产性能测试
较优菌株1-3株
保藏及进一步做生产试验 或作为育种的出发菌株
某些必要试验和 毒性试验等
含微生物样品的采集
采样时应注意的问题: 土壤微生物的分布 采土深度 土壤植被情况 采样季节 土壤的酸碱度
.
1
本章内容
一、发酵工业菌种筛选的原则与基本技术 二、发酵工业菌种改良
.
2
一、发酵工业菌种分离筛选原则与基本技术
(一)发酵工业菌种筛选的总趋势与要求 (二)分离筛选原理与技术 (三)应用举例
.
3
1. 菌种选择的总趋势
野生菌→变异菌 自然选育→代谢控制育种 诱发基因突变→基因重组的定向育种
金黄色葡萄球菌209p 枯草杆菌6633 大肠杆菌 耻垢分枝杆菌607 白色念珠菌 青霉菌
代表微生物类型
革兰氏阳性球菌 革兰氏阳性杆菌 革兰氏阴性肠道细菌
结核杆菌 酵母状真菌 丝状真菌
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂,从而达到 治疗的目的。
筛选模型:目标酶
.
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生长因子产生菌的筛选
筛选模型:营养缺陷型试验菌 筛选方法:利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
.
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氨基酸产生菌的筛选
样品
预处理
初筛(除真菌)
在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板(copy 法)
平板培养,其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落

工业微生物菌种

工业微生物菌种
• 顺序诱导:即先合成能分解底物的酶,再依次合成分解 各中间代谢物的酶,以达到对较复杂代谢途径的分段调 节。
2 阻遏
• 定义:在微生物的代谢过程中,当代谢途径中某末
端产物过量时,阻碍代谢途径中包括关键酶在内的一系 列酶的生物合成,从而更彻底地控制代谢和减少末端产 物的合成。
• 阻遏作用有利于生物体节省有限的养料和能量。
(2)优先合成 Met比Thr、Lys优先合成,Thr比Lys优先合 成
(3)代谢互锁 在乳糖发酵短杆菌中,Lys分支途径的初始 酶二氢吡啶-2,6-二羧酸合成酶受Leu的反馈阻遏。
(4)平衡合成 天冬氨酸和乙酰CoA的平衡合成
(5)Asp和Glu之间的调节
(6)在谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌等微生物中,天冬氨酸 激酶是单一的,并受Lys和Thr的协同反馈抑制。反馈调节易 于解除,使育种简单化,故常用作氨基酸发酵育种的出发菌 株
3. 控制代谢物流向:( 通过酶促反应速度来调节)
1)可逆反应途径由同种酶催化,可由不同辅基或辅酶控制代 谢物流向:如: 两种Glu脱氢酶:以NADP为辅基 Glu合成
以NAD为辅基 Glu分解 2)通过调节产能代谢速率。 3) 通过调节酶的活性或酶的合成量。 关键酶: 某一代谢途径中的第一个酶或分支点后的第一个酶。
1.控制营养物质透过细胞膜进入细胞
如:只有当速效碳源或氮源耗尽时,微生物才合 成迟效碳源或氮源的运输系统与分解该物质的酶 系统。
2.通过酶的定位控制酶与底物的接触
1)真核微生物酶定位在相应细胞器上;细胞器 各自行使某种特异的功能;
2)原核微生物在细胞内划分区域集中某类酶行 使功能:
➢与呼吸产能代谢有关的酶位于膜上; ➢蛋白质合成酶和移位酶位于核糖体上; ➢同核苷酸吸收有关的酶在G-菌的周质区。

工业发酵菌种选育

工业发酵菌种选育

问题?
1、如何控制营养成分,分离自养型微生物、固氮菌、纤 维素酶菌、几丁质酶菌? 2、如何控制培养基pH 分离产柠檬酸的黑曲霉? 3、分离放线菌、细菌、霉菌时,选择哪些抑制剂? 4、在培养基中添加去氧胆酸钠的作用是什么?厌氧培养 中加入焦性没食子酸与NaOH的作用是什么? 5、如何分离芽孢菌?
2.2.5 筛 选(生产能力的考察)
化学诱变剂中使用最多、最有效的是烷化剂。
使用化学诱变剂的优缺点: 就突变数量而言,要比电离辐射更有效。 选用最适剂量,充分利用复合处理的协同效应。
Mutation
Via chemical or physical, and biological means
(2)诱变剂的选择
1)碱基类似物和羟胺具有很高的特异性,但很少使用,回 复突变率高,效果不大。 2)亚硝酸和烷化剂应用的范围较广,造成的遗传损伤较多。 其中亚硝基胍和甲基磺酸乙酯常被称为“超诱变剂”,甲 基磺酸乙酯是毒性最小的诱变剂之一。 3)吖啶类诱变剂可以造成生化代谢途径的完全中断。 4)紫外线仍十分有效。电离辐射是造成染色体巨大损伤的 最好诱变剂,它能造成不可回复的缺突变。但它可能影响 邻近基因的性能。
2.2.2 样品的预处理
目的:提高菌种的分离效率。 (1) 物理方法: 热处理:常用来减少样品中的细菌数。 ①膜过滤和离心法:用来浓缩水中的微生 物细胞。 (2) 化学方法: ② 在培养基中添加某些化学成分来增加特定微 生物数量。 (3)诱饵法: 将一些固体物质加到待分离的土壤或水中做 成诱饵富集目的菌。
1、酶合成的调节

酶量调节:粗,慢。
(1)酶合成的诱导作用
组成酶:细胞内总是适量存在的,不依赖于酶
底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。 诱导酶:依赖于酶底物或底物结构类似物的存 在而合成的酶。
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第三章发酵工业微生物菌种微生物发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种有用物质的现代工业,它是以培养微生物进行发酵为主。

而在这个过程中,优良的菌种是一个现代化的发酵工业必不可少的,最为重要的环节。

其他如先进的生产工艺和先进的设备,则是为了更充分发挥优良菌种的性能而设计的。

第一节工业微生物菌种的分离和选育第二节工业微生物菌种的改良第三节发酵工业中菌种的退化第四节工业微生物菌种的保藏第五节工业微生物菌种的扩大培养第一节工业微生物菌种的分离和选育一般来说,从自然界直接分离到的菌种,不能立即适应实际的生产需要,只有通过选育,才能提高代谢产物的产量、改进产品质量直至简化工艺。

在微生物发酵工业中生产菌种的选育方法有:•微生物菌种的分离和选育•菌种的改良第一节工业微生物菌种的分离和选育一、微生物菌种的选育二、微生物常规育种三、根据代谢的调节机理选择高产突变菌株一、微生物菌种的选育从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤:1、采样2、增殖培养3、纯种分离4、性能测定1、采样采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等,进行综合、具体地分析来决定。

如果不了解某种生产菌的具体来源,一般可以从土壤中分离。

①、确定选好地点取离地面5——15cm处的土壤几十克,盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中,扎好,记录采样时间、地点、环境情况等,以备查考。

②、尽快分离一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌孢子忍耐不良环境能力较强,不太容易死亡。

但一般应尽快分离。

③、酵母菌或霉菌类微生物采样酵母菌或霉菌类微生物,它们对碳水化合物的需要量比较多,一般又喜欢偏酸环境,所以在普通植物花朵、瓜果种子及腐植质等上面比较多。

2、增殖培养收集到的样品,如含有所需的菌种较多,可直接进行分离。

如果样品含有所需要的菌种很少,就要设法增加该菌种的数量,进行增殖(富集)培养。

富集培养:富集培养就是指利用不同微生物之间的生命活动特点的不同,制定出特定的环境条件,使仅仅适应于这种条件的微生物旺盛生长,从而使其在群落中的数量大大增加的微生物的分离方法。

人们能够利用这种方法很容易地从自然界中分离到所需要的特定微生物。

富集的条件可根据所需分离的微生物特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择,如温度、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。

3、纯种分离通过增殖培养还不能得到微生物单一的纯种,有必要进行分离纯化,来获得纯种。

这是因为生产菌种在自然条件下通常是与各种菌混杂在一起的。

纯种的分离方法很多,常用的有划线法和稀释法。

①、划线法①、划线法——是将含有菌样的样品在固体培养基表面作有规则的划线培养。

•扇形划线法、•方格划线法•平行划线法等菌样经过多次从点到线的稀释,最后经培养得到单菌落。

②、稀释法。

是通过不断地稀释使被分离的样品分散到最低限度,然后吸取一定量注入平板,使每一微生物都远离其他微生物而单独生长成为菌落,从而得到纯种③、两种方法的比较③、两种方法的比较•划线法简单较快;•稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀,获得纯种的机率大,特别适宜于分离具有蔓延性的微生物。

为了提高筛选的工作效率,除增殖培养时应控制增殖条件外,在纯种分离时,培养条件对筛选结果影响也很大,一般可通过:•控制营养成分•调节培养基PH•添加抑制剂•改变培养温度•通气条件•热处理等来提高筛选效率。

4、生产性能的测定①、初筛②、复筛——由于纯种分离后,得到的菌株数量非常大,如果对每一菌株都作全面或精确的性能测定,工作量就特别繁杂。

因此可适当简化,一般采用两步法经过多次重复筛选,直至获得1——3株较好的菌株,供发酵条件的摸索和生产试验,进而作为育种的出发菌株。

这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株。

以区别于用人工育种方法得到的变异菌株。

一、微生物菌种的选育二、微生物常规育种三、根据代谢的调节机理选择高产突变菌株二、微生物常规育种一)、微生物诱变育种的机理1、突变的概念2、诱变育种的主要环节3、诱变育种的优缺点1、突变的概念——微生物中可遗传的特性发生的变化称为变异,也叫突变。

这种突变是微生物产生变种的根源,同时也是育种的基础。

根据突变发生的原因可以分为1)、自然突变——自然突变是指在自然条件下出现的基因突变。

2)、诱发突变——诱发突变是指用各种物理和化学因素人为地使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化。

人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱,它的缺点则是缺乏定向性。

2、诱变育种的主要环节①、处理悬浮液用合适的诱变剂处理大量而分散的微生物细胞悬浮液(细胞或孢子),在引起绝大多数的细胞致死的同时,使存活个体中DNA结构变异频率大幅度提高;②、选育优良菌株用合适的方法淘汰负效应变异株,选出极少数性能较优良的正变异株,以达到培育优良菌株的目的。

3、诱变育种的优缺点1)、优点(1)、菌种的特性方面①、提高菌株的生产能力;②、改进产品的质量;③、扩大品种;④、简化工艺。

(2)、育种的方法方面①、速度快;②、收效显著;③、方法简便由于上述特点,在育种工作和生产实践中都得到了广泛的应用。

目前,发酵工业中的生产菌,绝大部分都是经过诱变的改良菌种。

2)、缺点①、诱变育种缺乏定向性;②、工作量大;③、诱变因素对某些菌种的作用不明显;④、对已是高产菌株进一步要提高产量仍较困难。

三)、诱变育种程序的要点1、出发菌株的选择①、从自然界分离得到野生型菌株;②、通过生产选育的菌株;(即由自发突变经筛选得到的菌株)③、已经诱变过的菌株。

(这类菌株作为出发菌株较为复杂)2、菌悬液制备要求①、一般采用生理状态一致的单细胞或孢子进行诱变处理;(用选择法或诱导法使微生物同步生长)②、一般处理细菌的营养细胞;(采用生长旺盛的对数期,变异率较高而且重现性好)③、一般处理霉菌的孢子悬浮液;(因为霉菌的菌株往往是多核)④、一般处理刚刚成熟时的放线菌孢子(此时的变异率比较高)⑤、细菌和放线菌的处理浓度为108个/ml; 真菌的处理浓度为106个/ml.3、前培养一般在诱变处理前,将细胞在添加有嘌呤、嘧啶等碱基的培养基中培养20——60分钟,再进行诱变处理,效果很好。

4、诱变剂的选择能诱发基因突变并使突变率提高到超过自然突变水平的物理、化学因子都称为诱变剂•物理诱变剂•化学诱变剂①、物理诱变剂——主要有各种射线,如X射线、γ-射线、α-射线、β-射线和超声波等。

其中紫外线应用最广。

因为紫外线的光谱正好与细胞内的核酸的吸收光谱相一致,因此在紫外光的作用下,能使DNA链断裂、DNA分子内和分子间发生交联,从而导致菌体的遗传性状发生改变。

②、化学诱变剂——化学诱变剂的种类非常的多,常用的有•甲基磺酸乙酯(EMS)•亚硝基胍•亚硝酸等它们作用于微生物细胞后,能够特异地与某些基团起作用,即引起遗传物质的原发性损伤和细胞代谢方式的改变,失去亲株原有的特性。

并建立新的性状。

5、变异菌株的分离和筛选通过诱变处理后,在微生物群体中会出现各种突变型的个体,但其中多数是负突变体。

因此要全力选出适合人们需要的优良菌株,一般分为初筛、复筛两个阶段。

初筛以量为主,复筛以质为主。

1)、初筛方法①、根据形态变异淘汰低产菌株某些菌落形态与生产性能有直接的相关性,可以在平皿上直接筛选。

如在灰黄霉素生产菌的选育中,菌落暗红色变深者的,产量就提高。

由此做为指标性状可以直接筛选。

②、根据平皿反应直接挑取高产菌株所谓平皿直接反应就是指每个菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物作用后的变色圈或透明圈等,可以表示菌株的生产活力的高低,因此,可以作为初筛的标志性状。

2)、复筛方法营养缺陷型的筛选方法①、营养缺陷型筛选②、淘汰野生型菌株③、营养缺陷型菌株检出几个重要的概念a、基本培养基b、完全培养基c、补充培养基d、野生型e、营养缺陷型f、原养型a、基本培养基(MM minmimal medium)仅能满足某种微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基,又称为基本培养基。

用符号[—]表示。

b、完全培养基(CM,complete medium)凡是可以满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。

用符号[+]表示。

c、补充培养基(SM,supplementa medium)凡是只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。

用符号[A]或[B]表示。

d、野生型从自然界分离到任何微生物在其发生营养缺陷突变前的原始菌株。

e、营养缺陷型野生型菌株经诱变处理后,由于发生了丧失某种酶合成能力的基因突变类型,这种类型称为营养缺陷型。

只能在加有该酶合成产物的培养基中才能生长。

f、原养型一般指营养缺陷型突变株经修复(回变)或重组后产生的菌株类型。

其营养要求与野生型相同。

①、营养缺陷型筛选•诱变•经过中间培养•淘汰野生型•检出营养缺陷型•确定生长谱等步骤中间培养的目的是减少以后筛选中再产生分离子,其培养基用完全培养基或补充培养基,并且培养过夜。

②、淘汰野生型菌株在诱变后的存活个体中,营养缺陷型的比例一般较低,通常只有百分之几至千分之几。

通过抗生素法或菌丝过滤法就可以淘汰为数众多的野生型菌株,从而达到“浓缩”营养缺陷型的目的。

•抗生素法•菌丝过滤法•差别杀菌法•饥饿法等如果当诱变后的缺陷型数量较大时,也可省去中间培养法和影印接种法。

以便得到浓缩的缺陷型菌株。

•抗生素法A、青霉素法主要适用于细菌。

其原理是青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成,因而能杀死生长繁殖着的细菌,但不能杀死休眠状态的细菌。

如果将诱变后的细菌培养在含有青霉素的基本培养基中,就可淘汰大部分生长繁殖活跃的野生型细胞,从而达到“浓缩”营养缺陷型细胞的目的。

B、制霉菌素法适合于真菌。

制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用,从而引起细胞膜的损伤。

因为它只能杀死生长繁殖着的酵母或霉菌,所以也可用于淘汰相应的野生型菌株和“浓缩”营养缺陷型菌株。

•菌丝过滤法菌丝过滤法是利用在基本培养基中,野生型的孢子能发芽成菌丝,而营养缺陷型的孢子则不能原理进行筛选的方法。

适合于丝状生长的真菌或放线菌。

将诱变后的孢子在基本培养基中培养一段后,再用擦镜纸等合适的滤纸过滤,就可去除大部分的野生型个体,从而达到“浓缩”目的。

③、营养缺陷型的检出检出营养缺陷型的方法很多A. 夹层培养法B. 限量补充培养法C. 逐个检出法D. 影印接种法❑经过了平皿初筛、确定了营养缺陷型或其他标记的变异性状❑进行发酵试验,检查其生产性状❑经过生长性状比较,再做平行试验比较,并结合生产的其他因素考虑,就可确定用于生产或进一步改良的诱变菌株,进行保藏或扩大试验,直至用于生产。

三、根据代谢的调节机理选择高产突变株一)、微生物代谢调节的主要途径二)、育种方法一)、微生物代谢调节的主要途径1、酶合成诱导2、酶合成阻遏3、酶活力的调节二)、育种方法1、选育不需要诱导物的组成型产生菌2、筛选抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株3、选育营养缺陷型4、筛选负突变菌株的回复突变株5、选育条件抗性突变株6、筛选细胞膜通透性改变的突变株7、筛选抗生素抗性突变株1、选育不需要诱导物的组成型产生菌通过诱变,使调节基因发生突变,不产生有活性的阻遏蛋白,或者操纵基因发生突变不再能与阻遏物相结合,就可获得组成型的突变株。

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