分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验方法与步骤
表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
分子生物学的实验技巧
分子生物学的实验技巧分子生物学作为生物科学的重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其相互作用关系。
合理的实验技巧对于分子生物学的研究至关重要。
下面将介绍几种常用的实验技巧及其操作方法。
一、PCR技术PCR（聚合酶链反应）是分子生物学研究中最常用的技术之一，它能够高效地扩增目标DNA序列。
PCR反应的关键步骤包括：DNA变性（Denaturation）、引物结合（Annealing）和DNA合成（Elongation）。
实验中，我们需要准备好所需的试剂和设备，确保实验台和试管清洁，以避免污染。
同时，掌握好反应温度、时间和引物浓度等重要参数的选择，能够确保PCR反应的成功。
二、凝胶电泳技术凝胶电泳是常用的DNA分子大小分析方法，能够通过电场作用将DNA样品分离出来。
在实验中，我们首先需要准备好凝胶，常用的有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
然后，根据需要选择合适的电泳缓冲液，并将待测样品与DNA标记物一同加入凝胶槽中。
接下来，通过给电极施加电压，使DNA在凝胶中迁移。
最后，通过染色或荧光检测等方法，可可视化目标DNA条带。
当我们操作凝胶电泳时，要注意电流的选择、运行时间和电泳条件的控制，以确保分离结果的准确性。
三、蛋白质SDS-PAGE技术蛋白质的分离与鉴定也是分子生物学研究中的重要内容之一。
其中，SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是最常用的方法之一。
在进行SDS-PAGE实验时，首先需要准备好聚丙烯酰胺凝胶，根据需要选择合适的凝胶浓度和电泳缓冲液。
接着，将蛋白样品与还原剂和SDS缓冲液混合，然后进行样品沸腾变性。
之后，将样品加载到凝胶孔中，施加电压进行电泳。
最后，可以通过染色或Western blot等方法对蛋白进行检测与分析。
四、基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学研究中常用的技术之一，它可用于构建重组DNA分子。
在进行基因克隆实验时，需要首先将目标基因进行PCR扩增，然后进行限制性内切酶切割，得到目标基因的载体和酶切后的DNA片段。
分子生物学实用技术实验操作教程
实验一 CTAB法提取植物基因组总DNA及分析一、实验目的分离纯化植物DNA是植物分子生物学和基因工程的基本技术要求，CTAB法是提取植物基因组DNA的一种新型方法，可以抽提许多其它方法难以抽提的植物材料（如含多酚较多的植物材料、干燥后的茶叶、老树根等）中的DNA，得率高，质量好，用于PCR、Southern杂交、分子标记、DNA文库构建等。
二、基本原理植物材料在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁，游离出细胞器和原生质，并防止DNA降解。
采用CTAB （十六烷基三甲基溴化胺，一种非离子型去污剂）抽提液抽提（65℃）上述研磨物，在高盐条件下不但溶解细胞膜相物质，而且CTAB与核酸形成可溶性的复合物，采用离心可以将变性的蛋白质和多酚、多糖等杂质（沉淀相）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质。
直接向水相中加入异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，吸出核酸沉淀团经过多次乙醇漂洗和沉淀、TE溶解得到DNA粗提物。
粗提的DNA一般可用于粗略PCR等。
用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应进一步纯化。
用RNase水解RNA，用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提去除蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。
三、实验材料甘蓝型油菜(Brassica napus L.)幼叶。
四、主要仪器设备及耗材Eppendorf 5804R低温离心机，Hettich Universal 32R低温离心机，Eppendorf Minispin离心机，Sanyo SIM-F124制冰机，TOMY SS-325自动灭菌锅，Millipore Elix纯水系统，Eppendorf research微量移液器系列，GingTian JA2003A电子天平，Satorius PB-10 pH计，HH·S21-4-S恒温水浴锅，UVP GDS8000自动高效紫外透视成像仪，DYY-8C型双稳定时电泳仪及水平电泳槽，Gene spec I快速核酸蛋白自动分析仪，长岭BCD-239家用冰箱，TNZ-30-50液氮生物容器及液氮，微波炉，研钵，离心管（15ml、1.5ml），枪头（10、200和1000μl），两面板，枪头盒，离心管盒（1.5ml）等。
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南
大学生物教案：分子生物学实验的操作指南1. 引言本指南旨在提供大学生物专业的教师和学生们关于分子生物学实验的具体操作步骤与技巧。
分子生物学是现代生命科学研究中至关重要的一部分，通过实验操作可以加深对分子级别生命现象的理解。
在这个指南中，我们将介绍几个常见的分子生物学实验，并提供详细步骤以及相关注意事项。
2. 实验1：DNA提取2.1 实验原理在本节中，我们将介绍DNA提取实验的基本原理和背景知识。
这包括了DNA 提取方法、材料准备和实验目标等内容。
2.2 实验步骤•样品准备：选择适当来源（如水果、血液等）并根据实验要求进行预处理。
•细胞破碎：使用细胞裂解缓冲液和搅拌器将样品细胞破碎。
•DNA沉淀：添加盐和酒精使DNA沉淀出来，并用无菌水洗涤。
•DNA溶解：使用缓冲液溶解沉淀的DNA。
2.3 注意事项•材料应严格按照实验要求选用，确保实验结果的可重复性。
•使用无菌操作技巧以避免外源性DNA污染。
•注意个人安全，佩戴实验室所需的防护装备。
3. 实验2：PCR扩增反应3.1 实验原理在本节中，我们将介绍PCR（聚合酶链式反应）扩增反应的原理和背景知识。
这包括了PCR技术的基本原理、引物设计和酶选择等内容。
3.2 实验步骤•反应体系准备：根据实验目标计算并配置PCR反应所需的试剂和底物。
•DNA模板制备：提取样品中的DNA，并以适当浓度加入到PCR反应中。
•PCR反应设置：配置好PCR反应管，包括引物、酶和缓冲液等。
•PCR条件设定：根据要扩增的序列特点合理设定温度和时间参数。
3.3 注意事项•注意使用不同样本DNA之间相互污染的可能性，避免交叉污染。
•检查引物设计是否正确并符合预期扩增目标。
4. 实验3：凝胶电泳分析4.1 实验原理在本节中，我们将介绍凝胶电泳分析的原理和背景知识。
这包括了DNA迁移速度、凝胶类型选择和标记物设计等内容。
4.2 实验步骤•凝胶制备：根据实验需要配置适当浓度的琼脂糖凝胶。
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册
高中生物实验指南：分子生物学实验操作手册1. 简介分子生物学是研究生物体内分子结构、组成、功能以及相互作用的科学。
在高中生物学课程中，通过进行一系列分子生物学实验，可以加深对基因、DNA、RNA等内容的理解，并培养学生动手实践和科学探究的能力。
本操作手册将介绍一些适合高中副标准课程的基本分子生物学实验，帮助教师和学生更好地开展这方面的实验教学。
2. 实验一：提取DNA2.1 实验目的了解DNA的结构和提取过程，并掌握提取DNA的基本方法。
2.2 材料与仪器•成熟香蕉或其他植物材料•盐水溶液（含氯化钠）•蛋白酶（如葡萄胺酸酶）•洗涤剂（如洗衣粉）•咖啡滤纸或滤纸漏斗•烧杯•酒精1.将香蕉剥皮后放入砧板上，用刀将香蕉捣碎成泥状。
2.在烧杯中加入适量的盐水溶液，并将捣碎的香蕉放入其中搅拌均匀。
3.加入少量蛋白酶和洗涤剂，再次搅拌均匀，让细胞破裂释放DNA。
4.将混合物过滤到另一个烧杯中，通过滤纸除去大颗粒的残渣。
5.将过滤后的溶液倒入试管中，并缓慢地倾斜试管，在溶液与酒精接触的界面处，会出现白色粘稠物质，即提取到的DNA。
2.4 实验结果及分析实验中提取到的DNA呈现为白色细丝状物质。
通过这个实验可以观察到DNA 在水相和酒精相之间的界面上凝聚堆积。
说明了DNA在酒精中不溶性，从而便于提取。
3. 实验二：PCR扩增3.1 实验目的了解聚合酶链式反应（PCR）的原理和基本步骤，并能够进行PCR扩增实验。
3.2 材料与仪器•PCR试剂盒（含模板DNA、引物、聚合酶等）•热循环仪•PCR试管或反应管1.准备PCR反应体系，按照试剂盒说明书的要求加入模板DNA、引物和聚合酶等。
2.将装有反应溶液的PCR管放入热循环仪中。
3.设置PCR的温度程序，包括变性、退火和延伸阶段。
4.启动热循环仪开始PCR扩增反应。
5.完成PCR后，可以通过凝胶电泳等方法检测扩增产物。
3.4 实验结果及分析通过PCR扩增，可以在较短的时间内大量复制并放大目标基因片段。
现代分子生物学技术及实验技巧
现代分子生物学技术及实验技巧1 自由基技术自由基技术是分子生物学中的一种技术，它能够探测分子物质中的自由基浓度以及自由基的反应，从而深入研究分子物质的性质。
自由基技术采用的是自由基信号分子，通过对其进行观察或者对其进行探测和量化，可以了解分子物质的反应过程和分子物质中自由基的浓度。
2 聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应技术是一种分子生物学技术，是一种能够进行DNA 复制的技术。
聚合酶链式反应技术可以迅速扩增DNA片段，因此被广泛应用于DNA检验、生物工程、基因工程等领域。
聚合酶链式反应技术的原理是，在适当的酶和DNA单链片段存在的条件下，通过反复进行变性、退火和扩增等步骤，将DNA片段快速扩增至数量足够进行检验。
3 基因编辑技术基因编辑技术是一种通过人工干预改变生物个体基因组序列的技术。
基因编辑技术主要应用于基因治疗、育种、制药等领域，能够快速地对基因组进行编辑，从而改变生物的基因表达及特性。
现如今，基因编辑已经成为研究生命科学、探求生命本质的一项重要技术手段。
4 蛋白结晶技术蛋白结晶技术是一项关键提取遗传工程、药物研发和生物晶体学所需的蛋白质结晶技术，是在分子生物学中应用广泛的一种实验技术。
它可用于发现新药物、解决蛋白质功能、交互和酶学机制等多方面的问题，从而促进分子生物学、药学、生物技术、医药化学等领域的发展。
蛋白结晶技术的发展，对于建立高清晰度的蛋白质立体结构图库至关重要，对于发现生命科学的秘密有重要的作用。
5 特异性溶解曲线PCR技术特异性溶解曲线PCR技术是一种在PCR扩增反应中，通过检测DNA 的特征溶解温度来区分目标DNA和异质DNA的技术。
该技术结合了不需要胶回的扩增、高诊断准确性和高速度等优点，极大地提高了实验效率。
特异性溶解曲线PCR技术的应用使DNA的扩增和监测更加精确、简单和操作高效，可以广泛地应用于生命科学研究、临床试验等领域。
如何在实验室中进行精确的分子生物学实验
如何在实验室中进行精确的分子生物学实验实验室中的分子生物学实验需要严格的操作和准确的数据分析，这是保证实验结果可靠性的关键。
下面将从实验前的准备工作、实验中的操作方法和实验后的数据分析等方面介绍如何在实验室中进行精确的分子生物学实验。
一、实验前的准备工作1. 实验设计：在进行实验之前，首先需要设计一份合理的实验方案，该方案应包括实验目的、实验流程、实验时间等要素，确保实验过程中得到的数据可靠、有效。
2. 试剂准备：在进行实验前需要准备好所需的试剂，包括DNA/RNA提取试剂、酶反应试剂、PCR试剂等等。
试剂的准备应注意保证试剂质量和存储方式，避免损失和误操作。
3. 实验器材准备：实验需要用到的器材包括离心机、PCR仪、Gel电泳仪等，这些设备应在实验前进行测试和校准，确保其精度和准确性。
4. 操作规范：在操作实验器材之前，实验操作人员应仔细阅读试剂说明书，清楚操作流程，掌握严格的操作规范，确保实验的安全性和可靠性。
二、实验中的操作方法1. 样本提取：对于从动物、植物等细胞中提取DNA/RNA样本的实验，需要注意在样本提取过程中，避免污染和损失，确保提取到充分的DNA/RNA样本。
2. 酶反应：在进行酶反应实验时，应严格按照试剂说明书中所给出的酶浓度、反应时间和温度等参数进行操作，尽量避免试剂的过度稀释或过度浓缩，避免反应时间过长或过短，造成假阴性或假阳性现象。
3. PCR扩增：在进行PCR扩增实验时，应选择合适的引物和模板DNA，确保PCR反应能够扩增到目标片段。
此外，实验应避免PCR反应过度或过弱，尽量精确控制PCR反应时间和温度参数，排除可能出现的因条件偏差引起的误差。
4. Gel电泳：在进行Gel电泳实验时，应注意Gel制备工艺和电泳条件的稳定性。
Gel制备时，需要严格按照试剂说明书进行，避免Gel内均匀性不够和Gel析出不干净等问题。
电泳条件需要严格控制电压和时间，确保样品能够完整地出现在目标带位置，避免探测上的假阴性结果。
分子生物学实验的设计与操作技巧
分子生物学实验的设计与操作技巧引言：分子生物学在现代生物科学研究中占据重要的地位，其实验设计和操作技巧的高超与否直接影响研究结果的准确性和可重复性。
本文旨在分享一些分子生物学实验的设计与操作技巧，帮助读者在实验中取得较好的效果。
一、实验前的准备工作1. 设计实验方案：在进行分子生物学实验之前，首先需要明确实验的目的、研究问题和实验流程，并合理安排时间和资源。
2. 准备实验材料和试剂：根据实验方案确定所需的实验材料和试剂，例如DNA/RNA样本、引物、酶切剂、PCR试剂盒等，并确保其质量和储存条件良好。
3. 消毒和清洁：实验前需要对实验台面、仪器设备和实验用具进行消毒和清洁，以防止污染对实验结果的影响。
二、实验设计的要点1. 正、对照组的设置：在进行实验设计时，应考虑设置适当的正、对照组，以验证实验结论的准确性和可靠性。
2. 重复实验的次数：为了保证实验结果的可信度，应尽量增加实验的重复次数，统计分析实验结果的稳定性和可靠性。
3. 实验步骤的顺序和时序：在进行分子生物学实验时，应按照实验步骤的顺序和时序进行操作，确保实验各步骤的顺利进行，避免操作失误和结果偏差。
三、实验操作的技巧1. 分装试剂的技巧：在分装试剂时，应根据需要准确称量，并使用干燥、无污染的试剂瓶和量筒或量管，避免试剂损失或污染。
2. 样本的提取和纯化：样本提取和纯化是分子生物学实验中的重要一步，应选择合适的提取和纯化方法，并注意反应条件的控制和操作技巧的熟练程度，以提高样本的纯度和产量。
3. PCR反应的条件控制：PCR反应是分子生物学实验中常用的方法之一，应合理选择引物的设计和浓度，控制反应的温度、时间和循环次数，避免非特异性扩增或PCR产物的损失。
4. 凝胶电泳的操作技巧：在进行凝胶电泳实验时，应注意凝胶的制备和质量，选择合适的电泳缓冲液，并控制电泳条件，以得到清晰的电泳图谱。
5. 技术操作的规范化：在进行分子生物学实验时，应严格按照操作规范进行，注意实验操作的细节和步骤，避免引入外源污染和操作偏差。
考研生物学掌握分子生物学实验技巧
考研生物学掌握分子生物学实验技巧分子生物学实验技巧是考研生物学方向学习的重要内容之一。
掌握这些实验技巧不仅可以提高实验效果，还能够加深对分子生物学理论的理解。
本文将介绍一些常用的分子生物学实验技巧，并提供相关实验操作步骤。
一、核酸提取技术核酸提取是分子生物学研究中的基础步骤，是从生物样本中提取目标核酸的过程。
常用的核酸提取技术包括酚-氯仿法、盐法、离心柱法等。
以下以酚-氯仿法为例介绍核酸提取的步骤：1. 准备好待提取的生物样本，如细菌、真核细胞等。
2. 将待提取样本加入适量细胞破碎缓冲液中，充分破碎细胞膜，释放目标核酸。
3. 加入等体积的酚-氯仿混合液，轻轻摇晃离心管，使两相充分混合。
4. 离心，分离出上清液（含有核酸）和有机相（含有脂质和蛋白质）。
5. 将上清液转移至新的离心管中，加入异丙醇，使核酸沉淀。
6. 离心，去除上清液，加入70%乙醇洗涤核酸沉淀。
7. 离心，去除乙醇，空气干燥，使核酸沉淀完全干燥。
8. 加入TE缓冲液（含有EDTA），重溶核酸。
二、聚合酶链式反应（PCR）技术PCR技术常用于扩增DNA或RNA片段，通过对靶标序列的特异性扩增来检测其存在与否，进而实现基因检测、基因表达分析等。
以下是PCR技术的基本步骤：1. 准备好待扩增的DNA样本，配制PCR反应体系。
2. 加入适量的DNA模板、引物和聚合酶到PCR反应管中。
3. 开始PCR反应，依次进行Denaturation（解旋）、Annealing（退火）、Extension（延伸）等步骤，使DNA模板被扩增。
4. 反复进行PCR循环，通常进行30-40个循环。
5. 结束PCR反应，保存PCR产物用于后续实验。
三、蛋白质表达和纯化技术蛋白质表达和纯化是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于获得大量纯化的目标蛋白质。
以下是蛋白质表达和纯化的基本步骤：1. 根据需要，选取合适的宿主表达系统，如大肠杆菌、酵母等。
2. 构建重组表达载体，将目标蛋白质基因插入表达载体中。
分子生物学实验技巧总结
分子生物学实验技巧总结分子生物学是研究生物大分子结构、功能、合成和相互作用的一门学科，它利用一系列实验技术来解析生物体内的基因、蛋白质、核酸等分子信息。
本文将总结一些常用的分子生物学实验技巧，帮助读者在实验中获得准确可靠的结果。
一、样本处理及核酸提取技巧1. 细菌培养和DNA提取：首先选择正确的培养基和培养条件来培养目标菌株，接着使用合适的裂解方法将菌株裂解并提取DNA。
常用的裂解方法有热裂解法、酚-氯仿法和硅胶膜法等。
2. 动植物组织DNA提取：对于动/植物组织样品，可以使用CTAB 法、SDS法或商用DNA提取试剂盒来提取高质量的DNA。
其中，CTAB法适用于高淀粉和高多酚样品，SDS法适用于富含脂质的组织。
3. RNA提取：RNA提取需要采用酚-氯仿法、琼脂糖柱纯化法等方法，同时需要注意避免RNA酶的污染，避免DNA和蛋白质污染。
二、PCR技术1. 引物设计：选择适当的引物对目标序列进行扩增，引物长度通常在18-25个碱基，GC含量应在40%-60%之间，并避免引物间的互补性。
2. 反应体系优化：根据目标序列的特性可调整反应体系中的引物浓度、模板DNA浓度、Mg2+浓度和缓冲液配方等，以确保PCR反应的稳定性和特异性。
3. 温度参数设置：PCR反应需要包括变性、退火和延伸三个阶段，所以需要合理设置变性温度、退火温度和延伸时间，以充分保证引物的结合和DNA聚合的效率。
4. 质量控制：引物和酶的质量对PCR扩增结果具有重要影响，因此应选用高质量的引物和酶，并进行良好的质量控制。
三、凝胶电泳技术1. 凝胶选择：琼脂糖凝胶适用于分离较大的核酸片段，而聚丙烯酰胺凝胶适用于分离较小的核酸片段。
选择合适的凝胶浓度和电泳缓冲液浓度，以达到最佳分离效果。
2. DNA标记物：给DNA标记物添加Gel Loading Buffer，使其具有一定的密度，并用质量标准品作为分子量标尺，以便准确测定目标DNA的分子量。
分子生物学实验步骤总结超全
一目的基因的获得细菌基因组DNA的提取（一）仪器1）台式高速离心机2）恒温水浴箱3）枪式移液器4）灭菌的EP管和Tip头（二）试剂1）溶液1:25%蔗糖50mmol/LTris-Hcl，pH8.050mmol/LEDTA，pH8.0500ug/ml溶菌酶（现用现配）100ug/mlRNase2)溶液Ⅱ：100mmol/LTris-Hcl，pH8.01%SDS400ug/ml蛋白酶K3）酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）4）氯仿：异戊醇（24：1）5）3mol/LNaAc(pH5.2)6）异丙醇或无水乙醇7）70%乙醇8)TE缓冲液：10mmol/LTris-Hcl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.0(三)实验步骤1)5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。
2）将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。
3）加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。
4）加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。
5）向转移的水相中加入0,9倍体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。
6）向转移的水相中加入0.1倍体积的3mol/LNaAc和0.7倍体积的异丙醇（或2.5倍体积的无水乙醇），冰上放置30分钟。
7）14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温干燥。
8）将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20°C保存。
9）进行DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。
植物DNA的SDS提取法：（一）试验试剂：1）研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。
分子生物学实验技术
增的DNA样品稀释103-105倍作为模板，重新加入 各种反应底物进行扩增，这样经60轮循环后，扩增 水平可达109-1010。
在扩增后期，由于产物积累，使原来呈指数扩增 的反应变成平坦的曲线，产物不再随循环数而明 显上升，这称为平台效应。
主要是为使整个反应体系达到合适的温度。
p 延伸
延伸反应通常为72℃，接近于Taq DNA聚合酶的 最适反应温度75℃。
实际上，引物延伸在退火时即已开始，因为Taq DNA聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃。
延伸时间的长短取决于目的序列的长度和浓度。 在一般反应体系中，Taq DNA聚合酶每分钟约可
酸序列。 Ⅱ类酶切割位点在识别序列中，有的在对称轴处
切割，产生平末端的DNA片段。 如，SmaⅠ：5‘-CCC↓GGG-3’
有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出 末端的DNA片段称粘性未端。 如，EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性 末端。 5'…G↓AATTC…3' →5'… G AATTC…3‘ 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5'
p 退火
引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的 碱基组成、引物的长度、引物与模板的配对程度 以及引物的浓度。
一般当引物中G、C含量高，长度长并与模板完全 配对时，应提高退火温度。退火温度越高，所得 产物的特异性越高。
实际使用的退火温度比扩增引物的Tm值约低5℃。 通常退火温度和时间为37℃-55℃，1-2min。 退火一般仅需数秒钟即可完成，反应中所需时间
（二硫苏糖醇）的试剂不能用DEPC处理。 3、Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。 4、配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水
分子生物学实验技术
《分子生物学实验技术》实验报告实验一碱裂解法小量提取质粒DNA一、实验原理在碱性环境中，细菌膜破裂释放内容物。
染色体DNA变性分开，而质粒DNA虽变性但仍处于缠绕状态。
将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。
通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提纯化得到质粒DNA。
二、操作步骤主要步骤1.细菌的培养2.细菌的收集和裂解3.质粒DNA的分离和纯化4.质粒的鉴定具体操作如下：1. 取1.5 ml过夜菌液于EP管中，12 000 r/min离心1min，弃去上清液。
2. 加100 μl 溶液Ⅰ，剧烈震荡使菌体悬浮均匀，室温放置5min 。
3. 加200 μl 溶液Ⅱ（现配现用），轻柔颠倒混匀4~6次，室温放置5min 。
4. 加150μl预冷溶液Ⅲ，轻柔颠倒混匀4~6次，冰上放置10分钟。
5. 12 000 r/m离心10 分钟(如果上清液仍然浑浊，可将上清液移出，再次离心5分钟）。
6. 吸出上清液，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置10分钟，12 000r/min离心10分钟，沉淀DNA 。
7. 弃上清，挥干，所得DNA溶于30μlddH2O中，用于后续试验。
三、实验结果获取极少量白色固体，主要为DNA，也不排除有蛋白质等杂质，但是不影响后续实验的继续进行。
实验二氯化钙法进行质粒转化及筛选一、实验原理细菌处于0 ℃，在CaCl2低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，DNA则与CaCl2形成抗Dnase的羟基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。
1. 氯化钙（二价钙离子）的作用：提高细胞壁（膜）的通透性。
分子生物学实验技术使用指南
分子生物学实验技术使用指南背景随着生物科技的飞速发展，分子生物学实验技术变得日益重要。
无论是基础研究还是应用研究，分子生物学实验技术都扮演着关键角色。
本文将深入探讨几种常用的分子生物学实验技术，并提供使用指南。
1. DNA提取技术DNA提取是分子生物学实验中的第一步。
合理高效的DNA提取可以确保后续实验的顺利进行。
常用的DNA提取方法包括Phenol/Chloroform法、Qiagen柱法等。
对于不同的样品类型，选择合适的方法非常关键。
例如，对于植物样品，除了常规提取方法外，还可以使用植物基因组DNA提取试剂盒进行快速提取。
2. PCR技术PCR（聚合酶链式反应）是分子生物学实验中的常用技术。
它使得我们能够在实验室中迅速扩增DNA片段。
在PCR过程中，引物的设计非常重要。
合理严谨的引物设计能够提高扩增效率，并避免非特异扩增。
此外，选择适当的扩增条件和酶的浓度也是成功PCR实验的关键。
3. 限制性内切酶消化限制性内切酶消化可以用于DNA片段的切割和鉴定。
合理选择适合的限制酶是至关重要的。
在消化反应中，反应的时间和温度是需要特别注意的因素。
此外，对于限制性内切酶的消化产物的鉴定，可以使用琼脂糖凝胶电泳或PCR扩增来进行。
4. 基因克隆技术基因克隆是分子生物学实验中常用的技术手段。
在基因克隆过程中，选择合适的酶切位点和载体是至关重要的。
克隆之前，需要仔细设计引物以扩增目标基因。
成功克隆后，还需要验证所克隆基因的准确性。
这可以通过测序和进一步的功能检测来完成。
5. 蛋白质免疫印迹技术蛋白质免疫印迹技术是研究蛋白质表达和相互作用的重要技术。
在进行免疫印迹实验前，需要制备合适的细胞裂解液来提取蛋白质。
之后，需要将蛋白质样品进行分离，并转移到膜上。
此外，合适的抗体选择和浓度优化也对实验结果有重要影响。
6. 基因组测序技术基因组测序是分子生物学研究中不可或缺的技术。
高通量测序技术的发展使得基因组测序变得更加快速和准确。
分子生物学实验技术
SDS碱裂解法提取质粒具体方法：(1) 取菌液1.5 mL至离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清。
(2) 加入100 ul溶液1，充分悬浮菌液；(3) 加入200 ul溶液2，上下颠倒5次，冰上3 min；(4) 加入150 ul溶液3，轻晃10 s，冰上3~5 min(5) 12000 g离心10min，将上清移至新试管；(6) 加2倍体积异丙醇混匀，室温静置10 min；(7) 12000 g离心5 min，去掉上清；(8) 自然干燥沉淀，加30 ul TE buffer，取3-5 ul 酶切电泳鉴定，剩余-20ºC保存。
改进之处：不使用酚/氯仿，时间变短注意事项：无自己的实验感想：与采用分子克隆中的方法所得结果没有区别。
大肠杆菌感受态细胞制备具体方法：1.挑一单菌落接种与20mlLB，过夜2.按1%（v/v）接种于新鲜培养基，210rpm，约2.5h，至OD.600=0.4。
冰浴10min3.分装于1.5ml预冷EP管，室温离心12，000g，20sec。
无菌操作，去上清。
4.每管用1ml预冷0.1M CaCl2(含10%甘油)重悬；冰浴5min；室温离心12，000g，20sec。
无菌操作，去上清。
5.每管用100ul预冷0.1M CaCl2(含10%甘油)重悬；-70度保存备用。
改进之处：无须低温离心；适合与没有冷冻离心机的实验室。
注意事项：尽量减少在室温放置的时间有利于提高感受效率。
自己的实验感想：由于实验室没有大型冷冻离心机，改进后可以不用跑到公共实验室了：）感受态效率不错，不低于常规方法制作的感受态效率。
质粒DNA的提取纯化（碱法）1、取1.5ml 培养液倒入1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 离心30 秒。
2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
3、菌体沉淀重悬浮于100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10 分钟。
分子生物学常用实验技术及方法
第二章常用实验技术及方法一、聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）反应总体积为50讥其中含有：模板DNA 0.5 dPCR缓冲液（不含MgCl2）5止10XMgCl2 溶液5止dNTP (2.5 mmol/L) 0.5 1卩引物 1 (50 umol/L) 0.5 k引物 2 (50 umol/L) 0.5 kTaq DNA 聚合酶0.5 l无菌去离子水加至50 d上层用25 d液体石蜡油覆盖。
循环参数为：94 °C变性10 min94 C变性 1 min56 C退火 1 min72 C 延伸 2 min共30个循取环，PCR结束后，取2 dPCR扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。
二、基于PCR技术的定点突变1.根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；P1# 严—k *—P3 P42.用基因5'端的Primer 1和Primer 2 PCR扩增DNA片段1，用基因3'端的Primer4和Primer 3 一起PCR扩增DNA片段2，PCR反应条件基本如上（七、聚合酶链反应），可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA片段1和DNA片段2；3.以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50止:片段1 1 d片段2 1 d10XPCR缓冲液(不含MgCl2) 5 d1O0lgCl2溶液 5 ddNTP (2.5 mmol/L) 5 dlTaq 酶 1 dl力加ddH2O至50 d在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行 10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；4.PCR 产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突变的正确性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。
实验室中最常用的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1、胰蛋白胨2、酵母提取物3、氯化钠4、1mol/L NaOH5、琼脂粉6、抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1、培养皿2、带帽试管3、涂布器4、灭菌锅5、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6、恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨 10g细菌培养用酵母提取物 5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。
加入去离子水至总体2 (1.034×105Pa高压下蒸气灭菌20min，即为LB液体培养基。
积为1L，在15 lbf／inLB固体培养基是在其液体培养基的基础上另加琼脂粉15g/L。
（二）细菌的培养（１）在液体培养基中培养1、过夜培养⑴取5ml液体培养基加入一只无菌的试管中。
⑵用接种环或灭菌牙签挑一个单菌落，接种于培养液中。
⑶盖好试管，在摇床上以60r/min速度，于37℃过夜培养。
２、大体积培养⑴按1：100的比例将过夜培养物加入到一无菌烧瓶中，烧瓶的体积应该是培养液体积的5倍以上。
⑵于37℃，约300r/min剧烈摇动培养。
（２）在固体培养基中培养细菌在固体培养基上培养主要是为了获得单菌落和短期保存。
平板划线法分离单菌落⑴采用无菌技术，用接种环将接种物从平板的一侧开始划线。
⑵重新消毒接种环，从第一划线处将样品划线至平板的其余部分，重复划线直至覆盖整个平板。
⑶于37℃培养直至长出单菌落。
实验二质粒DNA的提取目的学习碱裂解法提取质粒的原理原理质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，具有双链闭环结构的DNA分子。
它具有自主复制能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
目前，质粒已广泛用作基因工程中目的基因的运载工具——载体。
质粒DNA的提取是依据质粒DNA分子较染色体DNA分子小，且具有超螺旋共价闭合环状的特点，从而将质粒DNA与大肠杆菌染色体DNA分离。
现在常用的方法有：碱裂解法、密度梯度离心法、煮沸裂解法等。
实验室普遍采用的碱裂解法具有操作简便、快速、得率高的优点。
其主要原理：利用染色体DNA与质粒DNA 的变性与复性的差异而达到分离的目的。
在碱变性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋解开而变性，质粒DNA氢键也大部分断裂，双螺旋也有部分解开，但共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当pH=4.8的乙酸钠将其pH调到中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，形成缠绕的致密网状结构，离心后，由于浮力密度不同，染色体DNA与大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
试剂与器材一、试剂1、LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，溶解于1000mL蒸馏水中，用NaOH调pH至7.5。
高压灭菌20min。
2、LB平板培养基：在每1000mL LB液体培养基中中加入15g琼脂，高压灭菌20min。
3、溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖,10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0。
4、溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1% SDS。
（必须现配）5、溶液Ⅲ：pH4.8的醋酸钾溶液（5mo1/L乙酸钾 60 mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5mL）。
6、TE缓冲液（pH 8.0）：10 mmol/L Tris-HCl，1mmol/ L EDTA。
7、无水乙醇和70%乙醇。
二、器材1、Eppendorf管、离心管架2、10，100，1000ul微量加样器3、台式高速离心机4、摇床、高压灭菌锅5、大肠杆菌DH5α（含质粒）操作步骤一、培养细菌将带有质粒的大肠杆菌接种于LB平板培养基上，37℃×24h，然后从平板上挑取单菌落，接种于5mL液体培养基中，37℃×12h。
二、提取步骤1、将菌液移入1.5ml 离心管，8 000 rpm×1min，倒置于滤纸上，彻底除去残液。
2、加入100 ul预冷的溶液Ⅰ，用涡旋震荡器充分悬浮菌体。
3、加入4 ul RNase ，室温×2 min。
4、加入200 ul溶液Ⅱ，快速颠倒，温和混匀，冰浴5min。
此时溶液应非常粘稠。
5、加入150 ul 预冷的溶液Ⅲ，温和混匀（此时应有可见沉淀），冰浴5 min。
6、12 000 rpm×5min。
转移上清液至另一1.5ml离心管中。
7、上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃×20min。
8、12 000 rpm×5min，彻底除去残液。
9、加入500 ul 70% 乙醇洗DNA沉淀。
3 000 rpm×1 min，彻底挥发除去乙醇。
10、加入40 ul ddH2O溶解DNA，待用。
（或用TE溶解，-20℃保存）。
实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度一、目的学习测定DNA或RNA的浓度与纯度。
二、原理核酸分子中的碱基集团含有共轭双键，它们对紫外光有强烈的吸收。
核酸的最大吸收波长在260 nm，吸收低峰在230 nm。
可以利用核酸的这一特性对其浓度进行测定。
在波长260 nm下，A260=1时，双链DNA的含量为50 µg/ml，单链DNA为 33 µg/ml ，RNA为 40 µg/ml，寡聚核苷酸为 20～30 µg/ml。
测出核酸溶液在A260的值，即可得出浓度。
根据经验数据，纯得DNA A260/A280=1.8,纯的 RNA A260/A280=2.0.若样品中含有蛋白或其它杂质会使其比值下降。
三、试剂与仪器（一）试剂TE缓冲溶液（二）仪器紫外分光光度计四、操作步骤1、开机，选择波长开机前应先检查光路中有无障碍物。
然后开启电源开关预热20左右。
并调节波长在260 nm下。
2、选择A档，调零面表上有4个可供选择的模式，本实验选择测定A值，因此选择A模式。
待测核酸为水或TE溶液，选择水或TE做空白对照进行调零。
3、测定样品将待测样品做适当稀释，用仪器配套的石英比色杯，以水或TE为对照的条件下测定，读取并记录样品A260的值。
4、计算样品的浓度双链DNA浓度=50µg/ml×A260×稀释倍数单链DNA浓度=33µg/ml×A260×稀释倍数单链RAN浓度=40µg/ml×A260×稀释倍数核酸总量=样品浓度×样品体积（ml）实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA目的学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测DNA的纯度，DNA的构型，含量以及分子量的大小。
原理水平式琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法，它简单易行，只需少量的DNA就能检测，其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶-标准浓度DNA比较法更高，更直接，检测DNA范围更广，其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物；使得DAN发射的荧光，增强几十倍。
而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照，就可比较出待测样品的浓度。
若用薄层分析扫描仪检测，则可精确地测得样品的浓度。
电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照，只需5~10ng DNA ，就可以从照片上比较鉴别。
如肉眼观察，可检测到0.01~0.1ng的DNA。
在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。
质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照，观察其迁移距离，就可以该样品的分子量大小。
凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可鉴别分子量相同，但构型不同的DNA分子。
在抽提质粒的过程中，由于各种因素的影响，使得超螺旋共价闭环结构的DNA（SC）的一条链断裂，变成开环（OS）分子，如果两条链发生断裂，就变成线形分子（L）分子。
这三种构型的分子有不同的迁移率。
在一般情况下，超螺旋迁移速度最快，其次为线形分子，最慢的为开环分子。
当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA，在琼脂糖电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可以分析样品的纯度。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应，前者由分子所带净电荷的多少而定，后者则主要与分子大小及构型有关。
DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。
在电场中向着正极移动，在用电泳法检测DNA分子时，应当尽量减少电荷效应。