5发酵过程控制(pH)

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4、最佳pH的确定
配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况
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pH对产海藻酸裂解酶的影响 长江大学生科院生物工程系
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pH对海藻糖水解酶产生的影响
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pH对谷氨酰胺转氨酶活力的影响
菌体干重(g/L)
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内容速览
一、发酵 过程pH变 化的原因 二、pH对 发酵的影响
三、pH测量
四、pH的 控制策略
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1、调节好基础料的初始pH 2、在基础料中加入维持pH的物质 3、通过补料调节pH 4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH 5、不同调pH方法的影响 6、发酵的不同阶段采取不同的pH值 3
发酵工程 课件
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第五章 发酵过程控制(二)
主讲人：夏帆
第2节 发酵过程的pH控制(2学时)
教学目的：了解发酵过程pH变化的原因； 掌握pH对发酵的影响；掌握pH的控制策略。 教学重点、难点：pH对发酵的影响；pH的 控制策略，特别是如何分阶段控制pH。
菌株最适生长pH控制在6.8～7.0
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×
生长期
产酸期
×
不同pH值对菌体的形态影响很大，当pH值高于7.5时，菌体易于老 化，呈现球状；当pH值低于6.5时菌体同样受抑制，易于老化。在6.9左 右时，菌体处于生长期，呈“八”字形状并占有绝对的优势；而在7.2 37 2013年8月7日星期三 长江大学生科院生物工程系 左右时，菌体是处于产酸期，呈现长的椭圆形。
二、pH对发酵的影响
1、实例 例1 pH对林可霉素发酵的影响
林可霉素发酵开始，葡萄糖转化为有机酸类中 间产物，发酵液pH下降，待有机酸被生产菌（林可 链霉菌）利用，pH上升。（如下页图所示） 若不及时补糖、(NH4)2SO4或酸，发酵液pH可迅 速升到8.0以上，阻碍或抑制某些酶系，使林可霉素 增长缓慢，甚至停止。
基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。 若 要 控 制 灭 菌 后 pH 在 6.0 ， 灭 菌 前 pH 往 往 要 调 到 6.5~6.8。
2、在基础料中加入维持pH的物质 如CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。
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3、通过补料调节pH
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2、pH对发酵的影响
（6）影响产物稳定性
β-内酰胺抗生素噻纳霉素的发酵中，pH在 6.7～7.5之间时抗生素的产量相近，高于或 低于这个范围，合成受到抑制。在这个pH值 范围内，噻纳霉素的稳定性未受到严重影响； 但pH>7.5时，稳定性下降，半衰期缩短，发 酵单位也下降。青霉素在碱性条件下发酵单位 低，也与青霉素的稳定性有关。
pH6.9时，菌体生长旺盛，pH7.15时，对菌体的产酸 有利。采用阶段pH控制模式进行发酵，在发酵中前期控 制pH6.9，到48h后pH值为7.15，到80h后pH值为7.25。 38 产率22.27g/L，产酸率提高11.2５％。
例：克拉维酸(CA）发酵中pH变换控制
国外医药抗生素分册，2004年第1期
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发酵用复合pH电极要求
能高温灭菌，过高的温度将对玻璃膜材质和参 比电极性质产生影响，造成不可逆转的破坏。
具有长时间的稳定性，应保证转换系数和不对 称电位能适应发酵周期长、中途不能更换和不能 标定的要求 要求一定的液络部流通，维持的液接界电位稳 定，防止使用过程中液络部被含硫物、蛋白质和 非水溶液污染，造成电极测量漂移 外加不锈钢护套或工程塑料护套后安装于罐内
不同种类微生物，对pH要求不同；
酵 细
母：pH 3.8－6.0 菌：pH 6.5－7.5
霉
菌：pH 4.0－5.8
放线菌：pH 6.5－8.0
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同种微生物对pH变化的反映不同
如，石油代蜡酵母
pH 3.5－5.0 生长良好，不易染菌； pH >5.0时，易染细菌； pH <3.0时，生长受抑制，易自溶；
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克拉维酸
广谱β-内酰胺酶抑制剂 仅有微弱的抗菌活性 ，单独应用无效 可使不耐β—内酰胺酶的抗生素如青霉素G、 氨苄西林、阿莫西林或头孢菌素Ⅱ(头孢噻 吩)的抗茵谱增广，抗菌活性增强 金葡菌、大肠杆菌、肺炎杆菌、奇异变形杆 菌、普通变形杆菌、流感杆菌及脆弱杆菌等
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一、发酵过程引起pH变化的原因
2、产物形成
某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变
化。如
有机酸类产生使pH下降 红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使 pH上升。
3、菌体自溶，pH上升；发酵后期，pH上升。
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发酵15小时左右，pH值可以从灭菌后的 6.5左右下降到5.3，调节这一段的pH值至7.0 左右，以后自控pH，可提高发酵单位。
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Leabharlann Baidu
例2：培养基初始pH值对漆酶分泌的影响
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14 pH在5～7范围内产酶最高（三色革裥菌）
2、pH对发酵的影响
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pH显示仪表
应具有较高的输入阻抗（1011-1012 ） 并具有自动或手动的温度补偿功能
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四、pH的控制策略
1、调节好基础料的初始pH
引起发酵液pH值变化的常见因素
(1)下降 ①培养基中C/N不当，有机酸积累；
②消沫油加得过多；
③生理酸性物质过多；
(2)上升
①C/N比例不当，N过多，氨基氮释放； ②生理碱性物质过多； ③中间补料时碱性物加入量过大；
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林可霉素（洁霉素）
对革兰阳性球菌有较好作用，特别对厌气菌、 金葡菌及肺炎球菌有高效。 作用机制：主要抑制细菌细胞蛋白质的合成 临床：主要用于敏感菌引起的各种感染，如 肺炎、脑膜炎、心内膜炎、蜂窝织炎、扁桃 体炎、丹毒、疖及泌尿系统感染等。 可进入骨组织中，和骨有特殊亲和力，故特 别适用于厌气菌引起的感染及金葡菌性骨髓 炎。
问题的提出： CA产生菌棒状链霉菌在pH 低时生长受抑制，在pH高时克拉维酸要分解。 用2.5升罐进行的不控制pH的发酵发现，前期由
于微生物产生的酸性副产物和有机酸使pH降至6.5。
在达到最高细胞浓度后，pH开始从6.5升至8.3。产 量达最高水平时，pH不再升高。在发酵终止时，pH 再次升至8.5。随着pH升高，CA迅速分解。
在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在 补料与调pH没有矛盾时采用补料调节pH。 如（1）调节补糖速率，调节空气流量来调节pH。 (2) 当NH2-N低，pH低时补氨水； 当NH2-N低，pH高时补(NH4)2SO4。 通过补料调节pH值既调节了培养液的pH值，又 可补充营养，进一步提高发酵产率。
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一、发酵过程引起pH变化的原因
1、基质代谢 2、产物形成 3、菌体自溶
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1、基质代谢 （1）糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子 酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标 志之一。 （2）氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降； 尿素被分解成NH3，pH上升；NH3利用后pH下降；当 碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 （3）生理酸性物质、生理碱性物质 利用后pH会下 降或上升。
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2、pH对发酵的影响
（2）pH影响酶的活性 当pH值抑制菌体某些酶 的活性时使菌的新陈代谢 受阻。 （3）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变 从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸 收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。 （4）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离 从而影响微生物对这些物质的利用 。
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5、不同调pH方法的影响
分别在4种缓冲介质 中，于pH 6.50一9.50 测定天冬酰胺酶酶活力。 1 甘氨酸介质在pH8.0 时酶活力最高； 2 硼酸在pH8.50，酶 活力最高； 3 磷酸在pH 8.50，酶 活力最高； 4 Tris在pH 8.50，酶活 力最高； 酶活1＞2＞4＞3
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天冬酰胺酶
pH
三羟甲基 氨基甲烷
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不同pH控制方式对目的突变株
ISw330异亮氨酸摇瓶发酵的影响
黄色短杆菌诱变
“1”——CaC03
“2”——尿素
“3”——CaC03+尿素
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6、发酵的不同阶段采取不同的pH值
例：pH对L-异亮氨酸发酵的影响（天津科技大学，2004）
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pH对林可霉素发酵的影响
pH
p H
7.0
不调pH
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t 调pH
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pH对林可霉素发酵的影响
对照罐发酵66小时pH达7.93，以后维持在8.0以上 至115小时，菌丝浓度降低，NH2-N升高，发酵不再 继续。
（1）影响菌体的生长 （2）pH影响酶的活性 （3）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变 （4）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的 解离 （5）pH影响代谢方向 （6）影响产物稳定性
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2、pH对发酵的影响
（1）影响菌体的生长
举例： 产黄曲霉的细胞壁的厚度就随pH值的增加而减 小：其菌丝直径在pH6.0时为2～3 μm； pH7.4时为2～18 μm，并呈膨胀酵母状； pH值下降后菌丝形态又会恢复正常。
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3、pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响
X
生长
合成
四 环 素
pH
pH对菌体生长影响比产物合成影响小 四环素：菌体生长最适pH6.0~6.8，产物合成最适 pH5.8~6.0 。 青霉素：菌体生长最适pH3.5~6.0，产物合成最适 pH7.2~7.4 。
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2、pH对发酵的影响
（5）pH影响代谢方向
pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代 谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在 pH2~3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产 生草酸。 谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷 氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙 酰谷氨酰胺。
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三、pH测量
1、取样罐外测量
试纸法 （精密级）
酸度计法 罐外取样测量不利于实现自动 化管理
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2、在线测量
发酵用复合pH电极 + pH显示仪表
pH测量原理图
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发酵用复合pH电极
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pH不同，微生物代谢产物不同。
pH：2－3，柠檬酸 发酵 黑曲霉 pH：7.0，草酸发酵 pH：4.5-5.0－3，乙醇 发酵 酿酒酵母 pH：8.0，甘油发酵
pH：7－8，GA发酵 谷氨酸菌
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pH：5.0－5.8，谷氨酰胺发酵
4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH
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应急措施：
改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度， 控制有机酸的积累量及其代谢速度； 改变温度，以控制微生物代谢速度；
改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量；
改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；