实验五 动物细胞的原代培养
细胞的原代培养实验报告
细胞的原代培养实验报告一、实验目的细胞原代培养是指从机体取出细胞、组织或器官后，通过机械或酶学方法分散成单个细胞，在体外进行培养的过程。
本次实验的目的是掌握细胞原代培养的基本技术和方法，观察细胞在体外的生长和形态变化，为进一步的细胞生物学研究奠定基础。
二、实验原理细胞原代培养的关键在于保持细胞的活性和完整性，同时提供适宜的生长环境。
通常采用酶消化法或组织块培养法来获取单细胞或细胞团。
在培养过程中，细胞需要充足的营养物质、适宜的温度、pH 值和气体环境，以促进细胞的生长和分裂。
三、实验材料1、实验动物：新生小鼠2、试剂和培养基：DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、青霉素链霉素溶液、PBS 缓冲液等3、实验器材：超净工作台、CO₂培养箱、倒置显微镜、离心机、移液器、培养瓶、培养皿、手术器械等四、实验步骤1、取材处死新生小鼠，用 75%酒精消毒其腹部皮肤。
用手术剪剪开腹部皮肤和肌肉，取出肝脏组织，置于预冷的 PBS缓冲液中。
2、组织处理将肝脏组织转移至培养皿中，用 PBS 缓冲液冲洗 2-3 次，去除血液和杂质。
用眼科剪将组织剪成 1-2mm³的小块。
3、酶消化将组织小块转移至离心管中，加入适量的胰蛋白酶EDTA 溶液，置于 37℃水浴中消化 15-20 分钟，期间每隔 5 分钟轻轻振荡一次。
消化结束后，加入等量的含血清的培养基终止消化，用移液器轻轻吹打制成细胞悬液。
4、细胞过滤将细胞悬液通过 200 目滤网过滤，去除未消化的组织块和细胞团。
5、细胞计数和接种吸取少量细胞悬液，加入台盼蓝染液，在显微镜下计数活细胞数。
根据细胞计数结果，将细胞以适当的密度接种于培养瓶或培养皿中，置于 CO₂培养箱中培养。
6、培养和观察培养 24 小时后，在倒置显微镜下观察细胞的贴壁情况。
每隔 2-3 天更换一次培养基，观察细胞的生长和形态变化。
五、实验结果1、细胞贴壁情况培养 24 小时后，大部分细胞已贴壁，呈圆形或多边形，贴壁细胞周围有光晕。
动物细胞的原代培养
动物细胞的原代培养细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。
其特点包括：大量实验材料；单一、纯粹细胞类型培养基的成分可控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基；易于观察；易于操作。
细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术。
一、实验目的了解动物原代细胞培养的基本方法及操作过程；初步掌握无菌操作方法；观察体外培养细胞的生长特征。
二、实验原理原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
直接从身故体内分离的细胞，在体外培养的过程中尚未发生细胞分裂、增殖的细胞即为原代培养细胞；原代培养细胞在一定条件下可以继续增殖，在数量上大量扩增，此时的细胞为继代培养细胞。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。
二是严格控制无菌条件。
三、实验用品1.器材①解剖剪、解剖镊、眼科剪、眼科镊、培养皿、纱布块、移液管、橡皮头、培养瓶、玻璃匀浆器、1.5ml离心管等。
上述器材均需彻底清洗、烤干、包装好，高压灭菌20min，备用。
②倒置显微镜、离心机、酒精灯、酒精棉球、试管架、记号笔、大头针、解剖板等2.试剂完全培养液不完全培养液90%小牛血清10％双抗（链霉素、青霉素）（1万单位/mL）加至约为100单位/mL7.4%NaHCO3调pH至7.0-7.2。
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养一、【实验目的】1、学习并掌握动物细胞原代培养前各种器具的消毒方法2、学习并掌握动物细胞的机械切割和组织块原代培养方法二、【实验原理】1、原代培养也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。
原代培养的细胞具有很多特点，其最大的优点是组织和细胞刚刚离体，生物学特性未发生很大变化，仍具有二倍体遗传性状，最接近和反映供体体内生长特性，因此原代培养细胞是研究基因表达的理想系统，也很适合做药物测试、细胞分化、疫苗制备等实验研究。
2、原代培养是建立各种细胞系的第一步，因此细胞原代培养技术是从事组织培养工作者应熟悉和掌握的最基本的技术。
3、原代培养最基本的方法，依据切割方式不同，可分为蛋白酶消化法和组织块直接培养法两种。
4、组织块直接培养法是指在无菌条件下，从有机体取下组织，用平衡盐溶液漂洗数次后剪碎，加培养液进行培养的方法。
是常用的、简便易行和成功率较高的方法。
5、依据组织块贴壁方式不同，又可分为薄层培养法和翻转干涸法两种。
本实验采用翻转干涸法。
6、酶消化法是指将组织剪成小块，然后用蛋白酶消化成单细胞悬液后，再接种培养的方法。
7、由于蛋白酶比较贵，以及组织块消化成单细胞的条件要求远较组织块法复杂，因此，采用组织块直接培养法的较多。
三、【实验仪器、试剂及材料】仪器：培养瓶（3个/人）、培养皿（1套/2人）、剪子和镊子（1套/人）、青霉素小瓶（1个/人）、滴管（1-2个/人）、移液管若干、冻存管(2个/人)等：试剂：PBS、MEM（含100IU/ml 青霉素和100ug/ml链霉素）等材料：泥鳅四、【实验步骤及内容】材料的预处理鱼类消毒1.将所需的一定量水（或海水）进行煮沸消毒处理。
2.冷却后，加入青霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水），加入链霉素至终浓度1000单位/ml水（或海水）。
3.将实验用鱼放入经处理的消毒水（或海水）中浸泡24小时。
4.用纱布包裹将鱼取出，将其击昏。
实验五动物细胞的原代培养
实验五动物细胞的原代培养实验五动物细胞的原代培养一、实验目的1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。
2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。
3．初步掌握无菌操作方法。
二、实验原理细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。
细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。
原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。
三、实验仪器、材料和试剂1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法
动物细胞原代培养和传代培养中的培养方法1. 引言嘿，大家好！今天咱们聊聊动物细胞的培养，听起来可能有点高大上，但其实就像种花一样，只是“花”是细胞，养护的方法也有讲究。
说白了，细胞也有自己的“家”，咱们得给它们创造个舒适的环境，让它们在里面嗨起来！接下来，我就带你走进这个充满神奇和乐趣的细胞世界。
2. 原代培养2.1 什么是原代培养？原代培养，简单来说，就是从活体动物身上直接提取细胞，然后把它们放在培养皿里，就像把新鲜的花插进水里一样。
你知道吗，这些细胞就像刚从大自然里来的小家伙，特别活泼，适应能力强。
不过，这可不是随便就能搞定的，得有点技术活。
2.2 原代培养的方法首先，咱得准备好一切工具，这可是基础中的基础，不能马虎。
咱们要用到无菌技术，确保培养环境干净得像新洗的碗，不然细胞们就会遭殃。
提取细胞时，通常会用胰酶把它们从组织中“松开”，就像剥开一个大榴莲，里边的果肉才好吃嘛。
然后，把这些细胞放到培养基里。
培养基就像细胞的“快餐”，里面有细胞需要的各种营养物质和生长因子。
要记得，细胞也要“吃好”，才能长得壮壮的，不然就不成气候了。
培养的环境也不能小看，温度、pH值、二氧化碳浓度都得保持稳定。
咱们得把细胞放在适合的温度下，就像给它们开个温暖的“家庭聚会”。
如果环境不合适，细胞就会抗议，甚至罢工！3. 传代培养3.1 什么是传代培养？说到传代培养，那就是把原代培养中的细胞继续繁殖，让它们“生儿育女”。
这就像一个大家庭，越来越壮大，热闹得不得了。
传代培养可以让我们获得更多细胞，方便后续的实验和研究。
3.2 传代培养的方法传代培养的关键在于及时分离细胞，咱不能让细胞们挤在一起，这样容易“打架”。
通常，当细胞长满培养皿后，就需要把它们分离开。
这个过程又得用到胰酶，跟原代培养一样，轻轻松松把它们从皿里“请”出来。
接下来，咱们需要把细胞分到新的培养皿里，再给它们加上新鲜的培养基，确保它们能继续健康成长。
注意，细胞们需要一点时间适应新环境，就像搬家后要习惯新居的味道一样。
动物细胞的原代及传代培养
动物细胞的原代及传代培养一、试验目的1、了解动物细胞原代培养的原理及基本方法，掌握组织块法及消化培养法的操作过程，掌握无菌操作的技术要领；2、了解传代培养方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长情况。
二、实验原理动物细胞的原代培养是指把直接从动物获得的细胞、组织或器官在体外培养直至第一次传代为止。
要求在严格无菌的条件下对动物进行切割成组织块或经消化液使组织细胞游离为单个细胞，然后在人工配制的营养液内使其不断地生长和繁殖。
传代培养是指将细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移、接种到另一培养瓶的培养过程。
三、实验材料和试剂鸡胚，HeLa细胞实验器材：无菌工作台，细胞培养箱，离心机，无菌解剖器材，培养皿，培养瓶，滴管等。
实验试剂：平衡盐液，细胞消化液，培养液四、实验步骤（一）动物细胞的原代培养1、取材①将鸡蛋用酒精消毒，用剪刀敲破鸡蛋的圆端，剥壳去膜，倒掉壳内的液体；②拉出鸡胚，剪去头后置于装有Hank液的培养皿内，用Hank液清洗；③然后用镊子小心拔掉鸡胚的毛，将拔完毛的鸡胚。
2、组织块培养法①剪取背部及大腿部的皮肤肌肉组织十余块于培养皿中，用剪刀剪成1mm3大小的组织块；②用弯头吸管吸取组织块送入培养瓶底部，均匀排列；③翻转培养瓶后吸取3管培养液，滴入到培养瓶内（注意：吸管不能碰到瓶口）；④标记在培养瓶写上“原代”，写上姓名和学号。
3、消化培养法①剪取十余块组织块放入干净的培养皿中，吸取3-5管消化液，放入37℃的培养箱中消化10-20min，到组织变成松散、粘稠状，然后加入1管营养液（停止消化）；②取一只干净的细管将组织块打散，放置一段时间，用吸管吸取上清液于离心管中，离心10min；③倒掉上清液，用营养液悬浮沉淀，转入干净的培养瓶中，加入适量的培养液，37℃的培养箱中培养；④标记在培养瓶写上“消化”，写上姓名和学号。
（二）动物细胞的传代培养①取已长成单层HeLa细胞的培养瓶，倒掉培养液，加入3管消化液，37℃条件下消化2-5min，在显微镜下观察细胞单层出现缝隙，倒去消化液，停止消化；②加入3-4管培养液，用弯头吸管反复吹打壁上的细胞层（尽量不形成气泡），添加2-4管培养液；③用吸管吸取一半左右细胞悬液，分装到另一个培养瓶中；④作标记，注明细胞代号、日期和操作者姓名；⑤37℃静置培养，24小时后即可观察。
动物细胞原代培养过程
动物细胞原代培养一、剪取组织颈椎脱臼法处死小鼠，放在100ml的烧杯中用70％乙醇消毒3min。
用剪刀剪开腹部，取出肾、肝、脾（任意一种脏器）。
1、将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1‰ 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
2、将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔二、清洗在盛有PBS 液平皿中洗涤数次，剔除包膜、结缔组织，将剔除后脏器放入另一盛有PBS 平皿中。
三、剪切将肾、肝、脾剪成1mm3 （剪成肉末状）大小的组织块，再次清洗，洗去残留的血细胞，以备消化。
四、消化1、在50ml离心筒中加入0. 25％胰蛋白酶溶液25ml，在温暖的环境中或置于37 °水浴摇床中轻轻摇动15min，转速约为180r/min。
2、让存留的组织块在重力作用下慢慢沉降，将含有悬浮细胞的液体转移至一无菌50ml的离心管中，该管内按照每10ml上清加入l ml小牛血清的比例加入牛血清以灭活胰蛋白酶。
（小牛血清在共用无菌操作台上取用）3、在离心管中残留未消化组织块中再次加入胰蛋白酶进行消化，重复步骤1和2。
五、制备单细胞悬液1、将混合的细胞悬液离心，1200rpm，5min，弃上清。
2、将沉淀用新鲜的无菌PBS重悬，再1000-1200rpm，5min离心。
3、用PBS反复洗涤细胞直至上清清亮为止,然后再按照（1）进行离心，离心后弃去上清液，将沉淀用少量细胞培养液反复吹打。
制的细胞悬液。
六、接种1、将细胞悬液接种到细胞培养瓶中。
2、用滤器过滤RPMI1640再悬沉淀，并使终体积为20ml。
（RPMI-1640RPMI是Roswell Park Memorial Institute的缩写，代指洛斯维.帕克纪念研究所。
RPMI是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
其中含有10%胎牛血清。
）七、培养1、在培养瓶外做好标记（标明所培养细胞的名称和时间），2、置于CO2的孵箱中培养，3、72h后即可观察。
动物细胞原代培养实验项目指导
附件-4综合设计性实验项目指导一、实验项目名称：动物细胞原代培养及活力检测二、实验目的：掌握原代细胞培养的一般方法和步骤及培养过程中无菌操作技术，熟悉原代培养细胞的观察方法及细胞活力的测定方法，为细胞工程中的胚胎移植、细胞融合与单克隆抗体制备等技术奠定重要的技术基础。
三、实验原理用直接从机体获取的细胞进行的培养称为原代培养。
这种培养过程是把组织或器官从动物体取出，分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断的生长和繁殖。
原代培养是建立各种细胞系的第一步。
利用原代培养技术可以在体外进行各种类型细胞的增殖、遗传、变异、分化和脱分化、恶变与去恶变等研究。
原代培养科分为组织培养法和消化法两种。
台盼蓝染色法检测细胞活力的原理:台盼蓝是检测死、活细胞最常用的生物染色试剂之一。
健康的正常细胞能够排斥台盼蓝，而死亡的细胞，由于膜的完整性丧失，通透性增加，细胞可被台盼蓝染成蓝色。
四、实验材料：1.新生兔2.大剪子、弯头眼科剪、小镊子、平皿、细胞培养瓶、烧杯、酒精灯、移液枪、超净工作台、细胞计数板、0.22μm细菌过滤器、移液枪、枪尖、PE手套、一次性无菌橡胶手套、脱脂棉、无水乙醇、台盼蓝、15ml离心管3. DMEM培养基、血清、青霉素、链霉素、胰蛋白酶五、实验仪器：二氧化碳培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、离心机、显微镜六、实验步骤（方案）：（如需要学生设计，也要提交一参考方案供论证评审）（一）DMEM培养基的配制1. 将DMEM培养基干粉用800ml超纯水溶解，加入3.7gNaHCO3，搅拌溶解，加入双抗（100IU/ml），调整pH为7.0，定容至1L，用0.22μm细菌过滤器过滤除菌，分装，并用封口膜封口，4℃保存备用。
2. 取一定量的配制好的DMEM培养基，按10%-20%的比例添加新生牛血清。
（二）新生兔细胞原代培养1. 准备（1）取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
（2）预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
动物细胞的原代培养
剪碎组织
接种组织块
移入培养箱中（注 意贴有组织块的一 面朝上），
静止2～3小时， 然后将细胞培养瓶 轻轻翻转，继续静 止培养。
观察
24～48小时后若培养液变成黄色且混浊，表示已 被污染； 若培养液变成紫色，一般细胞生长不好，则培养 液pH过高； 若培养液显为橙黄、橘红且清澈，一般显示细胞 生长良好。在相差显微镜下观察，若此时见细胞 自组织边缘长出。 继续培养3～5日，再换部分或全部培养液，待多 数组织块的生长晕相接，小心挑掉组织块，继续 培养3～4天，细胞贴满细胞培养瓶壁时便可进行 传代培养。
脾脏免疫－3
打结固定小鼠
脾脏免疫－4
碘酒消毒 酒精消毒
去毛
脾脏免疫－5
剪开外皮
剪开腹膜
找到脾脏
脾脏免疫－6
注射抗原
脾脏免疫－7
缝合伤口 注射双抗
每隔15天重复注射作加强免疫，共重复2次
第三次免疫之后10天，将小鼠断尾取血， 用ELISA方法，检测血清效价。
取脾细胞融合前3天加强免疫一次，以活化 B淋巴细胞
The End
动物细胞的原代培养
－－组织块法
无菌室
上风口
下风口
液氮罐
安全柜
着装
操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手， 然后用1‰用75%酒精或1‰ 新洁尔 灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。
将小白鼠置超净工作台上，打开腹腔
用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥 向肾门，去肾外膜及脂肪，
骨髓瘤细胞的培养
骨髓瘤细胞
消化数分钟
中止消化、吹散细胞
动物细胞原代培养植块法
动物细胞原代培养植块法动物细胞原代培养植块法，说得简单点，就是一种从动物组织中取细胞，放到合适的培养环境中，让它们在体外自己“活”起来的方法。
听着好像很高大上，但其实就是让细胞在试管里过得舒适安逸，让它们有条件生长、分裂、繁殖，甚至能在实验中为我们提供很多有用的信息，像是研究药物效果、疾病机理等等。
动物细胞原代培养就像是我们养花一样，不同的是我们养的不是花，而是细胞，而这小小的细胞可是非常挑剔的哦！原代培养听起来很复杂，但只要你掌握了其中的“窍门”，其实没那么难。
想要做好这个事儿，最关键的就是得从健康的动物身上取到合适的组织。
这一步可得小心翼翼，因为你要保证你取到的细胞是活的、健康的，不然后面的培养就白费劲了。
像是切取心脏、肝脏、皮肤、骨骼等组织，哪一块都得考虑周到，选择最佳部位。
毕竟，你不能拿一块“病死的”组织去做实验，毕竟人家细胞也有自尊，活得不好，实验结果也不靠谱。
好啦，组织拿到手了，接下来就得进入最关键的步骤——把这些细胞从组织块中分离出来。
这可不是随便一捏就能出来的，得小心操作，不能弄伤细胞，别看它们比我们小得多，它们的生命力可一点不弱！大家都知道，细胞可不是“铁石心肠”的，它们对环境的要求可高了，得有适当的温度、湿度，还得有营养物质，给它们一个良好的生长环境，不然它们可不会轻易合作。
我们要用酶来帮助把细胞从组织里分离出来，这种酶就像是“拆迁队”，它把细胞“拆”出来后，你还得通过过滤、离心等方法，尽量让它们恢复活力，清理干净，确保它们没有受到损伤。
分离出来的细胞，接下来就是要给它们“搭个家”了。
培养皿就是它们的“豪华公寓”，而培养基则是它们的“美食大餐”。
不过，这个餐单可得丰富点，不是随便几样就能满足细胞的需求哦！比如说，培养基里要加入蛋白质、氨基酸、维生素等，想让细胞住得舒服、活得长久，得给它们提供各种必须的营养。
如果缺了哪一项，细胞可能会“闹脾气”，不爱合作，甚至可能死掉。
所以，调配培养基是一门艺术，需要我们细心地掌握各种配方。
动物细胞原代培养流程
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动物细胞原代培养流程
动物细胞原代培养流程
1. 取材。
- 从健康动物体内取出所需组织，如肝脏、肾脏等，尽量选择新鲜、无菌的组织材料。
- 取材过程要迅速，减少组织暴露在外界环境中的时间，以降低污染风险。
2. 组织处理。
- 将取出的组织块用平衡盐溶液（如PBS）清洗，去除表面的血液、杂质等。
- 把组织剪成小块，一般为1 - 3mm³大小，便于后续消化。
3. 消化。
- 加入适量的消化酶（如胰蛋白酶或胶原酶），在适宜的温度（通常为37°C）和时间（根据组织类型和酶的活性而定）下进行消化。
- 消化过程中可轻轻摇晃容器，使消化酶与组织充分接触。
4. 终止消化。
- 当组织块变得松散，大部分细胞游离出来时，加入含血清的培养液终止消化。
血清中的某些成分可以抑制消化酶的活性。
5. 过滤。
- 将消化后的细胞悬液通过滤网（如200目滤网）过滤，去除未消化完全的组织块。
6. 离心。
- 将过滤后的细胞悬液进行离心，转速一般为1000 - 1500r/min，离心时间5 - 10分钟。
- 离心后弃去上清液，得到细胞沉淀。
7. 细胞计数与活力检测。
- 用适量的培养液重悬细胞沉淀，然后进行细胞计数（可使用血球计数板等工具）。
- 同时检测细胞活力（如台盼蓝染色法，活细胞不着色，死细胞被染成蓝色）。
8. 接种培养。
- 根据细胞计数结果，将适量的细胞接种到培养容器（如培养瓶、培养皿）中。
- 加入适量的培养液，放入培养箱中，在适宜的温度（37°C）、湿度（95%左右）和二氧化碳浓度（5%）下进行培养。
原代培养_实验报告
一、实验目的1. 掌握原代细胞培养的基本原理和操作步骤。
2. 熟悉细胞培养所需的设备和试剂。
3. 了解细胞培养过程中可能遇到的问题及解决方法。
二、实验原理原代培养是指从生物体内取出组织或细胞，在体外模拟体内生理条件，使其生存、生长、繁殖或传代的过程。
原代培养细胞与体内细胞在形态结构和功能活动上具有相似性，适用于研究细胞生长、代谢、分化等生物学特性。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠、大鼠等。
2. 组织：肝脏、脾脏、皮肤等。
3. 试剂：胰蛋白酶、EDTA、胎牛血清、DMEM培养基等。
4. 设备：超净工作台、细胞培养箱、倒置显微镜、移液器、离心机等。
四、实验步骤1. 组织块制备（1）取动物组织，用生理盐水清洗，去除血污。
（2）将组织剪成1mm×1mm×1mm的小块。
（3）将组织块置于含有胰蛋白酶的消毒培养皿中，37℃水浴消化15-20分钟。
（4）加入适量胎牛血清终止消化，用吸管吹打组织块，使其分散成单个细胞。
2. 细胞接种（1）将分散后的细胞悬液移至含有DMEM培养基的培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。
（2）观察细胞生长情况，适时更换新鲜培养基。
3. 细胞传代（1）待细胞生长至单层时，用胰蛋白酶消化细胞。
（2）收集消化后的细胞，加入胎牛血清终止消化。
（3）将细胞悬液接种至新的培养瓶中，继续培养。
4. 细胞观察（1）使用倒置显微镜观察细胞形态、生长状态等。
（2）对细胞进行染色，如台盼蓝染色、Giemsa染色等，观察细胞核、细胞器等结构。
五、实验结果1. 原代细胞在培养过程中呈现典型的贴壁生长，细胞形态为多边形、梭形等。
2. 细胞生长速度较快，2-3天即可达到80%的融合度。
3. 细胞传代过程中，细胞生长状态良好，无明显形态变化。
六、实验讨论1. 原代细胞培养过程中，无菌操作至关重要。
应确保所有操作均在超净工作台内进行，避免污染。
2. 培养基的配制和质量直接影响细胞生长。
应严格按照试剂说明书配制培养基，并确保其质量。
动物细胞的原代培
消化培养法
（1）取材与剪切：同组织块培养法。 （2）消化：将剪切后的组织小块移到10ml离心管内， 加2ml的0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA组成的消化液， 室温下消化5~20min，期间吹打数次，并随时吸取少量 的消化业在显微镜下观察，如发现组织已分散成细胞团或 单个细胞，则立即加入8ml含5%FBS的Hanks液终止消 化。 （3）用吸管反复吹打组织块，分散单细胞，用100μm不 锈钢网筛过滤，收取滤出液，1000r/min离心10min， 弃上清。 （4）用2ml DMEM+10%FBS培养液悬浮细胞，计数并 稀释细胞浓度至（1~5）×106/ml，每个培养瓶加细胞 悬液2.5ml，使细胞数＜1×105/cm2。置CO2培养箱， 37℃、5%CO2、饱和湿度下静置培养，24小时后，更 换新培养液，此后每3天换液1次。
动物细胞的原代培养
目的要求
1、了解原代细胞培养的基本方法几操作过 程。 2、初步掌握无菌操作和细胞观察的方法。
实验原理
动物细胞的原代培养也称初代培养，，是直接从动物体得 到组织细胞后在体外进行的首次培养。这种培养首先用无 菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官）， 经酶消化处理，使分散成单个游离的细胞，在人工条件下 培养，使其不断地生长繁殖。 原代培养是建立各种细胞系的第一步。是从事组织培养工 作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。虽然原代培养是获 取细胞的主要手段，但原代培养的组织由多种细胞成分组 成，比较复杂。即使生长出同一类型细胞如成纤维细胞或 上皮样细胞，细胞间也有很大差异。原代培养的方法很多， 最基本和常用的有两种：组织块培养法和消化培养法。
（2）剪切：去除胎儿头、尾及内脏，只留下胎儿 四肢及躯干部分，在Hanks液内洗2~3次去除血污 后，放入60mm培养皿或青霉素小瓶内，用眼科 剪将小鼠胎儿剪成1mm3的小块。 （3）接种：用剪去尖头的枪头吸取若干小组织块， 置于培养瓶中，均匀地铺展在培养瓶底部，调整 小块之间的相互距离，每25ml培养瓶可接种 20~30小块。 （4）粘附培养：组织块布置好之后，稍微倾斜培 养瓶，使瓶内的液体倾至培养瓶的一角，吸出瓶 中的培养液，轻轻地将培养瓶翻转，让接种组织 块的瓶底面向上。盖好瓶盖，将培养瓶放置于 CO2培养箱内37℃培养2~4小时，使组织块粘着 在培养瓶底上。
细胞的原代培养和传代培养
实验五细胞的原代培养和传代培养1. 实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程。
2. 实验指导细胞培养(cell culture)是从机体中将细胞取出后，在模拟生物体内生理条件下使其在体外生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命活动过程的方法。
进行细胞生物学、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成为一种重要的生物学技术。
细胞培养一般可分为原代培养和传代培养。
所谓原代培养，是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。
原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。
一般动物和人的所有组织都可以用于培养，但幼体组织和细胞(如胚胎组织、幼仔的脏器等)更容易进行原代培养。
传代培养则是为了使体外培养的原代细胞或细胞株在体外持续生长、繁殖。
细胞持续生长繁殖就必须传代，并由此获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞。
培养的贴壁细胞形成单层汇合后，由于密度过大、生存空间不足而引起营养枯竭。
将培养的细胞分散，从容器中取出，以1：2或1：3以上的比例转移到另外的容器中继续进行培养，即为传代培养。
要使细胞在离体情况下生长繁殖，培养条件必须尽可能接近体内，除营养物质外，温度、PH值、生长因子等也至关重要。
此外，还应避免细菌及其他微生物的污染，重金属离子及有毒化学物质及放射线的影响。
贴壁细胞通过质膜表面的粘着蛋白贴附于培养瓶表面。
加入消化液可使粘着蛋白部分水解，从而使培养的细胞游离。
但消化时间不可过长，否则可能导致细胞解体死亡。
常用的消化液为胰蛋白酶和EDTA。
二者可分别使用，也可共同使用。
钙离子是二者的抑制剂，故实验中消化结束时，加入含有钙离子的全培养液，即可终止消化。
细胞的一代是指细胞从接种到分离再培养的一段时间，与细胞世代或倍增不同，在一代中细胞倍增3～6次。
细胞传代后一般经过三个阶段：游离期、指数生长期和停止期。
原代细胞的培养
原代细胞的培养原代细胞的培养不知道遭到多少研究生及博士生吐槽，其真实情况是，一边在超净工作台上哭，一边手上还在不停地提取原代细胞。
相比较细胞系细胞而言，原代细胞的培养周期长、成本高、摸索困难。
从大鼠的筛选分笼到母鼠受精怀孕，从孕育周期的看护到胎鼠的出生降临，从胎鼠脑组织的提取到神经细胞的培养，到最后的药物对原代细胞的作用机制研究。
这种复杂和辛苦的原代培养过程，其实也是最能反应药物在实验小白鼠上作用机制和效果最真实的反应。
1、大鼠的筛选和分笼首先是一个大笼子里放6只大鼠（5雌性，1雄性），每隔两天喂水和繁殖饲料，一星期给大鼠换一次垫料（给大鼠换垫料是体力活）。
舒适的空间和环境能让大鼠更好地繁殖，产下更多的胎鼠用于科学研究。
2、原代细胞的提取及培养原代细胞的提取一般是将胎鼠先用纯净水冲洗干净，在放进超净工作台处理。
先将胎鼠放入75%酒精消毒1min,再用手术剪刀将胎鼠的脑组织提取出来，放入遇冷的D-Hank's液中。
用手术剪刀将皮层的脑组织剪碎，加入等体积的0.25%胰酶进行消化，置于二氧化碳培养箱37℃培养。
（1）新生大鼠原代海马组织中神经干细胞的培养取新生24h内新生大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min，用剪刀将头颅取下，剥离颅骨，暴露皮质下海马组织，于冰上快速取出组织放在遇冷的DMEM/F12或者PBS缓冲液中清洗，吸出置于15mLEP中，加入ACCUTASE1.5-2.0mL置于培养箱中，37℃、5%CO2混匀消化10min，取出混匀吹打组织块，1000r.5min-1离心，加入培养基重悬细胞过200目细胞筛（70μm），置于37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养。
通过Nestin染色鉴定星形胶质细胞以确保纯度。
（2）大脑皮层原代星形胶质细胞培养细胞制备和培养从1 日龄新生Sprague-Dawley 大鼠的大脑皮层制备原代星形胶质细胞。
简而言之，分离大脑皮质并用0.25% 胰蛋白酶在37°C下消化15 分钟，然后通过70 μm 细胞过滤器过滤。
005 动物细胞原代培养
（一）胰酶消化细胞培养 1、取材：将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡5秒钟（时间不能过长、 以免酒精从口和肛门浸入体内）入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）置 平皿中，解剖取肝脏（肾脏、心脏）。 2、用PBS液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。 3、用手术剪将肝脏（肾脏、心脏）剪成小块（1mm2），再用PBS液洗三次， 转移至离心管中。 4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化40分钟，每隔5分钟振 荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5、加入3—5ml培养液（或血清）以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 6、100目滤网过滤，取悬液加入到离心管中。 7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 8、加入PBS液5ml，吹散细胞，再离心一次，弃上清液。 9、加入培养液4ml，吹散细胞。 10、取3ml细胞悬液于细胞培养瓶中，再加1ml血清。于二氧化碳培养箱培养。 11、取步骤9中的1ml细胞悬液，加入2-3滴胎盘蓝染液，用血球计数板计数并 测算细胞存活度及细胞浓度。
1、进一步了解动物组织细胞培养条件与设施
将动物机体的各种组织从机体中取出，经 各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用 EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞， 置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、 生长和繁殖，这一过程称原代培养。
器材：二氧化碳培养箱（调整至37℃），培 养瓶、青霉素瓶、100目不锈钢滤网、平皿、 吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计 数板、离心机、水浴箱（37℃） 材料：胎鼠或新生鼠 试剂：1640培养基（含20%小牛血清）， 0.25%胰酶，Hank’s液（或PBS），碘酒。
5.计算原细胞悬液的细胞数: 按照下面公式计算细胞密度： （细胞悬液的细胞数）/ml＝（ 四个大格子细胞 数/4)×104
动物细胞原代培养
动物细胞原代培养
小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在 打开之容器正上方操作实验。容器打开后， 以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取 用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放臵桌面。 细胞培养应在超净工作台或有空气滤过装臵 的工作间里进行。 培养液或其它溶液不应该在工作区以外打开 。 装吸管或吸头的容器也不应该在工作区以外 打开。
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原代培养程序
取材 漂洗 剪切 消化 制备单细胞悬液 接种
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日常维护及注意事项
1.所有镜头表面必须保持清洁，落在镜头表面的灰尘，可用吸耳球吹去，也可用 软毛刷轻 轻的掸去掉。 2.当镜头表面沾有油污或指纹时，可用脱脂棉蘸少许无水乙醇和乙醚的混合液（3:7）轻轻 擦拭。 3.不能用有机溶液清擦其它部件表面，特别是塑料零件，可用软布蘸少量中性洗涤剂清擦。
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实验动物的选择
小鼠，清洁级。(选择大约一半足孕时间的胚 胎，10－13天龄胚胎含有最大数量的未 分化的间质细胞，成纤维细胞可从这些 细胞衍生获得。)
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实验材料
药品：RPMI1640培养液，小牛血清(FCS)， 0. 25% 胰蛋白酶 ，PBS（-） 器材：培养瓶1支/组，50ml离心筒2支/组，培 养皿1套/组，吸管1支/组，EP管1支/组 （在无菌室共用试剂车取用），剪子1把 /组，镊子1把/组，滤器1支/组。 设备：水浴摇床、离心机、二氧化碳培养箱、 倒置显微镜
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操作步骤
1、开机。接连电源。打开镜体下端的电控开关。 2、使用 （1）准备：将待观察对象置于载物台上。旋转三孔转换器，选择较小的物镜。 观察，并调节铰链式双目目镜，舒适为宜。
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• 3．实验器材
• 超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、 水浴锅、离心机、眼科剪、眼科镊、移液 器及枪头、培养皿、烧杯、细胞培养瓶、 吸管、离心管、血球计数板、载玻片、盖 玻片、200目不锈钢筛网、酒精灯、75％酒 精棉球、记号笔等。
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四、实验方法与步骤
• 1．取1只大鼠，颈椎脱臼法处死，浸入75%乙醇消毒。 • 2. 将小鼠置于超净台中的大培养皿中，背部朝上，用
细胞被污染。 • 3. 在CO2培养箱中，若选用的培养瓶螺旋盖不带有滤膜，
则应将瓶盖拧松，保持通气状பைடு நூலகம்。 • 4．实验过程中，实验人员要严格遵守无菌操作流程。
动作要轻柔，安装吸头、打开或封闭瓶口等操作应在火 焰近处并经过烧灼后进行。操作时，避免讲话、咳嗽， 以防唾沫或呼出气流造成污染。取用液体前不宜过早开 盖，使用完毕应立即封闭瓶口。吸取液体或细胞悬液时， 应专管专用，一旦吸管前端接触了手或其他污染物时应 更换，吸出后残留的液体不可重新加入原瓶，以防污染 扩大或造成培养物间的交叉污染。 • 5. 实验结束后，应将实验废液或废物及时移出无菌室， 并用消毒水擦拭超净台，保证清洁。
实验一 动物细胞原代培养
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• 一、实验目的 • 1．掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 • 2. 掌握动物细胞原代培养的基本方法。
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• 二、实验原理 • 原代培养( primary culture )是指取自体内的
新鲜组织、细胞，在体外条件下生长至传 代之前细胞培养阶段，是细胞培养的最初 和必经阶段。原代培养方法主要有组织块 贴壁培养法和分散细胞培养法。
• 组织块贴壁培养法是将切成小块的组织贴 附在适宜的支持物上，细胞从组织块边缘 游离、生长，形成单层细胞即为原代培养 细胞。
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实验五动物细胞的原代培养一、实验目的1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。
2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。
3．初步掌握无菌操作方法。
二、实验原理细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。
细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。
因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。
如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。
原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。
这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。
要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。
三、实验仪器、材料和试剂1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。
上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9×l04 Pa（15磅）灭菌30 min，备用。
此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板以及包装灭菌的工作服、口罩和帽子等。
2．试剂（详见附录）：①平衡盐液：Hank’s液；②细胞消化液：常用的有0.25 %的胰蛋白酶（活性1∶250）；③ 0.5 %水解乳白蛋白－Hank’s液（简称Hanks 液）；④小牛血清；⑤ 7.4 % NaHCO3；⑥1 000 u/ml青霉素、链霉素液。
以上溶液均经适当包装，灭菌后备用。
3．材料：出生后2～3 d的乳鼠。
四、方法与步骤（一）乳鼠肝细胞原代培养的基本过程1．消化法（以胰蛋白酶液消化为例）（1）手的清洗与消毒操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在适合的位置，然后配制营养液及调节平衡盐液的pH值。
1）乳鼠肝细胞营养液的配制0.5 % LH液90 %小牛血清10 %1万u/ml青霉素、链霉素加至约100 u/ml7.4 % NaHCO3调pH至6.8～7.02）平衡盐液-Hank’s液的调节用7.4 % NaHCO3调Hank’s的pH至6.8～7.0（2）处死动物取乳鼠，拉颈椎处死，然后用75 %酒精浸泡2～3 s（注意小鼠在酒精中不宜过长，以免酒精从口和肛门中侵入，影响组织生长）。
（3）取肝用碘酒和酒精消毒腹部，用眼科小剪子剪开腹部皮肤后，暴露皮下组织，再次用碘酒和酒精消毒皮下组织，更换剪子和镊子，打开腹腔，即可见到肝脏。
剪1 cm2肝组织，放在无菌的培养皿中。
（4）剪肝用Hank’s液洗涤3次，并剔除脂肪结缔组织、血液等杂物。
将干净的肝组织块移到装有青霉素的小瓶中，用弯头剪把肝组织剪成1 mm3大小的碎块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用Hank’s液洗2～3次，直到液体澄清为止。
图18-1 消化法原代培养基本步骤（5）消化及分散组织块将上步清洗过的Hank’s液吸掉，按组织块体积的5～6倍量加入0.25 %的胰蛋白酶液（pH为7.6～7.8）。
置于37℃水浴中进行消化。
消化时间在20～40 min 左右（消化时间的长短与多种因素有关，如胰蛋白酶的活性及浓度，不同动物及年龄、组织块的大小等等）。
每隔10 min摇动一次青霉素瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变白色为止。
这时可从水浴中取出青毒素瓶，吸去胰蛋白酶液。
此时再用Hank’s液洗涤2～3次。
然后，加入少量Hank’s液，用吸管反复吹打织织块，直到大部分组织块均分散成混淆的细胞悬液为止。
此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布（或不锈钢网）进行过滤，以去除部分较大的组织碎片。
（6）计数与稀释从上步滤过的细胞悬液中吸取1 ml细胞液，进行计数。
将细胞液滴于血细胞计数板上，按自细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释，稀释后的浓度一般以每ml含细胞30～50万为宜。
（7）分装与培养将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般5 ml/小方瓶），盖紧瓶塞。
在培养瓶的上面做好标志，注明细胞、组别及日期。
然后轻轻摇动，避免细胞堆积，以便细胞能均匀分布。
最后将培养瓶置于CO2培养箱，37 ℃条件下进行培养。
2．组织块法（1）其他步骤同以上1～3，然后将肝组织移人一新的培养皿中，用吸管吸取0.5 ml培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成1 mm3左右的小块。
（2）用一弯头吸管小心地将剪碎的肝组织块吸人，放置于培养瓶底部。
（3）并用弯头吸管头移动肝组织块，使其在培养瓶底部均匀分布，控制每小块间距在0.5 cm左右，25 ml培养瓶放置15～20块。
（4）吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。
（5）轻轻将培养瓶置于培养箱中培养。
（6）24 h后取出观察，即有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。
（二）原代培养细胞的观察置于37 ℃培养的细胞，需逐日进行观察。
1．组织块法培养细胞的观察培养24 h后，倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来；48 h后，可见大量的细胞放射状排列于组织块周围，这些细胞胞核较大，胞质内含物少、透明度高，彼此间排列紧密。
靠近组织块的细胞胞体较小、较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态间于圆形与多角形之间。
2．胰蛋白酶消化法培养细胞的观察在倒置显微镜下，可见刚接种于培养瓶中的细胞胞体均成圆形，悬浮于培养液中。
24 h后，大多数细胞已贴附于培养瓶底部，胞体伸展，重新呈现出其肝细胞原有的、不规则多有形上皮性细胞特征。
48 h以后，细胞开始增殖，细胞的数量明显增多，在接种的细胞或细胞团的周围可见有新生的细胞，这些细胞胞体轮廓通常较浅，因内含物少而较为透明。
96 h以后，新生的细胞将逐渐连接成片，胞体轮廓增强，核仁明显可见，透明度减弱。
观察时注意：（1）培养物是否被污染，如培养液变为黄色且混浊，表示该瓶被污染。
（2）细胞生长状况与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好，可能是瓶塞未盖紧或营养液pH值过高。
（3）培养液若变为桔红色，一般显示细胞生长良好。
经过1～2 d培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。
换液时也要注意无菌操作在酒精灯旁倒去原培养瓶中的营养液，再加入等体积新配营养液，pH 7.0。
若经2～3 d后，细胞营养液变黄，此时表示细胞已生长。
如果希望细胞长得更好些，此时也可换液。
换液时，所用的溶液称为维持液，它与营养液的组成完全相同，仅所用血清量为5 %。
以后，每隔3～4 d（视细胞液pH值而定）更换一次维持液。
待细胞已基本长成致密单层时，此时即可进行传代培养。
（三）培养细胞生长期的划分大多数二倍体细胞在培养过程中维持有限的生存期，最多生存一年左右，传30～50代，相当于150～300个细胞周期。
在全生存过程中，大致经历以下三个阶段：1．原代培养期从体内取出组织接种培养到第一次传代的阶段，一般持续1～4 w。
此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。
原代培养细胞与体内原组织相似性大，细胞是异质的（heterogeneous），相互依存性强，细胞克隆形成率很低，与体内细胞性状相似，是药物测试很好的对象。
2．传代期在全生命期中持续时间最长，在培养条件好的情况下，细胞增殖旺盛，并维持二倍体核型。
为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养或传代后早期冻存。
目前世界上常用细胞系均在不出10代内冻存。
如不冻存，则需反复传代，这样有可能失掉二倍体性质。
当传30～50代后，细胞增殖缓慢以至完全停止。
3．衰退期细胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。
在细胞生命期中，少数情况下在以上三期任何一期均可发生细胞自发转化。
转化的标志之一是细胞获得永久性增殖能力，成为连续细胞系（株）。
连续细胞系的形成主要发生在传代期。
转化后的细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（immortality）而无恶性。
所有体外培养细胞包括原代培养和各种细胞系（株），生长达到一定的密度后都需做传代处理。
传代的频率和间隔与接种细胞数量、细胞生物学性质以及营养液性质等有关。
接种细胞多则细胞数饱和速度快；连续细胞系和肿瘤细胞系比原代培养细胞增殖快；培养液中血清含量多时，细胞增殖快。
一般是在细胞长满瓶壁，培养液pH稍降低时做分离培养。
依据细胞特性，将一瓶细胞1∶4或1∶3（即1瓶传4瓶或3瓶）传代。
如NIH3T3成纤维细胞，每3 d传代，接种3×105个/ml。
在细胞长满瓶壁后应尽早传代。
否则细胞会中毒，形态发生改变，重则从壁上脱落死亡。
传代过晚（若已有中毒迹象）能影响下代细胞的机能状态，细胞需要再传一两代把不健康的细胞除去，才能恢复使用。
注意事项：在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。
为此，在操作前要认真地洗手并用75 %乙醇消毒。
操作前20～30 min即将超净台打开吹风。
操作时，严禁说话，严禁用手去拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳，镊子等去拿。
要在超净台内才能打开培养瓶瓶塞，打开之前要用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。
操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。
使用的吸管在从消毒筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再吸取液体。
总之，在整个无菌操作过程中，都应该在酒精灯的周围进行。
五、作业与思考题1．简述细胞原代培养的操作程序及注意事项。
2．细胞培养获得成功的关键要素是什么？。