实验五 动物细胞的原代培养

实验五动物细胞的原代培养

一、实验目的

1．了解原代细胞培养的基本方法及操作过程。

2．学习细胞消化、营养液的配制及酸碱度的调节。

3．初步掌握无菌操作方法。

二、实验原理

细胞培养（cell culture）是用无菌操作的方法将动物体内的组织（或器官）取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养，使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、分化以及衰老等过程。

细胞培养的突出优点是：便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；便于人们对细胞内结构（如细胞骨架等）、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的一种简便易行的实验技术，同时也不可忽略另一个困素，那就是它脱离了生物机体后的一些变化。

细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学及病毒学等。

为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的内基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞（primary culture cell）与传代细胞（subculture cell）有一个基本的了解。

原代细胞培养又称原代培养（primary culture），是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，在体外培养，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节；二是严格控制无菌条件。

三、实验仪器、材料和试剂

1．器材：解剖剪、解剖镊、眼科剪（尖头、弯头）、眼科镊（尖头、弯头）、

培养皿、纱布块（或不锈钢网）、玻璃斗、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶（小方瓶或中方瓶）等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9×l04 Pa（15磅）灭菌30 min，备用。此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板以及包装灭菌的工作服、口罩和帽子等。

2．试剂（详见附录）：①平衡盐液：Hank’s液；②细胞消化液：常用的有0.25 %的胰蛋白酶（活性1∶250）；③ 0.5 %水解乳白蛋白－Hank’s液（简称Hanks 液）；④小牛血清；⑤ 7.4 % NaHCO3；⑥1 000 u/ml青霉素、链霉素液。以上溶液均经适当包装，灭菌后备用。

3．材料：出生后2～3 d的乳鼠。

四、方法与步骤

（一）乳鼠肝细胞原代培养的基本过程

1．消化法（以胰蛋白酶液消化为例）

（1）手的清洗与消毒操作者首先进行手的清洗与消毒，再将实验用品放在适合的位置，然后配制营养液及调节平衡盐液的pH值。

1）乳鼠肝细胞营养液的配制

0.5 % LH液90 %

小牛血清10 %

1万u/ml青霉素、链霉素加至约100 u/ml

7.4 % NaHCO3调pH至6.8～7.0

2）平衡盐液-Hank’s液的调节

用7.4 % NaHCO3调Hank’s的pH至6.8～7.0

（2）处死动物

取乳鼠，拉颈椎处死，然后用75 %酒精浸泡2～3 s（注意小鼠在酒精中不宜过长，以免酒精从口和肛门中侵入，影响组织生长）。

（3）取肝

用碘酒和酒精消毒腹部，用眼科小剪子剪开腹部皮肤后，暴露皮下组织，再次用碘酒和酒精消毒皮下组织，更换剪子和镊子，打开腹腔，即可见到肝脏。剪1 cm2肝组织，放在无菌的培养皿中。

（4）剪肝

用Hank’s液洗涤3次，并剔除脂肪结缔组织、血液等杂物。将干净的肝组织块移到装有青霉素的小瓶中，用弯头剪把肝组织剪成1 mm3大小的碎块，组织块的大小应尽量均匀一致，再用Hank’s液洗2～3次，直到液体澄清为止。

图18-1 消化法原代培养基本步骤

（5）消化及分散组织块

将上步清洗过的Hank’s液吸掉，按组织块体积的5～6倍量加入0.25 %的胰蛋白酶液（pH为7.6～7.8）。置于37℃水浴中进行消化。消化时间在20～40 min 左右（消化时间的长短与多种因素有关，如胰蛋白酶的活性及浓度，不同动物及年龄、组织块的大小等等）。每隔10 min摇动一次青霉素瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、粘稠状，并且颜色略变白色为止。这时可从水浴中取出青毒素瓶，吸去胰蛋白酶液。此时再用Hank’s液洗涤2～3次。然后，加入少量Hank’s液，用吸管反复吹打织织块，直到大部分组织块均分散成混淆

的细胞悬液为止。此时，可将分散的细胞悬液经过灭菌的纱布（或不锈钢网）进行过滤，以去除部分较大的组织碎片。

（6）计数与稀释

从上步滤过的细胞悬液中吸取1 ml细胞液，进行计数。将细胞液滴于血细胞计数板上，按自细胞计数法进行计数，计数后用营养液进行稀释，稀释后的浓度一般以每ml含细胞30～50万为宜。

（7）分装与培养

将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中（一般5 ml/小方瓶），盖紧瓶塞。在培养瓶的上面做好标志，注明细胞、组别及日期。然后轻轻摇动，避免细胞堆积，以便细胞能均匀分布。最后将培养瓶置于CO2培养箱，37 ℃条件下进行培养。

2．组织块法

（1）其他步骤同以上1～3，然后将肝组织移人一新的培养皿中，用吸管吸取0.5 ml培养基置于肝组织上，用另一眼科剪将其剪成1 mm3左右的小块。

（2）用一弯头吸管小心地将剪碎的肝组织块吸人，放置于培养瓶底部。

（3）并用弯头吸管头移动肝组织块，使其在培养瓶底部均匀分布，控制每小块间距在0.5 cm左右，25 ml培养瓶放置15～20块。

（4）吸取少量培养基，沿培养瓶颈缓缓滴入，培养基的量以恰好能浸润组织块底部、但不会使组织块漂浮为佳。

（5）轻轻将培养瓶置于培养箱中培养。

（6）24 h后取出观察，即有少量细胞从组织块周围游离而出，视需要补以少量培养基。

（二）原代培养细胞的观察

置于37 ℃培养的细胞，需逐日进行观察。

1．组织块法培养细胞的观察

培养24 h后，倒置显微镜下可观察到少量的细胞从组织块边沿游离出来；

48 h后，可见大量的细胞放射状排列于组织块周围，这些细胞胞核较大，胞质内含物少、透明度高，彼此间排列紧密。靠近组织块的细胞胞体较小、较圆，离组织块较远的区域可见有多角形的细胞，体积较大，有些细胞的形态间于圆形与多角形之间。

2．胰蛋白酶消化法培养细胞的观察