免疫学检验分析技术

生物医学技术论文

免疫学检验分析技术

姓名：陶晨宇

系部：16级医疗器械工程工程完成日期2017年5月14日

免疫学分析方法(immlmological assay，IA)是以抗原与抗体的特异可逆结合反应为基础的分析技术。它集高灵敏性和强特异性于一体，20世纪90年代开始应用于抗生素残留的检测中。IA主要包括酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentasssy，ELISA)、放射免疫分析法(radio immunological assay，RIA)和荧光免疫分析法(fluorescence immunnological assay，FIA)等。目前，应用于抗生素残留分析的主要是ELISA。IA具有特异性强，灵敏度高，操作简便、快速，能同时筛选大量的样品，检测费用低，不需要昂贵的仪器设备，适合推广应用等优点。但同时也存在假阳性和假阴性偏多，提取液中杂质成分对检测结果干扰大，通常一次实验仅能检测一种抗生素残留等不足。

目前，IA已用于β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素类、四环素类和磺胺类抗生素残留的检

测中。用氨苄青霉素作为半抗原通过戊二醛法合成免疫抗原，免疫兔子后获得多克隆抗体，可用于检测牛奶中青霉素类药物残留。应用商品化的cHARMⅡ放射免疫系统可检测动物血清、尿液和组织中青霉素类抗生素残留。应用EuSA检测牛奶和肾脏样品中新霉素、庆大霉素和链霉素残留，其回收率大于80％。以牛血

清白蛋白为载体蛋白合成磺胺甲基嘧啶人工抗原，免疫兔子获得多克隆抗体后，以ELISA可检测乳中磺胺甲基嘧啶残留，检测限为24ng／mL。

今后，抗生素残留免疫学检测技术的发展方向，至少包括以下几个方面：①需要进一步规范抗生素残留免疫检测方法的操作步骤以及实现试剂的标准化。②将免疫检测方法与其他常规方法相结合，发挥各自的优势。例如，先用免疫分析法对大量样品进行粗筛，再用HPLC等方法确证，或首先采用免疫亲和色谱柱对样品进行提取与净化，然后再进行仪器分析，这样可以大大减少分析的时间。③利用抗体蛋白质芯片技术或通用抗体技术实现抗生素多残留的同时分析。④采用基因工程技术制备人工抗体。

现代免疫学检验技术源于标记技术在免疫学中的应用。科技的进步推动免疫检验技术的迅速发展，正从单一的免疫诊断技术向单细胞、多基因、微量化等方面发展。而哮喘、器官和骨髓自身免疫性疾病、变态反应、淋巴细胞和浆细胞的恶性肿移植、瘤以及继发性和原发性免疫缺陷的临床诊断都客观要求免疫学检验技术更加精确，并且能够定量评价临床治疗的有效性。

酶联免疫斑点技术酶联免疫斑点技术是一种用于测定B细胞分泌免疫球蛋白、T细胞分泌细胞因子功能的分析技术，是定量酶联免疫吸附试验技术的发展和延伸。

酶联免疫斑点技术的原理是在微孔培养板底部植入抗CK或Ig的特异性单克隆抗体。待检测样本进入微孔板内培养时，在有丝分裂原或者特异性抗原的作用下，活化记忆型T细胞或B细胞，产生CK或Ig。细胞下方的固相单克隆抗体就会捕获CK或Ig物质。细胞被清洗后，加入生物素化的第二抗体，抗体和CK或

Ig物质结合后，再加以酶做标记的生物素或亲和素反应，以酶

荧光素标记抗体技术是建立在免疫荧光、免疫微球和流式细胞分析等实验技术基础上的一种新的血清学实验方法。利用荧光对抗体进行染色可电以获得所需信息的原理而研制的流式细胞仪，具有激光技术、子计算机技术和单克隆抗体技术特点，主要用于细胞表型、细胞内及核膜成分、DNA含量等领域的分析。它具有在同一试管中同步检测多种靶物质的潜在特征，受到许多临床检验学者的关注。迄今尚未进入临床应用。

四聚体分析技术该技术利用T细胞表面的TCR可与构建的四聚体的表位肽相

互作用而精确识别，从而可以高亲和力结合，进而达到检验抗原特异性T细胞的作用[1]。在此分析技术上衍生的检验方法主要有MHC-肽四聚体流式细胞技术、原位MHC-肽四聚体染色法、MHC-肽四聚体磁分离技术、MHC-肽四聚体ELISA技术、MHC-肽四聚体分子微阵列技术等，主要用于肿瘤抗原特异性T细胞、病毒等的检验。

间接免疫荧光技术，用作细胞内抗原定位或相应抗体检测的对照标准，主要用于抗病原体、抗核抗体、抗平滑肌抗体等以及其他呼吸道病原体抗体的检测等。可降低手工操作的误差以及提高标准化检测和自动化程度。该技术比较成熟，已经可以进行商品开发。

酶标记免疫检验技术，酶联免疫吸附试验技术理论上只要是某一抗原纯品或相应的抗体，都可以用酶联免疫技术进行检测，因此，可溶性抗原、抗体系统都可以用该技术进行检测，广泛应用于各种微量蛋白（例如细胞因子、小分子激素、肿瘤标志物等）和血源病原体（抗原和抗体）。酶联免疫吸附试验技术（ELISA）以免疫过氧化物技术为基础，敏感性高，特异性强，操作简便，易于观察，便于大规模检查。已经用于临床应用。

底物显色，阳性细胞就可形成直径约50～200μm大小不等的圆形着色斑点，每一个斑点对应分泌CK或Ig的一个细胞，而特定阳性T、B细胞族群的产生则可以通过斑点直径的大小可以直接反映。酶联免疫斑点技术既可用于分泌抗体的B细胞，也可用于分泌各类CK的T细胞。酶联免疫斑点技术也是T细胞功能检测的标准技术，具有较高的检测灵敏度。

元素标记免疫检验技术，元素标记免疫检验技术中的标记元素主要有镧系元素（Eu3+，Tb3+，Sm3+）和钌元素（Ru），其检验技术分别是分辨荧光免疫分析技术和电化学发光免疫分析技术。前者可以应用在两种指标的同时测定，后者可以在电场作用下反复被激发而使信号得以放大。

核酸标记免疫检验技术，其设计原理是核酸的扩增或转录，扩增是DNA通过聚合酶链反应在较短的时间内按几何级数扩增，可以达到数百万倍；而转录翻译则是通过标记的抗体DNA与抗原反应后进行胞外转录翻译成相应的酶进行测定。这两种方法的检测都有较大的灵敏性，但还处在研究阶段。

量子点标记免疫检验技术在传统的标记免疫分析技术中，放射免疫分析存在污染，酶免疫分析灵敏度较低，发光免疫分析和荧光免疫分析发光时间短，容易淬灭。早在20世纪70年代就引起科学家重视的量子点由于良好的光电性能重新引起了人们的广泛关注，开始在标记免疫分析中初步应用，并取得了令人满意的效果。量子尺寸很小，电子和孔穴被量子陷域，连续能带变成分立能级结构，能够接受激发产生荧光，因此它实际上是一种探针。目前应用较多的是Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～V族元素组成的纳米微粒。研究较多的主要集中在CdX（X＝S、Se、Te），粒径范围为2～20nm，还有一些复合结构以及多层结构。在免疫示踪定位、生物多组分同时测定、细胞成像及疾病早期诊断中具有较广泛的应用价值。