《形态学实验技术》PPT课件

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固定的目的：
1.迅速防止组织细胞的死后变化,防止自 溶与腐败使之尽量保持生前的形态结 构。
2.使细胞内的蛋白质、糖、脂肪、酶等 成分变为不溶性物质，以保持其原有 形态及特定位置。
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3.能将细胞的半液体状变成半固体状， 使组织变硬以利切片。
4.可使组织内的各种成分产生不同的折 光率。
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常用的透明方法
二甲苯透明法（常用）：彻底脱水的组织 块 二甲苯1 二甲苯2，此二步总的时 间不超过40分钟。
氯仿透明法：彻底脱水的组织块按 3：1 氯仿、纯酒精混合液1小时 氯仿1 - 2小 时 1：1氯仿石蜡混合液1小时。
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五、浸蜡与包埋
浸蜡(paraffin infiltrating)和包埋(embedding)
形态学实验技术
河北联合大学实验中心 李琪佳
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重点介绍：
组织切片制作技术
石蜡切片常规染色技术 石蜡切片特殊染色技术
免疫组织（细胞）化学技术
免疫细胞化学的理论基础 免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术
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电子显微镜技术（electron microscope, EM）
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第一章 组织切片制作技术
第一节概述
组织切片的制作技术属于组织病理学范 畴它是指采用包埋剂使组织内渗入某种支 持物质，使组织保持一定的硬度，然后利 用切片机切成薄片，经染色在显微镜下观 察。根据支持物的不同，有石蜡切片、明 胶切片、塑料切片、冷冻切片等类别。制 成的切片捞置于载物网上，经烘干后可进 行染色或备用。
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四、透明（clearing）
为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后必须经 过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂， 而达到石蜡浸入组织块的目的。此时因组织块的 水分被二甲苯取代，其折射指数接近于组织蛋白 的折光指数，组织块变得透亮。因此透明是石蜡 包埋前的一个特定步骤。
透明的目的：便于浸蜡、包埋。透明剂即能与脱水
1. 透射电子显微镜 2. 扫描电子显微镜 3.电镜技术与生物医学超微结构 4. 细胞超微结构与超微结构病理
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激光扫描共聚焦显微镜技术（Confocal Laser Scanning Microscope）集高、精、
尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。该仪器 突破了普通光学显微镜不能对细胞或组织内部进 行定位检测的限制，实现了对细胞内部光学断层 扫描成像。可检测细胞内核酸、细胞骨架、细胞 内pH、Ca离子浓度、膜电位、过氧化物、细胞 间通讯、细胞筛选及定量等。为活细胞功能研究 开辟了新途径，成为现代细胞生物学研究不可缺 少的的工具。
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组织切片技术包括组织的取材、固定、 脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及染 色等。
组织病理学标本大致可分为：手术标 本、内镜取材标本、穿刺标本、细胞 学标本
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第二节 组织的处理
取材 固定 脱水 透明 浸蜡与包埋
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一、取材（ tisssue processing）
1 材料新鲜：活检组织离体后立即固定，最 迟不能高于30分钟。
是指标本经过前期处理后，再置于支持 物中，使支持物透入组织内部，并将组织 埋入、包裹的过程。常用的支持物有明胶、 石蜡、火棉胶、树脂、炭蜡等，他们及时 浸透剂又是包埋剂。其中最常用的是石蜡。
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浸蜡的方法
此法应在560C－620C的温箱内进行，液状 石蜡的量应为标本的25－30倍。
方法：透明后的组织 520C－540C（软蜡） 1小时 540C－560C石蜡1小时 580C－ 600C（硬蜡）1小时 540C－560C石蜡进 行包埋
4.防止变形：固定后的组织或多或少会产生 收缩现象
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5 组织块力求小而薄：切块的大小、厚度及 质地决定了固定的效果，一般情况下，取 材大小为2×1cm，厚度为2－4mm。
二、固定（fixation）
固定是将某些化学试剂（固定液）渗透到需 要保存或制作切片的脏器或组织、细胞中， 使其所含物质尽量保持在生活状态时的形 态结构和位置。
2 取材部位及切面：纵切或横切往往是显示 组织结构明晰的关键。掌握正确的取材部 位就必须熟悉机体的组织结构和解剖特点， 原则上应在病变与正常组织的交界处取材， 避开坏死出血区。
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，甚至卷曲变形，特别是神经肌肉组织，可 将其两端扎在木片或小木棍上进行固定。 3.勿使组织受挤压：取材刀剪应锋利，切 开时取材刀严禁来回挫动，以避免组织结 构变形、细胞破碎。
将组织内的水分用某些化学试剂置换出来 的过程
脱水的目的
标本经固定和水洗后，组织内有大量水份， 不能与二甲苯混溶，因此必须脱水。
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常用的脱水剂和脱水方法
脱水剂有：乙醇、丙酮等
80％ 酒精
30 分钟
95％ 酒精
1－2小时
95％ 酒精
1－Hale Waihona Puke Baidu小时
100％酒精
1－2小时
100％酒精
1－2小时
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剂相混溶，又能与包埋剂（石蜡）相混溶，起 到桥梁作用。
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大多数脱水剂不能和包埋剂（石蜡）混溶， 故必须通过透明剂置换出脱水剂后才能进 行后续程序。 常用的透明剂 二甲苯：为最常用的透明剂，有毒、易燃、 易挥发；沸点1380C-1400C,长期接触对 粘膜有刺激作用。 氯仿:易挥发微溶于水，易溶于醇、醚、苯 等。它比二甲苯透明力差，但不宜使组织 变脆，使大块组织的良好透明剂
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流式细胞仪技术（Flow Microfluorimetry）
是一种单细胞定量分析和分选的新技术。 其范围包括了细胞表面或细胞内的各种抗 原、蛋白、酶以及基因表达产物；还有细 胞内的核酸定量或DNA倍体、细胞周期分 析；尤其是癌基因的检测、血细胞表型分 析、细胞分子和粘附分子的检查、细胞凋 亡分析、肿瘤相关抗原及单种细胞的纯化。
5.某些固定液可起助染作用而增进染色。
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固定方法 浸泡固定 注射、灌注固定 微波固定 蒸汽固定
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常用的固定剂
单纯性固定剂：甲醛（福尔马林 formalin） 乙醇；乙酸。
混合固定剂：中性甲醛pH 7.0（甲醛、磷酸 缓冲液）；A-F液 （甲醛、酒精）
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三、脱水（dehydration）