化学发光分析法

发光强度
化学发光反应的发光强度Icl是以 单位时间内发射的光子数表示，它
与化学发光反应的速率有关。
时刻t 的化学发光强度(单位时间
发射的光量子数)：
Icltcl
dc dt
如果反应是一级动力学反应，t时刻的化学发光强度Icl与 该时刻的分析物浓度c成正比，即化学发光峰值强度与分析
物浓度c成线性关系。在化学发光分析中，常用已知时间内
化学发光分析法
2.化学发光效率和发光强度
化学发光效率：
发射光子的分子数
cl 参加反应的分子 数 r f
化学ห้องสมุดไป่ตู้率：
激发态分子数
r 参加反应的分子数
发光效率：
发射光子的分子数
f 激发态分子数
化学效率主要取决于发光所依赖的化学反应本 身；而发光效率则取决于发光体本身的结构和性质， 也受环境的影响。
化学发光分析法
合成
高沸点溶剂（如二甘醇）
3-硝基邻苯二甲酸 + 肼
缩合反应
H2O + 3-硝基邻苯二甲酰肼 保险还粉原(强还原剂） 3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)
化学发光分析法
发光体系 ➢鲁米诺-H2O2体系 ➢鲁米诺-KIO4体系
化学发光分析法
鲁米诺-H2O2的反应是自身化学发光反应
在PH=11的水溶液中发光效率最大 鲁米诺与氢氧化物反应时生成了一个双负离子（Dianion），它可被过氧化 氢分解出的氧气氧化，产物为一个有机过氧化物。该过氧化物很不稳定， 立即分解出氮气，生成激发态的3-氨基邻苯二甲酸。 激发态至基态转化中，释放的能量以光子的形式存在，波长位于可见光的 蓝光部分
的发光总强度来进行定量分析。
t
t dc
A0Icltdtcl0 dtdtclc
化学发光分析法
二、常见的化学发光剂 和化学发光体系
鲁米诺 过氧化草酸酯 酸性高锰酸钾 四价铈 吖啶酯化合物
化学发光分析法
• 鲁米诺早在1853年就被合成出来了。1928年，化
学家首次发现这种化合物有一个奇妙的特性，它被 氧化时能发出蓝光。 • 刑侦学应用 在检验血痕时，鲁米诺与血红素（hemoglobin，血 红蛋白中负责运输氧的一种蛋白质）发生反应，显 出蓝绿色的荧光。这种检测方法极为灵敏，能检测 只有百万分之一含量的血。
A +B = C + D*（激发态分子） D* → D + h（激发态分子D* 的光辐射）
化学发光分析法
化学发光反应的条件
能快速地释放出足够的能量。能产生化学发光的物质大多 为有机化合物，芳香族化合物；化学发光反应多为氧化还原 反应，激发能与反应能相当 ，E=170～300 kJ/mol；发光 位于可见光区； 处于激发状态的分子或原子必须能够放出光子，或者能够 转移它的能量到另一个分子上而使此分子被激发。
化学发光分析法
在免疫分析中的应用
• 将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中 间体) 直接标记在抗原或抗体上
• 免疫反应复合物上的酶作用于发光底物 目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP)
化学发光分析法
辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析
该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标 记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标 本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包 被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合 物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发 光增强剂使产生化学发光。
化学发光分析法
• 过氧化草酸酯（盐）自身并不发光，气化 学发光均为敏华化学发光。
• 原理：芳香草酸酯的过氧化氢的氧化作用
，芳香草酸盐和H2O2反应形成过氧草酰中
间体，当该中间体与蒽类衍生物等荧光剂 接触时，会发出强烈的所加荧光剂特有的 荧光。
化学发光分析法
化学发光分析法
化学发光分析法
过氧化草酸酯的化学发光反应体系
化学发光分析法
一、基本原理
化学发光反应：顾名思义，伴随着光辐 射发生的化学反应，成为化学发光反应。
化学发光剂：在不同的化学反应中，可 以和多种不同的组分反应并发生能量交换 ，生成激发态产物并产生发光现象的试剂 常被成为化学发光剂。它们可以是氧化剂 、还原剂、某些能生成自由基的物质。
化学发光分析法
1. 化学发光反应机制
化学发光分析法
➢基本原理 ➢常用的化学发光物质 ➢仪器装置 ➢影响化学发光的因素 ➢定性定量分析
化学发光分析法
• 化学发光（chemiluminescence）：又称为 冷光，它是在没有任何光、热或电场等激 发的情况下由化学反应而产生的光辐射。
由于不需要外源性激发光源，避免了背景光和杂 散光的干扰，降低了噪声，大大提高了信噪比。 具有灵敏度高，线性范围宽，设备简单，操作方 便，易于实现自动化，分析快等特点。在生物工 程学，药物学，分子生物学，临床和环境化学等 各个领域正显示出它蓬勃的生机。
化学发光分析法
应用
➢ 直接作用：增敏和抑制作用
过渡金属：Cu2+,Cr3+,Ni2+,Co2+,Fe2+
维生素B6，维生素B12，维生素C，吗啡，可待 因，肾上腺素，多巴胺，细胞色素
➢ 间接作用
如 Fe2+对鲁米诺-H2O2体系有催化增敏作用，而 蛋白质却抑制此作用，据此可建立检测血清中蛋 白质含量的方法。
化学发光分析法
鲁米诺(luminol) （又名发光氨）
• 化学名称为3-氨基邻苯二甲酰肼。 • 常温下是一种黄色晶体或者米黄色粉末，
是一种比较稳定的人工合成的有机化合物 • 化学式为C8H7N3O2 • 溶液显强酸性，对眼睛、皮肤、呼吸道有
一定刺激作用。
化学发光分析法
鲁米诺发光原理
化学发光分析法
➢酶
在体系中加入辣根过氧化物酶等，利用其对底物 的酶解并生成H2O2的反应，可测定酶含量、底物 含量或H2O2含量。
化学发光分析法
鲁米诺-KIO4体系
在PH=12~13的水溶液中，体系发光效率最大
➢催化作用 如Co2+,Mn2+,维生素C 1)利用该体系可测定样品中这些组分 2)利用Mn2+对该体系的催化作用来测定水 中的IO4-
在化学反应过程中，某些反应产物由于吸收了反应产 生的化学能，由基态跃迁至较高电子激发态中各个不同能 级，然后经过振动弛豫或内转换到达第一电子激发态的最 低能级，由此以辐射的形式放出能量跃回到基态。在个别 情况下，它可以通过系间跃迁到达亚稳的三重态，然后再 回到基态的各个振动能级，并产生光辐射，这两种光都是 化学发光。