磷脂酶A1水解大豆浓缩磷脂的研究

ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）程序对２６个实验点的响应值进行回归分 析。 ２结果与讨论 ２．１原料磷脂的理化指标 对原料大豆磷脂进行常规理化分析，得结果如下：
表１ 理化指标 酸值（ＫＯＨｍｇ／ｋｇ） 过氧化值（ｍｇｑ／ｋｇ） 水分（％） 乙醚不溶物（％） 丙酮不溶物（％） 碘值的测定 大豆浓缩磷脂的理化指标 大豆浓缩磷脂
ＣＨ２——０Ｈ
Ｌｄ、ｐＨ值、磷脂与溶液比ＰＬｓ／溶液５个可能影响磷 脂酶Ａ－水解浓缩磷脂的因素做单因素实验，以确定
Ｏ
Ｒ—Ｃ—Ｏ—ｃＨ
ＩＩ
相关因素及各因素的合适范围。 １．４．２响应面实验 根据参考文献［５－７１及单因素实
ｃＨ２一Ｏ—Ｐ——ｘ
ｏＨ
｜｜
验结果，选择对有影响的因素，采用响应面设计实验 做温度Ｔ、时间ｔ、加酶量Ｌｄ、ｐＨ值、磷脂与溶液比
ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ．Ｉｔｓ ａｐｐｌｉ—
ｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｏｏｄ ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｄａｉｌｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｅｔｃ．ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ｋｅｙ
Ｗｏｒｄｓ：Ｓｕｃｒｏｓｅ
２．３３ＡＤ＋８．８７ＡＥ－１６．９３ＢＣ一１３．７ｌＢＤ＋３．０９ＢＥ １２．６７ＣＥ＋１２．７０ＤＥ
ｏ．２４ＣＤ＋
上方程中：Ａ＝温度，Ｂ＝时间，Ｃ＝加酶量，Ｄ＝ｐＨ 值，Ｅ＝ＰＬＳ，溶液 由表３可知，温度、时间、加酶量、ｐＨ值、磷脂与溶 液比对磷脂的水解都有显著的影响。根据ＲＳＡ分析且 考虑到经济因素得出影响因素的最佳组合为：温度 ５ｌ℃、时间６ｈ、加酶量３．６％、ｐＨ值为５、ＰＬ“溶液为 ０．２５９ｍＬ，该条件下磷脂的酸值为６４．５（ＫＯｎｍｇ／ｌ【ｇ）。
袈６０
５０ ４ ５＿５
６
４一ｐＨ值５ 图２－４ ｐＨ值对酸值的影响
图２－２时间对酸值的影响
２．２．３加酶量对反应的影响
固定其它四个因素：
８０ ｊ四７０
Ｔ．５２℃、ｔ：６ｈ、ｐＨ值５．０、ＰＬｓ，溶液：２５％，反应总体积 ２０ｍＬ缓冲溶液。，考察加酶量对酶水解的影响。由图 可知加酶量从１．２．％到３．６％时，酸值增加；加酶量从 ３．６％到７．２％时，酸值趋于不变；因为该反应是一界 面反应，而该反应在酸性条件下抑制反应朝正反向 进行，故酸值不可能一直增加，并且当酶与底物的结 合点达到饱和时，再增加酶的量对反应影响很小。
１９．１
１．１８
０．１６ １．００５ ５７．０
９８．７４
电热真空干燥箱ＤＺＧ枷ｌ型：天津天宇机电有
限公司； 恒温磁力搅拌器８１—２型：上海司乐仪器厂； 电子天平ＢＳ－２２４Ｓ型：北京赛多利斯仪器系统 有限公司； 气相色谱仪ＧＣｌ １２Ａ：上海精密仪器厂。 １．３分析方法 大豆磷脂水解程度的测定：把浓缩磷脂混入不 同ｐＨ值的柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液中配成不同 浓度的反应液，加入一定量的酶液在设定的温度下 反应。反应一段时间，将产物脱溶测酸值。 大豆磷脂水解前后脂肪酸组成的测定：采用气 相色谱法对水解前后大豆磷脂脂肪酸组成进行分 析。气相色谱分析前，先制备脂肪酸甲酯；测定条件 为气相色谱仪ＧＣｌｌ２Ａ型；检测器：氢火焰离子化 检测器（ＦＩＤ）；毛细管柱：ＰＥＧ一２０Ｍ交联毛细管柱为 ２５ｍｘ０．３３ｍｍ；膜厚０．５ｕｍ；温度：检测器（２５０℃）、进样 口（２４０。Ｃ）、柱温（１７５℃）；载气（氮气）流速：３２ｍｌＪ
Ｅｖ＝６４．４６—１２．５９Ａ＋６．５８Ｂ－３．７０Ｃ一７．０７Ｄ一２２．４４Ｅ一 １ １．３５Ａ２—５．５９８２＋７．２３Ｃ２—０．７Ｄ２一１．５ｌＥ２—１９．９８ＡＢ一９．７３ＡＣ一
Ｔ：５２℃、ｔ：６ｈ、Ｌｄ：３．６％、ＰＬ√溶液：２５％，反应总体积 ２０ｍＬ缓冲溶液，考察ｐＨ值对酶水解的影响。在此 反应系统中，＇ｐＨ值作为主要因素之一，酶一般都有 最适ｐＨ值，在该条件下酶的活性最大，其催化能力 也强。由图可看出酸值随ｐＨ值的变化趋势。ｐＨ值 从４．２到５．０时，酸值呈上升趋势。而５．０到５．８这 一过程中，酸值呈下降趋势。 ２．２．５磷脂与溶剂比对反应的影响 本次试验ＰＬｓ，
ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ，ｍｉｃｒｏｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ，ｅｔｃ．ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏ—
ｗ－ａｓ
ｄｕｃｅｄ．Ｔｈｅ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｕｃｒｏｓｅ ｆａｔｔｙ．ａｃｉｄ Ｅｓｔｅｒ
磷脂是一种生物活性物质，具有独特的理化性 质和营养价值，在世界范围内的食品、保健品、医药 以及饲料行业越来越广泛使用。人食用磷脂可以起 到降低血脂、改善脂肪肝症状、健脑益智及延缓衰 老等生理功能”１。当用浓缩磷脂作乳化剂时，由于其 ＨＬＢ值在４左右，只能用做Ｗ／Ｏ型乳化剂，这就限 制了浓缩磷脂的使用范围。可以用化学和酶的方法 对浓缩磷脂进行改性，提高其ＨＬＢ值［２－３１。酶法由于 反应条件温和、产品安全可靠，较为常用的磷脂酶有 磷脂酶Ａ。、磷脂酶Ａｚ、磷脂酶Ｃ、磷脂酶Ｄ。
ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｅｓｔｅｒ；Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ；Ｐｒｏｇｒｅｓｓ
磷脂酶Ａ，水解大豆浓缩磷脂的研究
管伟举，谷克仁，李永端
（河南工业大学化学化工学院，４５００５２郑州市）
摘要：本试验进行了磷脂酶Ａ，水解大豆浓缩磷脂，利用响应面实验的方法，得到磷脂酶Ａ，水解 大豆磷脂最佳工艺条件为：反应温度５１０Ｃ、反应时间６ｈ、加酶量３．６％、ｐＨ值５．０、底物浓度０．２５９／ｍＥ。 利用气相色谱，分析了水解前后磷脂的脂肪酸组成。 关键词：磷脂；磷脂酶Ａ，；溶血磷脂；酶法改性
７０
６５
诣
４５ ４０ ４０ ４５ ５０ ５５ ６０ ６５
氢气流速：５０ｍＬ／ｍｉｎ；空气流速：５００ｍＬ／ｍｉｎ；进样 量：１／＿ＬＬ；灵敏度：１０９；分流比：１：５０。脂肪酸含量用 面积归一法求得。
温度（℃） 图２一ｌ 温度对酸值的影响
１３８
论文选集 固定其它四个因素：Βιβλιοθήκη Baidu：
中国粮油学会油脂专业分会第十四届学术年会
磷脂酶Ａ，水解磷脂分子中１位酯键，得到溶血 磷脂和脂肪酸。溶血磷脂分子式见图１。用磷脂酶 Ａ－水解浓缩磷脂制备溶血磷脂是界面反应，浓缩磷 脂在水中较难分散，而磷脂酶Ａ。溶解于水中，磷脂 酶Ａ－并不和单个的磷脂分子结合，对其进行水解。 只有当磷脂在水中的浓度超过临界胶束浓度（ＣＭＣ） 时，磷脂在水中形成单层（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）或双层（ｂｉｌａｙｅｒ） 的胶束。磷脂酶Ａ，游离到胶束和水的界面，酶的活 性部位和磷脂胶束结合，发生水解，反应中不需要金 属离子的参与。反应界面的大小直接影响到反应的 速度和水解的程度【４】。由于磷脂不同部位的脂肪酸
ｍｉｎ；
２．２单因素试验
２．２．１
温度对反应的影响
在本次试验中固定其
它因素：ｔ：６ｈ、Ｌｄ：３．６％、ｐＨ值：５．０、ＰＬｓ／溶液：２５％，反 应总体积２０ｍＬ缓冲溶液，考察温度对反应的影响。 由图可知温度从４４℃到５２℃时，酸值呈上升；当温 度由５２℃到６０℃时，酸值几乎随温度上升呈下降； 温度对酶反应是很重要的因素，每一种酶都存在最 佳反应温度段，所以在温度变化的初始阶段，随温 度升高酸值增加，最终达到其最佳反应温度，随后 升高温度引起酶失活，从而导致酸值随温度升高而 降低。
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｃｒｏｓｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ Ｅｓｔｅｒ
Ｌｉ
Ｆａｓｏｎｇ，Ｍａ Ｘｕｅｐｉｎｇ，Ｆｅｎｇ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
Ｇｕａｎｇｚｈｕ，Ｌｉ Ｈｅｐｉｎｇ，Ｌｕ Ｋｕｉ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５００５２，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ
７０
整６０
５０ １０％ ２０％ ３０％４０％ ５０％
底物浓度（ｇ，ｒｎＵ 图２－５底物浓度对酸值的影响
２．３响应面实验 选择温度、时间、加酶量、ｐＨ值、磷脂与溶液比 ５个因素，做５因素２６个实验点（５个中心点）的响应 面分析实验．实验数据及方差分析见表２，表３。 ２６个实验点分成两类：其一，析因点，自变量取值 在各因素取值构成的三维顶点，共有２１个析因点；其
图１
溶血磷脂分子式，Ｘ基团常见的有胆碱、
ＰＬｓ／溶液５因素共２６个实验点（５个中心点）的响应 面分析实验，运用ＳＡＳＲＳＲＥＧ（Ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｓｕｒｆａｃｅ
乙醇胺、丝氨酸、肌醇等。Ｒ是脂肪酸基团。
１材料与方法 １．１主要原料与试剂 大豆浓缩磷脂：市售；磷脂酶Ａｌ（Ｌｅｃｔｉａｓｅ Ｕｌｔｒａ）： 丹麦ＮｏＶｏ公司；柠檬酸、柠檬酸钠、石油醚、无水乙 醇、正己烷、氢氧化钾试剂均为分析纯；邻苯二甲酸 氢钾为基准试剂。 １．２主要仪器设备 水浴恒温振荡器ＳＨＡ—Ｃ型：巩义市英峪予华 仪器厂； 旋转蒸发器ＲＥ ５２－９８型：上海亚荣升华仪器厂；
作者简介：管伟举（１９７８一），男，在读硕士；主要从事油脂
分布不同，因此水解后组成磷脂的脂肪酸也会有所 变化。
加工和天然产物的分离及改性研究工作。
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论文选集 １．４实验方法 １．４．１单因素实验
１３７
本试验主要研究水相中磷脂酶Ａ，对大豆浓缩 磷脂的水解。
Ｏ
选取温度Ｔ、时间ｔ、加酶量
溶液试验点为：１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％；其它
固定条件：Ｔ：５２ｃｃ、ｔ：６ｈ、加酶量３．６％、ｐＨ值５．０，反 应的总体积为２０ＩＩｌｌ的缓冲溶液。由图可看出随着
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论文选集 ２．４大豆磷脂水解前后脂肪酸组成的测定
酸值
（Ａｖ）
６２．３
１３９
７０
ＰＬ／溶液达到３０％后酸值几乎不在增加；到ＰＵ溶
液为３０％以后，酸值随着ＰＬ／溶剂的增加而降低， 最后趋于平衡。磷脂酶的水解反应是一界面反应。 当磷酯浓度低时，磷脂能较好的分散于水中，当底 物浓度大时磷脂形成胶束。很难分散。磷脂较难与 酶接触，导致反应程度降低。
７０
ｊ四６５
器６０
５５ Ｏ ５ 时ｌＨＪ（ｈ） １０ １５
测６０ 澎５０
４０ ０．００％２．００％４．００％６．００％８．００％
加酶量（酶／磷脂） 图２－３加酶量对酸值的影响 ２．２．４
二，是零点，为区域的中心点，零点实验重复５次，用 以估计试验误差，以酸值为响应值。经回归拟合后， 各实验因子对响应值的影响可用下面的函数表示：
ｐＨ值对反应的影响
固定其它四个因素：
研究叨．郑州工业大学学报，１９９９，２０（１）：６６—６８．
［１９】赵裕蓉等．生物法制蔗糖酯～生物表面活性剂［Ｊ】．北京
化工大学学报，１９９６，２３（４）：６—１０． 【２０］谢得明，郑建仙，高大维．蔗糖酯的脂肪酶法合成【Ｊ】．食 品工业，１９９８，（３）：２３—２４． 【２ｌ】易封萍，李伟光，梁智群．蔗糖酯的合成研究咖．广西大 学学报（自然科学版），１９９６，２１（４）：３３８—３４０．
１３６
论文选集
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【１５】赵锡武．蔗糖脂肪酸酯的制备及用途【Ｊ】．广西化工， １９９６，２５（２）：３６－３８．
【１６１黄恩才，刘先桥，刘诗飞，等．蔗糖酯合成的动力学研究 ［Ｊ】．郑州工业大学学报，２０００，２１（４）：４－６． 【１７】冯光炷，谢文磊，卫延安．合成松香酸蔗糖酯的研究【Ｊ】． 精细化工，１９９８，１５（２）－４—６． ［１８】王芬，马烽，等．由天然油脂棕榈油合成蔗糖酯的
２．２．２时间对反应的影响
ＰＬｓ／溶液的增大，水解产物的酸值也显著增加；而当
５２℃、Ｌｄ：３．６％、ｐＨ值：５．０、ＰＬ／溶液：２５％，反应总体 积２０ｍＬ缓冲溶液，考察时间对酶水解的影响。从图 表可以看出时间对酸值的影响比较显著，２ｈ到６ｈ 随时间的延长酸值增加。因增加反应时间，酶不断 水解，产生的脂肪酸增多，所以酸值随之升高。但６ｈ 后反应趋于平衡，再延长时间酸值基本不变。
表２响应面试验数据表
羹兰 序号
ｌ
温度
（℃）
４７ ５７
时间 （ｈ）
４ ４ ６
加酶量ｐＨ值 ”１ ４
（％）
２．４
ＰＬｓ，溶液 （ｇ，ｍＬ）