肌纤维石蜡组织切片的制作
肌纤维石蜡组织切片的制作
肌肉组织学常用测量指标及方法一、肌纤维直径和面积测量（H.E染色）:（方法见附件一）各样品测100条肌纤维，在5个不同的切面视野上，随机取样。
方法1——在10×40倍显微镜下,用直线测微尺随机测量，由于肌纤维横断面常为不规则椭圆形或多边形，所以无法精确测量其直径。
参考椭圆形长短轴的测量方法求其直径。
先通过中点量出肌纤维横断面上最长两点间的距离为长径，反之为短径，然后长短径的几何平均数为每条肌纤维的直径，计算出面积。
方法2——以日本产MICRO-SCALE测定每个样品的肌纤维长径和短径，每个样品测定200根肌纤维的值，肌纤维的选取尽量以肌束为单位，完整测量各肌束内所有肌纤维，以减小取样误差。
肌纤维的面积以“长径×短径×0.7”的经验公式求得。
取所测定的100根肌纤维的平均值作为每个样品的值用于以后的研究。
二、肌束内肌纤维根数的测量（H.E染色）:（方法见附件一）在10×40倍显微镜下,随机选择视野,记录每个样本20束肌束内肌纤维根数,求其平均值和标准误。
三、肌纤维间距、肌束间距，肌大束间距的测量（H.E染色）：（方法见附件一）在10×40倍显微镜下，直线形目微尺测量，各样品测100个间距，在5个不同的切面式视野上随机取样。
四、肌纤维密度（H.E染色）：（方法见附件一）在目镜中加入网格目测微尺，在10×40倍显微镜下，用网格形目测微尺测量5个视野内的肌纤维根数,换算成每平方毫米面积内肌纤维的根数。
在选择视野时避开较大的肌束膜。
五、肌纤维、结缔组织、脂肪组织的面积比和体积比（H.E染色）：（方法见附件一）方法1——取染色的切片, 用显微投影仪放大技术放大于白纸上, 对3种组织绘出或打印, 剪下分别称重并换算出其3 种组织面积比。
方法2——采用测量单位参照面上肌纤维与结缔组织的面积分数来反映其体积分数。
在15×40倍显微镜下,每个样本取5个不同视野进行显微摄影,再将照片洗出（彩色5寸或更大）。
石蜡切片制作标准程序
动物病理组织学石蜡切片制作标准操作程序（SOP）一、\器材和试剂准备（一）载玻片和盖玻片的清洁1.载玻片和盖玻片清洗方法(1)锅内倒入适量清洗液（100 mL水+30 m L洗洁精+30 mL 84消毒液）；(2)将玻片逐片放入锅中, 加热至沸腾10 min, 停止加热, 自然冷却;(3)捞出玻片流水冲洗10min,彻底冲净泡沫（弹簧夹上后，单片过水）;(4)将玻片从水中取出, 用蒸馏水冲洗三遍（最好单片过水）;(5)将玻片放入 95%乙醇（分析纯）中浸泡；（6）取出玻片，码在切片盒，自然干燥（或无风适度高温干燥）备用；注意：由于盖玻片很薄，不能同载玻片放在一起处理；盖玻片从95%乙醇溶液中取出后要放在吸水纸上摊开，干燥后，放在小盒子中备用。
2.粘片剂（蛋白甘油）的制作及载玻片的预处理（1）蛋白甘油的制作取新鲜鸡蛋，先将其尖端用眼科剪或拨针挑破一小孔，再将蛋的另一端挑破一小孔并稍加扩大，大孔端朝下，使蛋白流入100~200毫升的烧杯中（不要蛋黄），以玻棒打拌蛋白完全变为雪花状泡沫，然后倒入垫有几层纱布的漏斗中过滤而得到透明、清凉的的蛋白液，再加入等量甘油，振摇使之充分混合，加入1%麝香草酚或樟脑防腐。
一般将其盛入滴瓶或树胶瓶中备用，不用时盖好防尘。
或1个鸡蛋的蛋清+500mL双蒸馏水，混匀，加10mL浓氨水。
（2）将蛋白甘油倒在小烧杯中，载玻片用弹簧夹夹上后侵入蛋白甘油中，贴壁刮干，放在切片盒内晾干备用。
二、石蜡组织切片的制作（一）取材注意事项：1.材料质量：材料必须新鲜，应争取在死后半小时内处理完毕。
2.取材体积：组织块力求小而薄（厚度不要超过5mm，以2mm最佳）3.取材力度：取材器具锋利。
勿使组织块受挤压，切割时不可来回挫动。
夹取组织时，切勿猛压，以免挤压损伤组织。
取材时，组织块可稍大一点，以便在固定后，将组织块的不平整部分修去。
4.固定形状：固定尽量保持组织的原有形态新鲜组织经固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。
石蜡切片制作实验报告(二)
石蜡切片制作实验报告(二)石蜡切片制作实验报告实验目的掌握石蜡切片的制作方法，了解其在生物学研究中的应用。
实验原理通过将样品置于石蜡中，使其固定后切割成薄片，然后染色观察样品中的细胞和组织结构。
实验材料•组织样品•石蜡•石蜡切片机•切片染色盒•水、乙醇、甲醇等试剂实验步骤1.取适量的组织样品，放入石蜡中固定。
2.用石蜡切片机将固化后的石蜡和组织样品切割成薄片。
3.用甲醇或乙醇脱除石蜡。
4.进行染色处理，如使用伊红染色。
5.将染好色的切片放入切片染色盒中，加入水并覆盖。
实验结果通过显微镜观察切片中的细胞和组织结构，可窥见其微观世界。
依据样品的不同，可看到各种细胞器、细胞分裂、组织的形态、结构和功能等信息。
实验注意事项1.操作时应戴手套和护目镜以保护手部和眼睛。
2.切片机的切割速度应适中，避免快过头造成样品损伤。
3.染色剂应均匀覆盖于切片表面，以免造成不必要的误差。
实验结论石蜡切片技术是生物学科研中必不可少的一种技术手段，能够突显样品中的微观结构，帮助科研工作者更好地了解和研究生物体的各种组织和器官。
实验应用石蜡切片技术在生命科学与医学领域得到了广泛的应用，如： - 组织学研究：观测组织中各种细胞器、细胞分裂、细胞凋亡等现象。
- 免疫学研究：确定免疫组织化学定位，如免疫组织化学染色等。
- 病理学研究：观测肿瘤等病理组织的构造特征。
- 分子生物学研究：观测基因的表达、蛋白质的结构等。
- 药理学研究：观察药物对细胞和组织的影响。
实验可能出现的问题及解决方法1.样品切面出现粗糙、污染现象：可能是切割速度太快，应适当降低切割速度。
2.切片中出现气泡或破损：可能是样品固定不够完整或者太多切片被叠加在一起，应减少切割深度或重新采集样品。
3.切片上未能完全染色：可能是涂抹染色剂时没有均匀涂抹，应均匀涂抹液体染色剂或更换染色试剂。
4.显微镜观察时出现模糊影响：可能是显微镜镜头或平台不够清洁，应及时清理。
结语石蜡切片技术是生物学研究中不可或缺的重要手段，在多个领域都得到了广泛应用。
组织病理切片的制作流程
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------组织病理切片的制作流程组织病理切片的制作流程 1．取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体（外科手术切除标本、活检标本、尸检标本）或动物，并确定取材的部位和方法。
取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的目的，具体要求如下：(1) 材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。
(2) 组织块的大小：所取组织块较理想的体积为 2. 0cm 2. 0cm 0. 3cm，以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和目的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取 0. 1～0. 2cm 即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取 0. 3 ～0. 5cm，这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。
(3) 勿挤压组织块: 切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锉动。
1/ 17夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。
(4) 规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。
(5) 选好组织块的切面: 根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。
纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。
(6) 保持材料的清洁: 组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。
(7) 保持组织的原有形态: 新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。
常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备
常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备常规石蜡包埋组织切片（常规切片）的制备㈠组织块依序进行：①水洗，②脱水，③透明，④浸蜡，⑤包埋和⑥切片。
㈡组织切片制备及其HE染色过程中使用的乙醇、丙酮、二甲苯、石蜡等为易燃、有毒物，必须专人管理，2m以内不得有明火，局部环境应有良好的通风和消防设施。
㈢常规切片的手工操作（步骤次序和各步骤的持续时间）1．水洗：用流水冲洗已经固定的组织块30min。
2．脱水（常温下）（1）乙醇－甲醛（AF）液固定60~120min（2）80%乙醇60~120min（3）95%乙醇Ⅰ 60~120min（4）95%乙醇Ⅱ 60~120min（5）无水乙醇Ⅰ 60~120min（6）无水乙醇Ⅱ 60~120min（7）无水乙醇Ⅲ 60min［注意事项］①未经充分固定的组织不得进入脱水程序。
②用于脱水的试剂容积应为组织块总体积的5～10 倍以上。
③自低浓度乙醇向高浓度乙醇逐级移进脱水。
④脱水试剂应及时过滤、更换（500ml 乙醇可用于500个组织块脱水；加入硫酸铜的无水乙醇变蓝时，提示需要更换）。
⑤较大组织块的脱水时间长于较小者，应将两者分开进行脱水。
⑥组织置于无水乙醇内的时间不宜过长（以免硬化）。
⑦丙酮脱水性能强，会使组织块过缩、硬脆，不宜用以替代无水乙醇。
3．透明（1）二甲苯Ⅰ 20min（2）二甲苯Ⅱ 20min（3）二甲苯Ⅲ 20min［注意事项］①二甲苯的容积应为组织块总体积的5～10倍以上。
②组织块在二甲苯中透明的时间不宜过长（以防组织硬、脆），并依不同种类组织及其大小而异；组织呈现棕黄或暗红色透明即可。
③二甲苯应及时过滤、更换。
④组织经二甲苯适度处理后不显透明时，常提示该组织的固定或脱水不充分，应查找原因并妥善处理。
4．浸蜡（1）石蜡Ⅰ（45~50℃）60min（2）石蜡Ⅱ（56~58℃）60min（3）石蜡Ⅲ（56~58℃）60min［注意事项］①熔化石蜡必须有专人负责，必须在熔蜡箱内或水浴中（70 ℃）进行，不得用明火加温。
石蜡切片的具体步骤与做法
石蜡切片的具体步骤与做法？石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。
石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，因此用得最多，它有很多优点：比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片（4um以下），能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存。
缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好，容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆。
制片时间太长。
石蜡切片的制作过程（一）材料与用具1．材料：鱼皮肤、性腺、肠、肝胰脏等。
2．用具：溶蜡箱、蜡杯、不同熔点的石蜡、酒精灯等。
（二）实验内容与步骤1．取材及固定取动物体上的小块组织成为组织块。
组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。
切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。
组织块取下后，先用先用0.85％的生理盐水漂洗以戏曲血液与污渍，如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。
由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时。
如果是管状器官或是其中有分泌之消化液，则死后应迅速采取，以免组织自溶或上皮剥落。
材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定，以保持其原有的结构。
不同的组织应选用适当的固定液。
固定液的用量与组织块体积之比一般在20：1。
不应使组织块贴于容器壁上，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。
2．冲洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。
组织块应用纱布包好，注名，放金属水洗网中用流水冲洗，甲醛固定液固定的组织一般水洗24小时，Bouins固定液固定的组织水洗24小时。
AFA固定液则不需要水洗。
3．脱水和硬化经过固定后的组织在水洗后要进行脱水，脱水的目的将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，使组织逐渐变硬，便于油类或其他透明及浸入，为熔化的石蜡浸渗到组织中创造条件。
石蜡切片制作超详细步骤
石蜡切片制作超详细步骤1．取材颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或其他组织）。
切取的组织块不宜太大，以利于固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。
取下所需要的肝组织，切成一小块2－3mm厚。
注意事项：（1）取材动作要迅速，不宜拖太久，以免组织细胞的成分、结构等发生变化。
（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。
2．固定将切好的肝组织用生理盐水洗一下，立即投入中性福尔马林固定液中固定30－50min。
注意事项：（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。
（2）有些混合固定液的成分之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。
（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1-2次新液。
（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外贴上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免混淆。
标签上注明固定液、材料来源、日期等。
标签上的文字，用黑色铅笔写。
3.洗涤材料经固定后,流水冲洗，数小时或过夜。
4.脱水材料依次经70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。
注意事项：（1）脱水必须在有盖的玻璃瓶中进行，防止吸收空气中的水分。
（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。
（3）在低浓度酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。
（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。
（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。
（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象5．透明纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min （至透明为止）。
石蜡切片的制作及免疫组织化学标准化操作流程
石蜡切片的制作标准化操作流程1.取材固定1)取材必须新鲜，组织离体后迅速割取组织块，并随即投入固定剂福尔马林中。
切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。
2)固定完毕，用水冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。
2.脱水脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水，各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。
需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。
3.二甲苯透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。
透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。
将组织块先放入纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，。
透明时间一般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。
4.透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在60℃左右。
透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。
纯石蜡应处理2-3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15-30min。
透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。
具体做法是；先准备好纸盒，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。
5.切片方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。
组织病理切片的制作过程
组织病理切片的制作过程1.取材组织取材的方法是制作切片的一个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取自人体(外科手术切除标本、活检标本、尸检标本)或动物，并确定取材的部位和方法。
取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有一定的部位和方法，不能任意切取组织作为制片材料，不然，无法达到教学、科研和临床诊断的U的，具体要求如下：(1)材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，人体组织一般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。
(2)组织块的大小：所取组织块较理想的体积为2. 0cmX2. OcmXO. 3cm,以使固定液能迅速而均匀地渗入组织内部，但根据制片材料和LI的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切片，其组织块可以薄取0.1〜0.2cm即可，这样可以缩短固定脱水透明的时间，若制作教学切片厚取0.3〜0. 5cm,这样可以同一蜡块制作出较多的教学切片。
(3)勿挤压组织块：切取组织块用的刀剪要锋利，切割时不可来回锂动。
夹取组织时切勿过紧，以免因挤压而使组织、细胞变形。
(4)规范取材部位：要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。
(5)选好组织块的切面:根据各器官的组织结构，决定其切面的走向。
纵切或横切往往是显示组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。
(6)保持材料的清洁:组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用水冲洗干净后再放入固定液中。
(7)保持组织的原有形态:新鲜组织固定后，或多或少会产生收缩现象，有时甚至完全变形。
为此可将组织展平，以尽可能维持原形。
2.固定(1)小块组织固定法：这是最常用的方法，从人体或动物体取下的小块组织，须立即置入液态固定剂中进行固定，通常，标本与固定液的比例为1:4〜20,但组织块不宜过大过厚，否则固定液不能迅速渗透。
故取组织块的大小一般为2. 0cmX2. OcmXO. 3cm o(2)注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部，或需要对整个脏器或整个动物体进行固定。
组织病理切片制作流程（完整版）
组织病理切⽚制作流程（完整版）组织病理切⽚的制作流程1．取材组织取材的⽅法是制作切⽚的⼀个重要程序，根据教学、科研及外检的具体要求取⾃⼈体(外科⼿术切除标本、活检标本、⼫检标本)或动物，并确定取材的部位和⽅法。
取材者需要掌握解剖学、组织学、病理学的基本理论知识，还要掌握实际操作技术，每个组织器官的取材都有⼀定的部位和⽅法，不能任意切取组织作为制⽚材料，不然，⽆法达到教学、科研和临床诊断的⽬的，具体要求如下：(1) 材料新鲜：取材组织愈新鲜愈好，⼈体组织⼀般在离体后，动物组织在处死后迅速固定，以保证原有的形态学结构。
⑵组织块的⼤⼩：所取组织块较理想的体积为2.0cm X 2.0cm X 0.3cm,以使固定液能迅速⽽均匀地渗⼊组织内部，但根据制⽚材料和⽬的不同，组织块的较理想体积也不同，如制作病理外检、科研切⽚，其组织块可以薄取0.1?0.2cm即可，这样可以缩短固定脱⽔透明的时间，若制作教学切⽚厚取0.3?0.5cm,这样可以同⼀蜡块制作出较多的教学切⽚。
(3) 勿挤压组织块: 切取组织块⽤的⼑剪要锋利，切割时不可来回锉动。
夹取组织时切勿过紧，以免因挤压⽽使组织、细胞变形。
(4) 规范取材部位: 要准确地按解剖部位取材，病理标本取材按照各病变部位、性质的不同，根据要求规范化取材。
(5) 选好组织块的切⾯: 根据各器官的组织结构，决定其切⾯的⾛向。
纵切或横切往往是显⽰组织形态结构的关键，如长管状器官以横切为好。
(6) 保持材料的清洁: 组织块上如有⾎液、污物、粘液、⾷物、粪便等，可⽤⽔冲洗⼲净后再放⼊固定液中。
(7) 保持组织的原有形态: 新鲜组织固定后，或多或少会产⽣收缩现象，有时甚⾄完全变形。
为此可将组织展平，以尽可能维持原形。
2．固定(1) ⼩块组织固定法：这是最常⽤的⽅法，从⼈体或动物体取下的⼩块组织，须⽴即置⼊液态固定剂中进⾏固定，通常，标本与固定液的⽐例为1:4?20，但组织块不宜过⼤过厚，否则固定液不能迅速渗透。
石蜡切片制作
石蜡切片操作一、试剂配制1固定剂：36% ~40%福尔马林液5ml ;冰醋酸5m1; 50%酒精89ml;2、1%番红染液：番红2g，乙醇100ml，水100ml3、0.5%固绿溶液：固绿0.5g，乙醇95ml，水5ml4、各级浓度酒精的配制70% ；85%；95% ；100%酒精。
70%和85%酒精用95%酒精配制；（取70ml95%酒精，加水至95ml，即为70%酒精）6、粘片剂：鸡蛋清一个，打碎，除去泡沫，加入等量的甘油二、实验步骤1固定：组织块大小：1.5X 1.5X 0.2 CM 固定液＞ 4倍组织体积福尔马林固定液12 —24 h后用蒸馏水洗2、脱水：70% 乙醇1h ----------- ►85% 乙醇1h -------- ►95% 乙醇1h ---------- 100% 乙醇0.5 —1h --------- ► 100% 乙醇0.5-1h3、透明：100%乙醇：二甲苯（1 : 1）2h （加少量番红）--------- ►二甲苯1.5h ------------ ►二甲苯1.5h （溶液占瓶子1/3，不倒掉，直接加小蜡块透明）注意：时间太长变脆4、浸蜡：材料和蜡块不相接触，置换组织中的透明剂，为包埋做准备。
方法一：石蜡熔点52—56 C温箱：56C 二甲苯：石蜡（1 : 1）1-2小时；石蜡1-2小时；石蜡1-2小时方法二：1）常温加蜡至饱和（大概加6-7快）；2）35C加蜡块3-6h，不溶为止，可过夜3）60C盖瓶盖2h（3-4块）,开盖6h （溶液是原来的2倍，占瓶子2/3）,至二甲苯完全挥发，可过夜4）纯蜡（60C -65C）2h5）纯蜡（60C -65C）2h5、包埋准备包埋蜡：硬蜡（56~58C或60~62C）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性。
②折纸盒，写好标签。
③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子④在纸盒中倒入56C -58C的石蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。
肌纤维石蜡组织切片的制作
肌肉组织学常用测量指标及方法一、肌纤维直径和面积测量（H.E染色）:（方法见附件一）各样品测100条肌纤维，在5个不同的切面视野上，随机取样。
方法1——在10×40倍显微镜下,用直线测微尺随机测量，由于肌纤维横断面常为不规则椭圆形或多边形，所以无法精确测量其直径。
参考椭圆形长短轴的测量方法求其直径。
先通过中点量出肌纤维横断面上最长两点间的距离为长径，反之为短径，然后长短径的几何平均数为每条肌纤维的直径，计算出面积。
方法2——以日本产MICRO-SCALE测定每个样品的肌纤维长径和短径，每个样品测定200根肌纤维的值，肌纤维的选取尽量以肌束为单位，完整测量各肌束内所有肌纤维，以减小取样误差。
肌纤维的面积以“长径×短径×0.7”的经验公式求得。
取所测定的100根肌纤维的平均值作为每个样品的值用于以后的研究。
二、肌束内肌纤维根数的测量（H.E染色）:（方法见附件一）在10×40倍显微镜下,随机选择视野,记录每个样本20束肌束内肌纤维根数,求其平均值和标准误。
三、肌纤维间距、肌束间距，肌大束间距的测量（H.E染色）：（方法见附件一）在10×40倍显微镜下，直线形目微尺测量，各样品测100个间距，在5个不同的切面式视野上随机取样。
四、肌纤维密度（H.E染色）：（方法见附件一）在目镜中加入网格目测微尺，在10×40倍显微镜下，用网格形目测微尺测量5个视野内的肌纤维根数,换算成每平方毫米面积内肌纤维的根数。
在选择视野时避开较大的肌束膜。
五、肌纤维、结缔组织、脂肪组织的面积比和体积比（H.E染色）：（方法见附件一）方法1——取染色的切片, 用显微投影仪放大技术放大于白纸上, 对3种组织绘出或打印, 剪下分别称重并换算出其3 种组织面积比。
方法2——采用测量单位参照面上肌纤维与结缔组织的面积分数来反映其体积分数。
在15×40倍显微镜下,每个样本取5个不同视野进行显微摄影,再将照片洗出（彩色5寸或更大）。
石蜡切片的制作及染色
石蜡切片的制作步骤（1）修块：剖检时摘取的睾丸和附睾组织样品在2.5%戊二醛-多聚甲醛混合固定液中固定24~48h后，用清水或低浓度的酒精将组织上的固定液清洗掉，用刀片将其修成3~5mm 厚，置于包埋框中。
（2）脱水、透明：将含有组织块的包埋框经梯度浓度逐升的酒精溶液（50%酒精→70%酒精→80%酒精→90%酒精→95%酒精）中进行脱水1h，然后顺次转入无水乙醇I、无水乙醇II和酒精二甲苯混合液中放置30min，再次分别置入二甲苯I和二甲苯II中进行透明5-10min左右。
（3）浸蜡、包埋：组织块充分透明后，将包埋框依次经过3中不同熔点的石蜡液（56~58℃石蜡I→56~58℃石蜡II→58~60℃石蜡III）中浸蜡1h，然后将组织块从包埋框中取出，放入自制的长方形纸盒中，灌入58~60℃石蜡，待其自然冷却后，修成适当大小的蜡块后准备切片。
（4）切片、展片：将涂有粘片剂的载玻片摆放在展片台上，磨面朝上，滴上适量清水；将蜡块置于切片机上切成4um厚的连续切片，将其放在清水上，高温将蜡膜展平，常温保存，以备染色。
HE染色步骤（1）石蜡切片依次入二甲苯I和二甲苯II中脱蜡10min；再经酒精二甲苯混合液及梯度浓度递减的酒精溶液（无水乙醇→95%酒精→90%酒精→80%酒精→70%酒精→50%酒精）至蒸馏水中；（2）Ehrlich苏木精染色10～15 min，蒸馏水洗；（3）0.5%盐酸酒精分色（5～10 s），以镜检为准；（4）自来水冲洗蓝化后，依次转入70%和80%酒精中；（5）伊红染色10~15s；（6）依次经95%酒精、无水乙醇I、无水乙醇II、酒精二甲苯混合液、二甲苯I、二甲苯II进行脱水；（7）中性树胶封片。
染色结果：胞核呈蓝紫色，胞质呈粉红色。
石蜡切片制作流程表及相关注意事项
石蜡切片制作流程表及相关注意事项一、取财1．样品要求：长宽1cm左右，厚度不超过5mm。
2．固定液：10％福尔马林固定液︰组织块=20︰1为宜。
3．固定时间：依大小而定，一般3-5h即可，如果24h或更长，应密封瓶口，封前换液。
4．修理组织块：将切面修平。
5．每个组织块都应编号，并做好记录。
6．用纱布包好组织块，并包上小纸条，注明编号、组织块数量等信息。
注：（1）对于肺部组织，在取材后必须用玻璃注射器抽掉肺泡腔中的气体，否则会影响脱水，透明和浸蜡等效果。
抽气具体方法：A．将组织块置入空玻璃注射器内，塞上推助器。
B．.向注射器内吸入约1/2的自来水，就会发现肺组织漂浮在水面。
C．排掉注射器内的空气。
D．将注射器倒置(头部向上)，用左手拇指赌上注射器头部,用右手用力拉推肋器。
E．反复C、D两步骤，直到肺组织沉到注射器底部即可。
（2）对于气管、支气管等含钙量较高的组织，必须有脱水前用5％和硝酸溶液软化，直到可用大头针扎透为止（一般需一天一夜）。
二、脱水过程1．水洗：将固定组织块放入广口瓶，瓶口用纱布包好，置流水下洗水，水洗时间依固定时间而定，一般12h以上，固定时间越长水洗时间越长。
2．脱水（1）75％2h（2）80％酒精1h（3）95％酒精Ⅰ 1 h（4）95％酒精Ⅱ 1 h（5）95％酒精Ⅲ过一夜（6）100％酒精Ⅰ 1 h（7）100％酒精Ⅱ 1 h组织块在进入下一阶段梯度酒精前要用吸水纸吸干水，尤其从95％洒精（Ⅲ）进入100％酒精（Ⅰ）时，切记防止带入水分，所有过程要在瓶口加盖，防止水分子进入。
（其他注意项见下文）三、透明（1）酒精（100％）︰二甲苯=1︰1 过度20min（2）二甲苯Ⅰ透明15min（3）二甲苯Ⅱ透明15min四、浸蜡（1）二甲苯︰石蜡=1︰:1软蜡（熔点52℃～54℃） 1h 温箱56～58℃(2) 石蜡Ⅰ（熔点54℃～56℃） 1h 温箱56～58℃（3）石蜡Ⅱ软硬混合（熔点更高） 1h 温箱56～58℃浸蜡温度保持在56～58℃，温度太高会烧坏组织块，太低石蜡会凝固。
组织切片的制作步骤
组织切片制作过程：1.固定：10%甲醛溶液内固定24～28h组织块大小为15×15×5mm2.水洗：流水冲洗24h需用到胶皮管、烧杯、纱布组织块放于烧杯中，用纱布将烧杯口封死，在纱布中间部位留出供胶皮管插入的豁口，胶皮管一头接到水源，另一头插入烧杯中。
有水注入后，尽量让组织块不要沉底。
3.脱水：不同浓度的酒精50%——70%——80%——95%——95%——无水酒精——无水酒精30m-1h 2-4h 2-4h 2h 2h 1h 1h其中70%酒精可以长时间保存，并且在脱水过程中随时可返回70%酒精中。
但是返回后，仍需按顺序进行，即80%开始。
4.透明：无水酒精：二甲苯（1：1）——二甲苯30m 30m透明过程中，在二甲苯中时，需注意观察组织块是否已透明，无需按固定时间来计算。
5.浸蜡与包埋：将石蜡融化后置于52℃～60℃烘箱中二甲苯：石蜡（1：1）——石蜡（1）——石蜡（2）——石蜡（3）30min 30min 30min 30min6.切片：按需要厚度一般将切片机设为5-7um厚，厚度视组织块而定。
7.展片：用水浴锅，将温度设为40℃，用毛笔将切好的蜡片从切片机上卷下，放入水浴锅中。
8.粘片：需准备蛋白甘油，蛋白甘油由鸡蛋蛋清和甘油调配而成，比例为1：1。
先将一滴蛋白甘油涂抹在干净的载玻片上，然后用载玻片从水中将展好的蜡片捞起，平放入烘箱内进行烘干，烘干温度为50℃，时间为12～24h。
9.染色：二甲苯（1）——二甲苯（2）——无水酒精（1）——无水酒精（2）——5-10min 5-10min 5min 3-5min95%酒精（1）——95%酒精（2）——80%酒精——70%酒精——50%酒精——2-3min 2-3min 2min 2min 2min蒸馏水——苏木精——自来水洗——蒸馏水——1%盐酸酒精——自来水蓝化2min 5-15min 2min 2min3-5s 15-30min——蒸馏水——50%酒精——70%酒精——80%酒精——伊红——95%酒精(1)2min 2min 2min 2min 1-2min 2-5min——95%酒精（2）——无水酒精（1）——无水酒精（2）——二甲苯（1）2-5min 5min 5min 5min——二甲苯（2）5-10min10.封片：树胶封片，置于35℃～38℃之间烘干。
[原创]石蜡包埋切片制作法
![[原创]石蜡包埋切片制作法](https://img.taocdn.com/s3/m/37fb33260812a21614791711cc7931b765ce7be6.png)
一、制备显微标本的切片法一石蜡包埋切片制作法这是最常用的切片法。
以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的固态结构。
用切片机制取极薄的切片。
为了让石蜡能浸入组织内部，需将组织经过脱水等处理。
过程大致如下：⑴固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。
因此，需用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。
凡供永久保存的标本都需经固定处理。
常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。
还有由几种试剂配成的固定液，例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。
⑵脱水：是将组织细胞所含水分除去。
通常用乙醇（Alcohol，酒精），浓度递升到100%。
此过程还使组织块进一步硬化。
⑶透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代，以便石蜡浸入。
通常用二甲苯（xylene）为透明剂。
⑷浸蜡：在温箱内进行。
已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织，作为支持介质。
⑸包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包埋。
⑹切片：用切片机。
常用的切片机有轮转式、平推式的。
用轮转式的易于切出连续切片。
切片厚度随制片目的而调整。
教学标本厚度多是5~6μm。
⑺贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。
染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。
二冷冻切片法冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。
冷冻切片法需有冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。
恒冷切片机是高级冷冻切片设备。
它有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。
恒冷箱的作用类似冰箱，可在一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温度的干扰。
切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。
冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
肌肉组织学常用测量指标及方法
一、肌纤维直径和面积测量（H.E染色）：（方法见附件一）
各样品测100条肌纤维，在5个不同的切面视野上，随机取样。
方法1――在10X 40倍显微镜下，用直线测微尺随机测量，由于肌纤维横断面常为不规则椭圆形或多边形，所以无法精确测量其直径。
参考椭圆形长短轴的测量方法求其直径。
先通过中点量出肌纤维横断面上最长两点间的距离为长径—反之为短径，然后长短径的几何平均数为每条肌纤维的直径，计算出面积。
方法2――以日本产MICRO-SCALE定每个样品的肌纤维长径和短径，每个样品测
定200根肌纤维的值，肌纤维的选取尽量以肌束为单位，完整测量各肌束内所有肌纤维，以减小取样误差。
肌纤维的面积以“长径X短径X 0.7 ”的经验公式求得。
取所测定的100根肌纤维的平均值作为每个样品的值用于以后的研究。
二、肌束内肌纤维根数的测量（H.E染色）：（方法见附件一）
在10X40倍显微镜下，随机选择视野，记录每个样本20束肌束内肌纤维根数, 求其平均值和标准误。
三、肌纤维间距、肌束间距，肌大束间距的测量（H.E染色）：（方法见附件一）
在10X40倍显微镜下，直线形目微尺测量，各样品测100个间距，在5个不同的切面式视野上随机取样。
四、肌纤维密度（H.E染色）：（方法见附件一）
在目镜中加入网格目测微尺，在10X 40倍显微镜下，用网格形目测微尺测量5个视野内的肌纤维根数，换算成每平方毫米面积内肌纤维的根数。
在选择视野时避开较大的肌束膜。
五、肌纤维、结缔组织、脂肪组织的面积比和体积比（H.E染色）：（方法见附件一）方法1――取染色的切片，用显微投影仪放大技术放大于白纸上，对3种组织绘出或打印，剪下分别称重并换算出其3种组织面积比。
方法2――采用测量单位参照面上肌纤维与结缔组织的面积分数来反映其体积分数。
在15X40倍显微镜下，每个样本取5个不同视野进行显微摄影，再将照片洗出（彩色5寸或更大）。
将所得照片按肌纤维与结缔组织分别剪下，用1/ 10000电子分析天平称重，分别得出肌纤维与结缔组织的重量。
由于相纸密度相同，所以此重量比能反映其面积和体积比。
六、肌节长度：
方法1——于新鲜肉样中心部位取3cm1左右的一小块与20ml的0.08mol/L KCl 溶液混合,于高速组织捣碎机中均质30s,制压片一张,用相差显微镜10X 100 倍显微测量肌节长度，每个样本随机测定20根肌原纤维的肌节，其平均值代表该肌肉样本的肌节长度。
方法2——电子显微镜超微结构观察：新鲜取样约1 cm X 1.5cm,置于2.5%戊二醛溶液中预固定，用眼科剪刀剪切成 1 cm3大小，放在戊二醛溶液中继续固定，经PBS冲洗后用1%的锇酸固定2.5小时，梯度丙酮脱水（50%, 70%, 85%, 90%, 100%）, Epon-812树脂包埋。
超簿切片机切成50nm超薄切片，经醋酸铀和柠檬
酸铅染色，透射电镜（1-4万倍）观察、拍照、冲洗印相，用游标卡尺测量肌节长度、肌原纤维直径，I带及A带长度，并观察肌纤维超微结构的特征，肌纤维间线粒体、肌糖元、脂肪滴的含量。
（我校为70-80元/张，只需要采样后交给电镜室即
可。
）
附件一：
一、肌纤维石蜡组织切片的制作（H.E）
（注：组织片主要由切片、整装片和涂片三种方法制成；切片包括：石蜡切片法、火棉胶切片法和冰冻切片法等。
）
1■取材和固定：在猪屠宰后1小时内切取最后胸椎处眼肌中部1 x 1 x2CM肌肉组织块（动作要轻，不要挤压，以免内部结构变形），准确标号后置于10%甲醛水溶液中固定保存。
如血污太多，则用生理盐水（0.9%Nacl溶液）漂洗干净之后再固定。
2■洗涤：在脱水前用自来水冲洗样品，时间不超过24小时。
3■脱水：将洗好后的样品放入为70%、80%、90%、100%（无水酒精）、100% （无水酒精）的酒精中分别经过夜、8小时、8小时、1小时、1小时浸泡以脱去样品中的水分。
4■透明：以1：1的二甲苯：无水酒精浸泡1小时，再二甲苯浸泡1小时，以置换出组织块中的无水酒精。
5■浸蜡和包埋：将透明好的样品放入1：1的二甲苯：石蜡中过渡30分钟，再将
其放入装有石蜡的蜡杯中30分钟（需在温箱中将石蜡熔化后进行，温箱温度不得高于56C）将浸好蜡的组织块放入盛有熔化石蜡的纸盒内，使组织块包埋于石蜡中，迅速放在水盆中待其冷却后备用。
6■切片：将制好的组织蜡块经修切后粘附于台木后用切片机切成6」m的薄片，
薄片应该连续成蜡带壮。
7■展片和粘片：将切成的蜡带展于30C的温水中，再以1：1的鸡蛋清：甘油的混合剂为粘附剂，将组织薄片粘附于载玻片上，再将其置于37 E温箱中烘干（不少于24h）。
&脱蜡、染色程序：
8.1脱蜡：将载玻片置于二甲苯中两次，分别保持5分钟和1分钟，以脱去切片
中的石蜡成分。
8.2洗脱二甲苯：将载玻片置于95%、95%、80%、70%的酒精中各1分钟。
8.3用水洗脱酒精两次后以苏木精染色15分钟，再水洗两次。
之后，置于1%盐酸酒精（70%）（即l毫升盐酸加进70%酒精至100毫升），中10秒至1分钟。
8.4多次更换清水洗20分钟后以l%伊红溶液染色2至5分钟，之后水洗两次。
8.5脱水：按下列浓度酒精梯度脱水80%（l分钟）、95%（l分钟）、100%（2分钟）、100%（2分钟）、二甲苯（5分钟）、二甲苯（2分钟）。
8.6封藏：在样品上滴加适量封片树胶后立即将清洁的盖玻片盖上，平置于烘箱之中，于35至38 C烘干后贴上标签保存。
（详细请参照《家畜解剖学及组织胚胎学》后附2）
二、H.E染液配方
苏木精染液配法较多，常规染色多指Harris氏苏木精，配法如下：
苏木精1g,纯酒精10ml，硫酸铝铵（铵明矶）20g,蒸馏水200ml,氧化汞0.6g。
先将苏木精溶于纯酒精，硫酸铝铵放入蒸馏水加温溶解（不必沸腾），即加入溶化的苏木精醇溶液，继续加温至沸腾状态，移出火面，并在沸腾状下迅速加进氧化汞，再移进火面继续加温煮沸1分钟，即时离开火面，将烧杯移入冰水中
急骤冷却，并不停摇动，使其完全冷却后，静置过夜，次日再过滤。
在96毫升
滤液中加进4毫升冰醋酸，即可使用。
在加氧化汞时，即产生大量气体，使染液从容器内喷出，有灼伤皮肤的危险，因此加氧化剂时，容器必须离开火面。
为避免气体溅出，所用容器应尽最大些。
染液冷却后表面有一层金属状薄膜，溶液中沉淀较多，故使用前应过滤。
染色正常时，细胞核先呈棕红色，经分色后呈浅红色，流水冲洗或碱化后呈蓝色。
如染色未经水洗或碱化即呈蓝色，表示染液过氧化或因使用过久，已失去染色力，应予更换新染液。
伊红（Eosin）是一种酸性染料，能溶于水或酒精，加少许冰醋酸可增强染色力，但过久标本易于褪色。
常用配法：一般可配成0.1—1% （1 %:伊红1.0g,蒸馏水100ml.）。
伊红水溶液或酒精（70%、80%、90%选其中任一浓度均可）溶液。
若遇
伊红着色困难时，可加入几滴冰醋酸以增强伊红的染色力。
H.E染色时，应注意苏木精与伊红二者对比染色色调的协调。