体细胞核移植的研究进展_核移植供体细胞与受体细胞的选择

综述 体细胞核移植的研究进展 核移植供体细胞与

受体细胞的选择

乔岩岩,史小林*

(首都医科大学生殖医学研究中心,北京 100054)

摘要 根据近年来国外的研究进展,对核移植研究中的有关内容,如供体核的获得、受体卵母细胞与去核、核卵重组进行了综述,望能对核移植研究有所帮助。

关键词 核移植; 供体细胞; 受体细胞

中图分类号 Q243 文献标识码 A 文章编号 1004 3845(2005)02 0113 04

Advances in somatic cell nuclear transfer:the selection of donor cell and recipient cell

QI A O Yan y an,S H I X iao lin*

Rep roductive M edical Center,Cap ital Univ er sity of M edical Science,Beij ing100054

Abstract This article is to review the latest developm ent of nuclear tr ansfer,m ainly focusing on the selectio n of do no r cell and recipient cell and the reco mbinatio n of nucleus and o ocy te.We ho pe that it w ill be helpful to the pr ofessional researchers in this field.

Key words Nuclear tr ansfer; Donor cell; Recipient cell

(J R epr od M ed2005,14(2):113 116)

细胞核移植是通过显微操作和细胞融合技术,将单细胞核供体(卵裂球或体细胞的核)移入去核的受体(卵母细胞或受精卵)胞质的工程,细胞核移植结果是构成重组胚,通过对重组胚的激活、培养和移植,最后达到扩繁同基因型哺乳动物胚胎及其种群的目的。现将当今核移植供体细胞,受体细胞的研究进展综述如下。

一、核移植供体细胞

(一)供体细胞类型:核移植所用细胞包括动物干细胞、胎儿体细胞和成年体细胞等,供核细胞的类型可直接影响核移植的成功率。目前,核移植研究多用后两种细胞,成功的核供体细胞有乳腺细胞、肌细胞、性腺细胞和肝细胞等,特别是卵丘细胞与胎儿成纤维细胞,成功地用作多种动物核供体。

1 乳腺上皮细胞:1997年英国首次报道,采用血清饥饿法即先将成年母羊乳腺上皮细胞在含10%的胎牛血清(FCS)的培养基中培养,然后转入FCS含量仅为0.5%的培养基中连续培养5d,将其作为核供体克隆绵羊 多莉 成功,指出了高度分化的乳腺上皮细胞在导入受体卵母细胞后,可以去分化,恢复全能性。

2 卵丘细胞:1998年美国以小鼠卵丘细胞为核供体,采用吸移管注入,利用机械和化学激活方式进行细胞融合,成功培育出三代克隆小鼠。小鼠、牛体细胞移植的相关研究发现休眠(G0)的卵巢颗粒细胞核与去核M II期卵母细胞构成的体细胞重构胚,其发育率及克隆后代的能力远高于其他类型的休眠体细胞,这可能颗粒细胞存在着与卵母细胞紧密联系的胞质微绒毛桥有助于供体核同受体核胞质因子的交换。还有研究表明,以卵丘细胞组成的重构胚有较高的卵裂率和囊胚发育率[1]。卵丘细胞适宜于核移植的可能原因:(1)卵丘细胞是自然静止在G0/ G1期的细胞;(2)卵丘细胞是包围在卵母细胞周围的细胞,核移植后两者胞质更易互融;(3)卵丘细胞内端粒酶活性较高,不会因染色体端粒变短而老化。

3 颗粒细胞:用牛成熟卵周围的卵丘细胞核移

收稿日期 2004 09 06; 修回日期 2004 10 18

作者简介 乔岩岩(1974~),女,山东济宁人,硕士生,讲师,生殖医学专业(*:通讯作者)

植未取得成功,但培养的卵泡壁颗粒细胞核移植却培育出后代。并认为壁颗粒细胞功能和命运与卵丘细胞不同,在其分化为黄体细胞之前分离的这种细胞,分化程度低于卵丘细胞。

4 胎儿成纤维细胞:胎儿成纤维细胞具有很多优点:(1)来源广泛,整个胎儿组织和器官均可作为来源;(2)可增殖多代,细胞增殖快,在体外群体倍增时间平均为17~24h,而且G1期长。Betthauser 等[2]培养的猪胎儿成纤维细胞体外传代8次,经过200d以上仍未见衰老迹象;牛胎儿的成纤维细胞在体外经过120d,传18代,细胞经历了96次群体倍增所得到的核移植胚胎的发育率与第3代细胞的核移植胚发育率相似[3];(3)可利用再克隆胎儿成纤维细胞来延长细胞的体外生存时间。研究证明,第1和第2代克隆胚胎之间发育率无显著差异[4];(4)胎儿细胞通过电融合或者脂质转染基因的可操作性强,目前胎儿成纤维细胞已作为转基因的首选细胞[5]。Lee等[6]使用猪胎儿成纤维细胞作为核供体得到的囊胚率明显高于其他细胞(成体成纤维细胞、卵丘细胞和输卵管上皮细胞)。

5 成体成纤维细胞:动物的皮肤是最适宜的供体细胞来源,如动物的耳部、尾尖等,它不但可提供供体个体的完整遗传物质,而且取材后对供体动物的健康没有任何影响。由于成纤维细胞对消化液较上皮细胞敏感,合适的消化时间可以使成纤维细胞脱壁,而上皮细胞仍贴在瓶壁上,因此经3~5代的传代就可得到纯化的成纤维细胞。

6 神经细胞:Eggan等[7]首次成功地将有丝分裂后的嗅觉神经元的核移入卵母细胞,克隆出了有生育力的小鼠。这表明有丝分裂后的终端神经元的整组遗传基因,仍能重新进入细胞周期并能被再程序化为一种全能状态。而且,克隆鼠的味觉受体基因表达模式和组成与野生型动物没有差别,提示嗅觉神经元不可逆转的DNA变化不伴随受体基因的选择。

(二)供体细胞的年龄:目前认为,动物体细胞的年龄并不是影响供体细胞转基因核移植的主要因素,但有研究认为成年动物的体细胞比幼年或胎儿的体细胞的克隆效率要低。然而H ill等[8]用同一基因型的成体成纤维细胞和胎儿成纤维细胞作供体,即分别来自21岁龄婆罗门公牛(Brahman)和由婆罗门公牛细胞克隆的40d龄的核移植胎儿,进行核移植的结果二者的囊胚形成率相同。Ar at等[9]用13岁牛的耳尖成纤维细胞和胎儿成纤维细胞作转基因对比研究,发现成年体细胞不仅在长达54d 的体外转基因选择结束后染色体正常,而且所获得的核移植胚胎的形态、细胞数和染色体核型二者均很相似。其原因还不清楚。有研究认为如供体细胞是源于染色体端粒已经变短的体细胞,在克隆动物的同时也克隆了动物的年龄,导致克隆动物出现早衰。但目前的研究认为,即使在细胞含有衰老基因EPC 1的表达,端粒变短并伴有形态衰老的情况下也能克隆出后代[10],并提出染色体端粒的长度在核移植胚胎的发育中可恢复到正常水平[11]。

(三)供体细胞的传代培养:近年来,许多来自体外培养细胞核供体的克隆动物,大多数使用的是原代培养或短期培养的细胞(4~6代),认为这类细胞有利于核移植胚的发育。但Kasinathan等[12]采用15岁牛的体细胞,传至10~15代,甚至18代细胞用于核移植,并未影响核移植胚的发育潜力; Kubo ta等[13]用培养5、10、15代的牛耳皮肤成纤维细胞,发现第10、15代细胞核移植囊胚率高于第5代细胞的囊胚率,并培育出了核移植牛。Dinny es 等[14]用体外培养0~15代的兔成纤维细胞进行核移植,结果传代培养的细胞比未传代的细胞更易获得成功。还有研究指出,供体细胞的传代培养的代数与囊胚形成率有关。Arat等[15]克隆转基因牛发现,培养15代的细胞核移植后,囊胚率高于培养10、11、13代的细胞。说明培养代数高的细胞比代数低的细胞克隆效率高,目前对此尚无合理的解释。

二、受体细胞

迄今已有三类受体细胞用于核移植培育了后代,第1类是去除原核的合子,但仅局限于用原核或假原核作为供体。第2类是早期胚胎,但也只适合于用具有全能性的卵裂球作为供体。第3类是M II 卵母细胞,也是哺乳动物核移植使用最多的一类受体,这类受体接受各阶段胚胎的卵裂球,早期胎儿细胞、体细胞或胚胎干细胞均获得了后代。

三、细胞周期时相对核移植胚发育的影响

移植核和受体卵细胞质所处的细胞周期及其相互关系对于重构胚的正常发育至关重要。处于有丝分裂各时期的细胞作为核供体,一旦移植到卵母细胞后,移植核在卵质环境里将出现重塑而再程序化。而重构胚的染色体倍性的正确与否,可能是决定重构胚发育率高低的重要因素。只有移植核和受体卵质相容,才能避免重建胚的DNA损伤并保持胚胎的正确倍性。如不相容,发育一旦启动,被移植的供