蛋白质层析新填料应用与选择
蛋白纯化层析柱填装
蛋白纯化层析柱填装
首先，选择合适的层析柱是非常重要的。
根据需要分离的蛋白
的大小、电荷、亲和性等特性，选择不同类型的填料，比如离子交
换柱、凝胶过滤柱或亲和层析柱等。
填料的粒径和柱子的尺寸也需
要根据样品的特性和分离要求来选择。
其次，准备填充柱子的缓冲液和样品。
缓冲液的选择取决于蛋
白的稳定性和溶解性，确保填充柱子前样品已经被适当地溶解和净化。
在填充柱子之前，需要先平衡填充柱子，通常使用与样品相同
的缓冲液。
填充柱子时，需要小心操作，确保填充均匀，避免气泡的产生。
填充柱子的速度应该适中，以免填料受到损坏或形成不均匀的层析床。
填充结束后，需要进行压缩，以确保填充物的密实度和柱子的
稳定性。
最后，进行层析实验前，需要对填充好的柱子进行质量控制，
比如检查柱子的均匀性和密实度，以及检测柱子的渗透性和分辨力。
只有填充好的柱子通过了质量控制，才能进行后续的层析实验。
总的来说，蛋白纯化层析柱填装是一个复杂而关键的步骤，需要仔细选择填料和柱子，合理准备样品和缓冲液，并严格控制填充和质量，以确保最终获得高质量的纯化蛋白。
GST-FF层析填料说明书
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow原理谷胱甘肽S-转移酶是一种经常被使用的Tag，可以使含有谷胱甘肽S-转移酶的重组蛋白的纯化和检测更加容易，为了使产物的纯化更简单，GST融合蛋白的一步纯化是可用的。
纯化简要概述结合缓冲液：140mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4, pH 7.3洗脱缓冲液：50mM Tris-HCl, 10mM 还原型谷胱甘肽, pH 8.01，用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
2，上样。
3，用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子。
4，用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
5，用5-10倍体积的结合缓冲液冲洗柱子。
使用注意1，样品上样期间和洗脱期间，保持较低的流速是非常重要的，因为GST和谷胱甘肽互相间的结合动力学作用是相对较低的。
其结合容量是依赖于蛋白质的特性，因此其产量是依赖于蛋白质的类型而变化的。
使用较低的流速或者将样品反复流过柱子几次，或许可以提高产量。
2，柱子的重复使用取决于样品的特性。
对同一样品重复使用时，需考虑避免交叉污染的问题。
在位清洗1，用2-3倍柱体积的，高端pH值为（0.1M Tris-HCl,0.5M NaCl,pH8.0）和低端pH值为（0.1M 醋酸钠,0.5M NaCl,pH4.5）的缓冲液交替冲洗柱子。
2，重复循环3次。
3，立即用3-5个柱体积的结合缓冲液再平衡柱子。
沉淀蛋白质的去除1，用2倍柱体积的6M的盐酸胍冲洗柱子。
2，立即用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子。
通过疏水性互相作用结合到柱子上的物质的去除1，用3-4倍柱体积的70%的乙醇冲洗柱子（或者2倍柱体积的非离子型去污剂如1%的曲拉通-100冲洗柱子）。
2，立即用5倍柱体积的结合缓冲液冲洗柱子。
当填料在室温状态下暴露在0.1M柠檬酸盐（pH4.0），0.1M NaOH，70%的乙醇或者6M盐酸胍2小时后，其结合能力没有显著地丢失。
离子交换填料选择
离子交换填料的选择、处理和保存(1)离子交换填料的选择离子交换填料的种类很多，离子交换层析要取得较好的效果首先要选择合适的离子交换填料。
首先是对离子交换填料电荷基团的选择，确定是选择阳离子交换填料还是选择阴离子交换填料。
这要取决于被分离的物质在其稳定的pH 下所带的电荷，如果带正电，则选择阳离子交换填料；如带负电，则选择阴离子交换填料。
例如待分离的蛋白等电点为4，稳定的pH 范围为6－9，由于这时蛋白带负电，故应选择阴离子交换填料进行分离。
强酸或强碱型离子交换填料适用的pH 范围广，常用于分离一些小分子物质或在极端pH 下的分离。
由于弱酸型或弱碱型离子交换填料不易使蛋白质失活，故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换填料。
其次是对离子交换填料基质的选择。
前面已经介绍了，聚苯乙烯离子交换填料等疏水性较强的离子交换填料一般常用于分离小分子物质，如无机离子、氨基酸、核苷酸等。
而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换填料亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。
一般纤维素离子交换填料价格较低，但分辨率和稳定性都较低，适于初步分离和大量制备。
葡聚糖离子交换填料的分辨率和价格适中，但受外界影响较大，体积可能随离子强度和pH 变化有较大改变，影响分辨率。
琼脂糖离子交换填料机械稳定性较好，分辨率也较高，但价格较贵。
另外离子交换填料颗粒大小也会影响分离的效果。
离子交换填料颗粒一般呈球形，颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(mm)来表示，目数越大表示直径越小。
前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗粒大小、孔隙的选择。
另外离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换填料颗粒大小有关。
一般来说颗粒小，分辨率高，但平衡离子的平衡时间长，流速慢；颗粒大则相反。
所以大颗粒的离子交换填料适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离，而小颗粒的离子交换填料适于需要高分辨率的分析或分离。
这里特别要提到的是，离子交换纤维素目前种类很多，其中以DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)最常用，它们在生物大分子物质(蛋白质，酶，核酸等)的分离方面显示很大的优越性。
实验室层析填料应用指南
实验室层析填料应用指南实验室层析填料是一种用于气相色谱分析的重要工具，它能够有效地分离和识别混合物中的组分。
层析填料的选择对于实验室分析结果的准确性和精确性起着至关重要的作用。
本文将为您提供一份实验室层析填料的应用指南，旨在帮助您选择适合的填料并获得优质的分析结果。
首先，我们将从填料的化学特性方面来讨论选择填料的考虑因素。
填料的化学性质应与待分离混合物的性质相匹配。
一般来说，填料的极性应与混合物中最具极性的化合物相对应。
例如，对于极性混合物分析，常见的填料选择包括聚酰胺、硅胶、氨基硅胶等。
而对于非极性混合物分析，可以选择如为聚二甲基硅氧烷（PDMS）等非极性填料。
其次，填料的粒径也是很重要的考虑因素。
填料的粒径直接影响分离的分辨率和速度。
填料颗粒过大会导致分离效果差，颗粒过小则会导致分离速度慢。
因此，根据实验要求和需要，选择合适的填料粒径是很关键的。
一般来说，填料的粒径范围可以从3到10微米不等。
除了化学性质和粒径外，填料的稳定性也是值得考虑的因素。
填料应能在一定的温度和压力下稳定运行，不发生热解、蒸发或变形。
同时，填料应具有良好的机械强度和化学稳定性，以避免因填料破碎或溶解而影响分析结果。
此外，选择填料时还应考虑到其表面积和孔径大小。
填料的孔径越大，表面积越小，对大分子的分离效果较好；孔径越小，表面积越大，对小分子的分离效果较好。
因此，根据待分离混合物中化合物的大小和重量，选择合适数值的表面积和孔径大小的填料是非常重要的。
最后，考虑到实验室层析填料的成本问题也是很重要的。
填料的成本应与实验预算相匹配，并且填料的耐用性和再生性也是需要考虑的因素。
有些填料可以通过再生来延长使用寿命，这样可以节约成本并减少对环境的影响。
综上所述，选择适合的实验室层析填料是获得准确和精确分析结果的关键。
选择填料时需要考虑化学特性、粒径、稳定性、表面积和孔径大小以及成本等因素。
通过合理选择填料，可以提高实验室层析分离的效果，并获得可靠的分析结果。
亲和层析预装柱和填料选择指南
亲和层析预装柱和填料选择指南亲和层析是一种常用的生物分离技术，其基本原理是利用靶分子与具有特殊亲和性的固定相相互作用，实现目标分子的分离纯化。
该技术被广泛应用于蛋白质纯化、分析、制备以及药物研发中。
本文将为您介绍亲和层析预装柱和填料选择的指南。
首先，亲和层析的预装柱种类繁多，如Ni-NTA、GST、MBP、Protein A、Protein G、Protein L等。
选择合适的预装柱主要取决于目标蛋白的性质和亲和配体的选择。
以下是几种常见的亲和层析预装柱及其适用性。
1. Ni-NTA柱：适用于His标记蛋白的纯化。
该柱上的Ni2+离子与His标记相互作用，实现蛋白的选择性吸附。
Ni-NTA柱广泛应用于蛋白质纯化和表达系统中。
2. GST柱：适用于GST标记蛋白的纯化。
GST标记用于表达系统和蛋白质亲和纯化，其独特的亲和性可与谷胱甘肽S转移酶 (glutathione S-transferase，GST)结合。
3. MBP柱：适用于MBP标记蛋白的纯化。
麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein，MBP)可通过特异性辅助蛋白结合一些亲和配体，实现蛋白的纯化和表达。
4. Protein A/G/L柱：适用于免疫球蛋白 (IgG) 的富集。
Protein A/G/L分别与IgG的不同部位结合，用于IgG的富集和纯化，常用于抗体生产和医学诊断。
其次，填料选择也是亲和层析中一项重要的技术选择。
填料是用于填充柱体的固体介质，其性能直接影响到层析分离的效果。
以下是一些常见的填料种类及其特点：1.球形填料：球形填料具有均一的颗粒尺寸和良好的柱层分离性能。
常见的球形填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
2.凝胶填料：凝胶填料通常用于分离较大分子，如蛋白质、核酸等。
常见的凝胶填料有琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。
3.磁性填料：磁性填料具有较高的分离效率和灵敏度，常用于磁性亲和层析。
磁性填料结合预装柱可以实现高通量的自动化分离和纯化。
Protein G层析填料说明书
Protein G Sepharose Fast Flow原理蛋白质G ，来自G 链球菌组的细胞表面蛋白，是III Fc-受体型蛋白。
蛋白质G 通过非免疫机制结合抗体的Fc 区域。
蛋白质G 特异性的结合IgG 的Fc 区域，但是对于一些多克隆抗体IgGs 对人源的IgG 抗体能够有更强的结合。
在标准缓冲液条件下，蛋白质G 能够结合所有的人源性的亚类抗体和所有鼠源性的IgG 亚类抗体，包括鼠的IgG ，或者兔的IgGa 和IgGb 。
进行一个分离操作结合缓冲液：20mM 磷酸纳，pH7.0洗脱缓冲液：100mM 甘氨酸，pH2.7中和缓冲液：1M Tris-HCl ，pH9.01， 用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。
2， 用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
3， 上样，流速为1-4ml/min （1ml 的柱子），或者5ml/min （5ml 的柱子）。
收集流穿片段。
4， 用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm 波长检测）。
5， 用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
洗脱液立即用中和缓冲液（0.06ml~0.2ml 1MTris-HCl ，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。
6， 立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子 。
使用注意1， 样品需要离心（10000g/20min ）去除细胞和细胞碎片。
离心下来的上清经过一个0.45μm的滤膜过滤。
2， 来自多数物种的IgGs 和亚类，在接近生理pH 值和离子强度的条件下，可以结合到蛋白质G 上。
对于特别物种IgG 的最佳结合条件，应该查阅近期的文献。
3， 当pH 值为2.7或者低于2.7时，大多数种类的免疫球蛋白能从蛋白质G 上被洗脱下来。
4， 洗脱完成后，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子非常重要。
在通常使用的水溶性缓冲液中都是稳定的。
储存用20%的乙醇在中性pH值的条件下冲洗介质和柱子，在4°~8°条件下储存。
层析填料选择
A = Macroprep High Q B = Fractogel EMD, TMAE 650 C = SuperQ 650 D = Q HyperD E = STREAMLINE Q XL F = Q Sepharose XL
19 / GE /
MacroCap SP
－－专为较大的生物分子设计的阳离子交换填料 •特别适合PEG修饰后的蛋 白的纯化
10 / GE /
Sepharose 系列填料
－快速大分子凝胶过滤首选 • Sepharose的结构：
β-D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖交替结合所形成的线 性多聚糖。 在形成过程中由单独的多糖链先形成双螺旋，然后聚 集成胶束，胶束之间形成微孔，其大小取决于胶束的 多少，即琼脂糖的浓度。 pH为4-9之间稳定。 琼脂糖凝胶对样品的吸附 作用很小，并且机械强度 和孔穴稳定性都很好。 Sepharose: Separation Pharmacia agrose
Mono P：专为层析聚焦设计的弱阴离子交换填料
21 / GE /
Capto基架系列离子交换填料
－－新一代快流速高载量填料
+
基架 • • • • 表面延伸剂
+
O
SO
3
配基:磺酸乙烷基
改良交联琼脂糖---刚性更强、传质速度更快 线状葡聚糖表面延伸剂---载量提高 颗粒大小：平均90um,75um,40um 配基：Q、S、DEAE、Adhere、MMC、ImPres
7
2 4 5 3 6
100,000 1,000,000 10,000,000
1. Superdex™ Peptide 2. Superdex 75 3. Superdex 200 4. Sephacryl™ S-100 HR 5. Sephacryl S-200 HR 6. Sephacryl S-300 HR 7. Sephacryl S-400 HR
d301大孔树脂 蛋白质 c18
d301大孔树脂蛋白质 c18下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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离子交换层析柱和填料选择指南
平衡 1M
样品 上样体积
梯度洗脱
不结合的分子在 梯度开始前被洗脱
[NaCl]
10–20 CV
5–10 CV 0
柱体积（CV）
图1.使用梯度洗脱的典型IEX分离。
洗涤 高盐洗涤
5 CV
再平衡
紧密结合 的分子在 高盐洗涤 中被洗脱
5–10 CV
蛋白质由含有可以被测定的弱酸和弱碱基团（即电离 基团）。因此，蛋白质的净表面电荷是高度依赖的p H，并将随着环境pH变化而逐渐改变。每种蛋白质都 有其针对pH的独特静电荷关系，这可以被视为滴定 曲线（图2）。这条曲线反映了蛋白质整体净电荷如 何根据环境的pH变化。可以在不同的pH值下利用IEX 以分离具有截然不同电荷性质的多种蛋白。图2显示 如何选择正确的pH（实现令人满意的分最重要参数 之一）。
清洗程序，方案1
用4 CV达到70%的乙醇或30%的异丙醇洗涤。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗，直到紫外基线和洗 脱pH稳定。 立即用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤2相 同）。
清洗程序，方案2
用2 CV含有去垢剂的碱或酸溶液洗涤（例如含有 0.1–0.5%非离子型去垢剂的0.1 M乙酸）。 用5 CV 70%乙醇冲洗以去除残留的去垢剂。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗（流速与步骤1相同）， 直到紫外基线和洗脱pH稳定。 用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤1相同）。
用于阳离子交换层析的缓冲液
pH间隔
物质
1.4-2.4 2.6-3.6 2.6-3.6 3.3-4.3 3.3-4.3 3.7-4.7 5.1-6.1 4.3-5.3 5.2-6.2 5.6-6.5 6.7-7.7 7.0-8.0 7.8-8.8
马来酸 甲基马来酸 柠檬酸 乳酸 甲酸 琥珀酸 琥珀酸 乙酸 甲基马来酸 MES 磷酸盐 HEPES BICINE
rProtein A层析填料说明书
rProtein A Sepharose Fast Flow原理蛋白质A来自金黄色葡萄球菌属，包含5个区域，可以用来结合IgG的Fc区域。
作为一个亲和配基，蛋白质A偶联到Sepharose上，似的这些区域可以结合游离的IgG分子。
一份子的蛋白质A可以至少结合两分子的IgG。
尽管蛋白质A主要是与人类免疫球蛋白IgG进行结合，一些其他类型的免疫球蛋白也显示出能够结合蛋白质A。
蛋白质A能够与人初乳IgA发生相互作用，同时也可以和人类的骨髓瘤IgA2发生反应，但是不能与IgA1发生反应。
一些人类的单抗IgMs和一些来自正常的和巨球蛋白血症血清中的IgMs能够结合蛋白质A。
进行一个分离操作结合缓冲液：20mM磷酸纳，pH7.0洗脱缓冲液：100mM柠檬酸-柠檬酸钠，pH3~6中和缓冲液：1M Tris-HCl，pH9.01，用5倍柱体积的蒸馏水冲洗柱子。
2，用5倍柱体积的结合缓冲液平衡柱子。
3，上样，流速为1-4ml/min（1ml的柱子），或者5ml/min（5ml的柱子）。
收集流穿片段。
4，用5-10倍柱体积的结合缓冲液平衡分离柱，直到基线，即所有未结合物质都被冲洗出柱子（紫外检测器在280nm波长检测）。
5，用5倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。
洗脱液立即用中和缓冲液（0.06ml~0.2ml 1M Tris-HCl，pH9.0每毫升馏分）中和至中性。
6，立即用5-10倍体积的结合缓冲液重新平衡柱子。
使用注意1，样品需要离心（10000g/20min）去除细胞和细胞碎片。
离心下来的上清经过一个0.45μm 的滤膜过滤。
2，来自多数物种的IgGs和亚类，在接近生理pH值和离子强度的条件下，可以结合到蛋白质A上。
如果蛋白质和配基之间的互相作用较弱，应该避免过度冲洗，因为这样可能会减少最终的产量。
3，对于一些抗体，比如小鼠IgG，当使用蛋白质A进行纯化时，可能需要向结合缓冲液中加入3M的氯化钠，达到最有效的结合，例如1.5M的甘氨酸和3M的氯化钠，pH为8.9。
实验室层析填料应用指南
咨询热线：800-810-9118 400-810-9118 网址：
3
层析介质应用
2、分子筛技术：是利用多肽分子大小、形状差异来分离 纯化多肽物质。Superdex peptide 专门分离多肽类产品 的高分辨率分子筛凝胶，分离的分子量范围为 100-7000 Da。高化学稳定性 , pH 1-14, 兼容有机溶剂 ( 乙腈 +TFA)。
• 如果反相和离子交换技术都效果不好，原因可能是溶解 性的问题。
• 使用凝胶过滤如 Superdex peptide，Sephadex LH20 都 很好的用在多肽纯化中。
• 需要增加选择性，载量和稳定性：用多维纯化方法，可 以将离子交换，分子筛和反相层析等多种技术结合，而 代替一步反相或反复用反相柱子纯化。
常见的重组细胞因子有：干扰素（Interferon,IFN）、肿瘤 坏死因子（tumor necrosis factor, TNF）、集落刺激因子 （colony-stimulating factor）、趋化因子（chemokine）、 生长因子（growth factor, GF）、白细胞介素系列（interleukin, IL) 等。
4
咨询热线：800-810-9118 400-810-9118 网址：
GE 生命科学部层析技术应用部
二、多肽分离技术的综合运用
对于大多数的多肽来说，仅仅一步纯化或一种技术应用 是不够的，通常会将反相，离子交换和凝胶过滤这三种 技术综合起来进行多步纯化，最终达到高的分辨率。 例 1 、PY574a 多肽，14aa，pI>10, 在酸性条件下不溶。
一、原核表达细胞因子的纯化工艺
1、重组人干扰素 α2b(rh-IFNα2b) 的纯化：
大肠杆菌发酵
离子交换层析柱和填料选择指引
GE医疗中国离子交换层析柱和填料选择指南GE梦想启动未来一般信息离子交换层析的原理离子交换（IEX）层析能够分离电荷只有轻微差别的一分子或组分子。
以保证分离是基于带电分子与带相反电荷的层析填料之间的可逆相互作用。
通常情况下，选择条件被感兴趣的分子随着上样柱上而结合到层析填料然后改变条件以便使被结合的物质被洗脱。
经常通过连续梯度或逐步增加离子强度进行洗脱，最常使用NaCl。
图1显示典型的高分辨率梯度洗脱。
阶段洗脱如图3所示。
]lCaN[柱体积（CV）1 M5 CV不结合的分子在梯度开始前被洗脱高盐洗涤平衡梯度洗脱样品上样体积再平衡洗涤5–10 CV5–10 CV10–20 CV紧密结合的分子在高盐洗涤中被洗脱图1.使用梯度洗脱的典型IEX分离。
蛋白质由含有可以被测定的弱酸和弱碱基团（即电离基团）。
因此，蛋白质的净表面电荷是高度依赖的p H，并将随着环境pH变化而逐渐改变。
每种蛋白质都有其针对pH的独特静电荷关系，这可以被视为滴定曲线（图2）。
这条曲线反映了蛋白质整体净电荷如何根据环境的pH变化。
可以在不同的pH值下利用IEX 以分离具有截然不同电荷性质的多种蛋白。
图2显示如何选择正确的pH（实现令人满意的分最重要参数之一）。
离子交换剂的选择以强交换剂(Q, S, SP)开始，能够在广泛的pH范围进行开发工作。
如果感兴趣蛋白的等电点低于pH 7.0或未知，则使用强阴交换剂（Q）结合蛋白。
当在一个极端pH下出现最大分辨率，而且感兴趣的蛋白质在此pH下稳定时，使用强交换剂。
如果强的离子交换剂的选择性不理想，则考虑使用弱的交换剂(DEAE, ANX, CM)，但请记住弱的离子交换剂的离子交换能力随着pH而变化。
多峰配体(MMC, adhere)提供离子相互作用、氢键和疏水相互作用。
MMC表现的如同弱的阳离子交换剂，但可以在高电导率下结合。
Adhere表现为强阴离子交换剂。
层析柱填料选择根据纯化步骤的目标和起始材料的条件选择离子交换填料。
凝胶柱层析关键的一环——如何选择凝胶填料
15.脱盐、小分子去除
使用凝胶过滤介质Sephadex G10，G15，G25，G50等去除小分子，效率高，处理量可达床体积30%。只需在进样后收集首1/3-1/2柱体积的洗脱液，就可以去除该填料分离范围上限以下的小分子，简单直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整个过程一般可于数分钟至半小时完成。Sephadex G25系列介质专为蛋白质脱盐而设计，预装柱HiTrap Desalting（5ml）可用针筒操作。HiPrep Desalting(26ml)可在数分钟为多至10ml样品脱盐。
2.选择------层析方法
若对目标蛋白的特性或样品成分不太了解，可尝试几种不同的纯化方法：
一] 使用最通用的凝胶过滤方法，选择分离范围广阔的介质如Superose、Sephacryl HR依据分子量将 样品分成不同组份。
二] 用含专一配体或抗体的亲和层析介质结合目标蛋白。亦可用各种活化偶联介质偶联目标蛋白的底物、受体等自制亲和介质，再用以结合目标蛋白。一步即可得到高纯度样品。
凝胶柱层析关键的一环——如何选择凝胶填料
如何选择凝胶
做分离纯化工作的人都知道，选择合适的填料是至关重要的。
1.测定------分子量、PI
当目标蛋白的物理特性如分子量、PI等都不清楚时，可用PAGE电泳方法或层析方法加以测定。分离范围广阔的Superose HR预装柱很适合测定未知蛋白的分子量。用少量离子交换介质在多个含不同PH缓冲液的试管中，可简易地测出PI，并选择纯化用缓冲液的最佳PH。
*HiTrap IgM是用来纯化融合瘤细胞培养的单抗IgM，结合量达5mg IgM。HiTrap IgY是专门用来纯化IgY，结合量达100mg纯IgY。
8.纯化------重组蛋白
层析填料选择
27 / GE /
Capto MMC
－－耐高盐浓度的弱阳离子交换凝胶
SOURCE Capto sepharo新se一代填料是 什么呢？
1960
1970
1980
1990
2000
填料的基本特点
• 五大类层析技术 – 凝胶过滤 (GF) – 离子交换 (IEX) – 亲和层析 (AC) – 疏水层析 (HIC) – 反相层析 (RPC)
• 基架 - 颗粒越细、大小越均匀，分辨率越高，但反压亦较高 (SOURCE基架例外)
－－新一代快流速高载量填料
+
基架
表面延伸剂
+O
-
SO3
配基:磺酸乙烷基
• 改良交联琼脂糖---刚性更强、传质速度更快 • 线状葡聚糖表面延伸剂---载量提高 • 颗粒大小：平均90um,75um,40um • 配基：Q、S、DEAE、Adhere、MMC、ImPres
22 / GE /
Capto基架刚性更强
mg BSA/ml
250
200
150
100
50
0 ABCDEF
A = Macroprep High Q B = Fractogel EMD, TMAE 650 C = SuperQ 650 D = Q HyperD E = STREAMLINE Q XL F = Q Sepharose XL
19 / GE /
Sephacryl S系列填料
亲和层析填料安全操作及保养规程
亲和层析填料安全操作及保养规程亲和层析填料是生命科学领域中常用的一种分离纯化技术，具有高效、快速、灵敏、选择性好等优点，广泛应用于蛋白质、抗体、核酸等生物大分子的生产纯化中。
本文主要介绍亲和层析填料的安全操作及保养规程，以确保填料的使用效果和使用寿命，保障实验室人员的安全。
1. 亲和层析填料的安全操作1.1. 穿戴防护用具在使用亲和层析填料时，应根据实验室安全要求和填料生产商的建议佩戴相关的防护用具，例如手套、口罩、护目镜等。
同时应保持实验室的通风良好，避免吸入空气中的有毒有害物质。
1.2. 操作规范使用亲和层析填料前，应仔细阅读填料的产品说明书，并按照说明书的要求进行操作。
在填充柱子或操作离子交换层析设备时，应注意不要使填料受到过度挤压，以避免填料破碎或变形的情况。
在使用亲和层析柱进行制备操作时，应注意流速的控制。
超过填料的最大工作流速可能会造成填料压力过大，从而导致填料流失或柱子破裂的现象。
在柱子使用前后，应仔细检查柱子和填料的状态，确保无破损或损坏。
1.3. 废弃物的处理在亲和层析填料的使用过程中，为避免填料、试剂等对环境造成的影响，应正确处理废弃物。
将废弃物放入特定的废液罐中，或按照当地政府的规定进行处理。
2. 亲和层析填料的保养规程2.1. 储存在储存亲和层析填料时，应将其放置在干燥、不受阳光直射的地方。
同时也需要注意填料锁定密封，避免受到污染和高温的影响。
2.2. 清洗在使用亲和层析填料后，应及时对填料进行清洗。
填料清洗可以采用纯水、去离子水、甲醇等多种方式，具体的清洗方法需要根据填料的种类和使用情况进行选择。
2.3. 保养亲和层析填料的保养可以延长填料的使用寿命和分离效率。
在填料长时间不使用时，可以与专门的符合填料特性的保养液或缓冲液进行浸泡，使其不致变干或出现微生物污染。
在每次使用前，也应检查填料的状态和完整性，确保其没有发生变形、破损等问题。
3. 总结本文简单介绍了亲和层析填料的安全操作及保养规程，这些措施能够有效预防实验室人员受伤和填料的损坏，增加实验室的安全性和生产效率。
层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片
层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片层析填料是层析柱中的重要组成部分，用于分离和分析混合物中的化合物。
选择适当的填料和正确的装柱技术对于有效的分离和分析至关重要。
本文将介绍常见的层析填料选择以及装柱技术，帮助读者更好地了解层析填料和其应用。
1.常见的层析填料选择1.1.多孔性填料多孔性填料具有较大的比表面积，高度依赖吸附作用进行分离。
常见的多孔性填料包括硅胶、氧化铝、高性能液相色谱（HPLC）硅胶等。
硅胶是一种广泛应用的填料，适用于各种液相色谱和薄层色谱。
氧化铝适用于高温、高压和强碱条件下的分离和分析。
1.2.非多孔性填料非多孔性填料的表面通常是通过化学修饰来增加相互作用位点，从而提高分离效率。
常见的非多孔性填料包括疏水材料、离子交换材料和手性分离材料。
疏水填料适用于非极性化合物的分离和分析，离子交换填料适用于电荷相互作用的分离和分析，手性分离填料适用于手性化合物的分离和分析。
1.3.水合性填料水合性填料可在水溶液中分离和分析离子化合物。
常见的水合性填料包括离子交换树脂和亲水基团修饰的填料。
离子交换树脂适用于离子化合物的分离和分析，亲水基团修饰的填料适用于水溶性化合物的分离和分析。
2.层析填料的装柱技术介绍2.1.平衡填料在装柱前，必须将填料彻底平衡。
通常的方法是通过重复使用洗脱溶剂来彻底浸润填料，以确保填料内的溶剂达到平衡状态。
平衡填料的时间通常取决于填料类型和孔径大小。
2.2.压缩填料压缩填料是确保填料均勻装填并且没有空隙的重要步骤。
填料通常是用特定的填充装置装入柱中，然后使用预设的压力进行压缩。
压缩填料可以提高填料的效率和分辨率。
2.3.装柱液体装柱液体是将混合物加载到柱上的溶剂。
选择合适的装柱液体取决于样品的性质和需要分离的目标。
装柱液体的选择应考虑到填料的相容性和分离效果。
2.4.装柱方法装柱方法包括静态装柱和动态装柱。
静态装柱是将装柱液体直接加载到柱体中，然后关闭柱体两侧的关闭装置。
层析填料Capto MMC的使用说明
层析填料Capto MMC的使用说明层析填料captommc的使用说明captommc皇家药院captormmc是一种耐盐的多模式的生物处理媒介，在使用填充床色谱法从大量的培养液中纯化蛋白质时可以作为捕获介质和中间纯化介质。
captommc在提高生产力的同时降低了生产成本：在高电导率下具有很高的动态载量；高容量的吞吐量；新的选择性；更小的操作单元。
1生物处置媒介生物处理媒介因为生产规模的色谱层析而得到发展。
所有的生物处理媒介均经验证方法进行生产，并且经过测试以满足生产的需求。
安全的订购和交付模式能够为规模生产需要的媒介提供可靠的供应。
法规支持文件(rsf)可用来协助工艺验证和提交给监管机构。
生物处理媒介可以覆盖从捕获到精纯的所有纯化步骤。
2captommc的特性captommc具有多种官能团的配体，多种作用方式的官能团使配体具有不同于传统离子交换剂的选择性，且在高盐条件下仍具有结合蛋白质的活性。
captommc与大分子间存有多种促进作用方式，其中最明显就是离子促进作用，氢键和亲水性促进作用。
captommc是为了提高介质在捕获和中间纯化步骤中的速度和通量而设计的。
通过提高高盐浓度下的容量和低反压条件下的流速，而减短生产周期和提供生产力。
该媒介以低流速的琼脂糖为基质，典型的大规模柱子(直径为1m，柱床高度为20cm)在顶板压力高于3bar时流速为600cm/h或者更高。
低交联度的琼脂糖基质提供了很高的物理和化学稳定性。
容量、洗脱行为和压力/流速等特性不受层析过程常用溶液的影响。
captommc和琼脂糖6快速的压力-流速特性比较，工作条件3方法设计和优化设计和优化生物大分子拆分方法的目的就是确认实验条件，在尽可能长的时间和尽可能低的产品回收率的条件下提升目的分子的最小溶解量。
在结合蛋白时，captommc的作用类似于弱阳离子交换剂。
因为允许在高电导率条件下溶解蛋白，所以可能将不须要为了提升填料的融合能力而回去甄选最佳化的读取电导率。
mrna亲和层析填料
mrna亲和层析填料
在蛋白质表达和纯化中，mRNA（信使RNA）亲和层析是一种分离和纯化mRNA分子的方法，通常用于从细胞提取物或生物样品中富集特定的mRNA分子。
这一过程中，填料或柱子的选择至关重要，以确保有效分离和富集目标mRNA。
以下是一些用于mRNA亲和层析的填料：
1. 寡核苷酸亲和层析填料：这种填料包含了与目标mRNA互补的寡核苷酸序列（例如，寡聚腺苷酸或其他核苷酸寡聚物）。
这些填料通过碱基互补作用与目标mRNA结合，然后可以通过洗脱来收集富集的mRNA。
2. 磁珠亲和层析填料：这是一种常用于RNA富集的填料，其中填料颗粒表面具有特定的亲和分子，可与RNA结合。
在mRNA亲和层析中，磁珠填料经常用于方便快速分离和富集mRNA。
3. 半乳糖填料：半乳糖填料是一种用于RNA亲和层析的经典填料，它能够结合RNA分子。
特别适用于富集mRNA，因为mRNA通常具有聚腺苷酸尾巴（poly-A tail），它们可以通过与半乳糖填料上的寡聚腺苷酸结合来富集。
4. 滤膜填料：一些滤膜填料可以用于RNA富集和分离，通常需要通过RNA结合柱或滤膜操作来实现。
5. 负载的金属离子亲和层析填料：这种填料依靠金属离子与RNA 之间的亲和性来捕获RNA分子，通常用于分离RNA的富集。
在选择mRNA亲和层析填料时，要考虑目标RNA的性质、纯度要求和实验条件。
填料的选择也可能受到可用设备和仪器的限制。
填料的性能和使用方法通常会根据生产商的指南来确定，因此在使用之前，请详细阅读相关的技术手册和说明书。
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Conventional Surface
Protein
Porous particle
Grafted Layer of a Hydrophilic Polymer
高动态载量和更快的质量传递
Capto Q/SP ImpRes --快流速高分辨率 填料
40 μm粒径 Capto™ ImpRes
同样适用于使传统IMAC填料金属离子脱落的样品
Sample kindly provided by Drs.Wolfgang Knecht (CVGI iMed Bioscience) and Paul Wan (Discovery Sciences), AstraZeneca R&D, Mölndal, Sweden
蛋白质层析新填料应用与选择
Imagination at work.
做好分离纯化需要什么？
层析设备
控制软件
技术方案
填料
生物分子特性
Ion exchange chromatography (IEX) 离子交换层析
净电荷 生物学亲和性
Tag, PTM
Affinity chromatography (AC) 亲和层析
Capto Core 700 优点:
• 高纯度和高回收率 • 高载样量和更短的接触时间 • 操作灵活适合工艺放大 高生产能力的同时提高工艺 的经济性
Capto Core 700 vs Gel Filtration
LAIV virus purification
HCP and fragmented Virus in void DNA in total volume Virus in FT HCP and fragmented DNA in CIP
+ 分子质量小，免疫原性低 + 易于进入实体瘤 + 容易表达，可以使用酵母或者大肠杆菌
- 抗原结合活性相对较弱 - 半衰期短
Capto Core 700 凝胶过滤和吸附层析复合模式
天然琼脂糖基架外壳
-没有表面基团 -排阻大分子>700kDa
激活内核-带辛氨基 (多通道配体)
-目标物穿透
-进入孔内的小分子被捕捉 -通过CIP再生
Zstab
Zstab Zstab Zstab Zstab
N6 N3
Cys
SuRe Ligand for Mabselect SuRe Mr 26748
OH O O O OH
OH O O O O + HS–
Prot A
S – ligand
Single-point attached thioether bond
for reduction to below detection limit of < 3 organisms /mL
0.5 M NaOH effectively inactivates bacteria, mold and yeast
endotoxin (ng/mL)
Inactivation of endotoxin
Media
Sepharose™ 4 FF
Virus Recovery (HA*) [%]
100
Host Cell Protein Removal [%]
95
Amount of loaded feed material [CV]
Organism C. albicans A. niger P. aeruginosa S. aureus
1
Type yeast mold bacteria gram bacteria gram +
Time1 1h 1h 1h 1h
On average, 0.5 M NaOH results in 0.5 LRV higher inactivation versus 0.1 M NaOH
SDS-PAGE (reduced conditions 1. LMW-SDS Marker Kit 2. 0 mM EDTA 3. 2 mM EDTA 4. 10 mM EDTA
Sample kindly provided by Drs.Wolfgang Knecht (CVGI iMed Bioscience) and Paul Wan (Discovery Sciences), AstraZeneca R&D, Mölndal, Sweden
纯化CHO细胞培养基中分泌表达的蛋白 Ni Sepharose™ excel vs. Ni Sepharose 6 FF
Sample: 250 ml mPAI-1-(his)8 secreted into GIBCO™ CD CHO medium, pH 7.0 RESULTS Blue – Ni Sepharose excel packed in Tricorn ™ 5/50: Purity >98% Green - Ni Sepharose 6 FF packed in Tricorn 5/50: No recovery of target protein
Increase 小粒径，大改变
Superdex 200 Increase 更高的分辨率，更短的纯化时间
ed resolution
0.5 ml/min -> 48 min
Decreased runtime
0.5 ml/min -> 48 min
Superdex 200 10/300 GL:
R
O O CH2OH O O O O HO O O
6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0
Capto Family (Medium porosity)
R
Increasing flow rate
Capto高流速琼脂糖
表面修饰
减少非特异性吸附 控制内表面积 通过提高内表面积提高载量
表面衍生物
Final concentration and clarification IMAC with conventional Ni resin
Final concentration and clarification
Time savings IMAC with conventional up to 50% Ni resin
3 小时
0.5 M NaOH 有效灭活病毒，降低生物负荷及内 毒素
Increased viral inactivation
10.0 LRV 5.0 0.0 HIV BVDV CPV BHV POL 0.5 M SV-40 MLV ADV 0.1 M
Increased bioburden control
SDS-PAGE (reducing conditions) 1. LMW-SDS Marker Kit 2. Start material 3. Ni Sepharose excel, flowthrough 4. Ni Sepharose excel, wash 5. Ni Sepharose excel, eluate 6. Ni Sepharose 6 FF, flowthrough 7. Ni Sepharose 6 FF, wash 8. Ni Sepharose 6 FF, eluate
0.5 ml/min -> 48 min
1.5 ml/min -> 16 min
Superdex 200 Increase 10/300 GL:
磁感应蛋白MagR
Superose 6 Increase
专为大蛋白和蛋白复合体纯化设计
Protein A抗体亲和填料
MabSelect SuRe (2005) MabSelect (2001) MabSelect Xtra (2005) MabSelect SuRe LX (2012) rmProtA Sepharose FF
Ni Sepharose excel简化工作流程
Conventional workflow NEW workflow
Cell culturing
Time
Cell culturing
Removal of cells
Removal of cells
Diafiltration
Ni Sepharose™ excel/ His Mag Sepharose excel
Ni Sepharose™ excel在位清洗
• 即使在0.01HCl中孵育 1个星期镍离子都不会 脱落
•可进行 1 M NaOH在 位清洗
MabSelect SuRe™ LX 动态载量较 MabSelect SuRe提高45%
human IgG monoclonal antibodies
抗体和抗体片段 全抗 Fab ScFv Dabs
E E
N21 N23 N52 N43 N28 N11
cell wall binding domain
C C X X
IEGRNC
Native protein A Mr ~ 42 000
D D
A A
B B
rProtein A Mr 34 300
B domain Mutant (Asp replaced with alkali-stable amino acid )
时间更短，分辨率更高，用途更广
Superdex 200 Matrix Fractionation range Flow/pressure properties Average bead size pH stability Regular use Short term (CIP) Superdex 200 Increase Cross-linked agarose and dextran Molecular weights from 10 000 to 600 000 Regular 13 µm pH 3 – 12 pH 1-14 Rigid beads with high flow/pressure resistance 8.6 µm