HILIC色谱柱介绍

亲水作用色谱（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。

本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的注意事项进行了总结。

1. HILIC的概念
亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。

它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。

而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。

2. HILIC的分离机制
HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。

更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。

3.HILIC影响保留的主要因素
普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。

影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。

在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水, 流动相中水是最强的洗脱溶剂。

一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。

如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。

Figure 1. HILIC retention as a function of polar modifier. 100 mm length ACQUITY UPLC BEH HILIC column. Peaks: 1 = methacrylic acid, 2 = cytosine, 3 = nortriptyline, 4 = nicotinic acid.
4. HILIC与RP-HPLC的比较
传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。

HILIC正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLC互补的保留方式，能够使在RPLC 上保留较弱或没有保留的物质在HILIC柱上提供合适的保留，如图2所示：
Figure 2: Chromatograms comparing the retention of allantoin on Atlantis HILIC Silica and Atlantis dC18 columns. (a) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis dC18; mobile phase: 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows no retention (k =0) of allantoin. (b) Column: 50 mm×4.6 mm, 3-μm dp Atlantis HILIC Silica; mobile phase: 95:5 (v/v) acetonitrile–water containing 10 mM ammonium formate, pH 3; Shows retention (k =1) of allantoin.
另外，HILIC柱上的洗脱顺序与RPLC柱上的正好相反，极性较小的物质先出峰，极性较大的物质后出峰。

如图3所示：
Figure 3. Comparison of ESI+MS response using HILIC and RP conditions. SIR channels of acetylcholine (m/z 146.2) and choline (m/z 103.9); Columns: 100 mm×2.1 mm, 1.7μm
(A) ACQUITY UPLC BEH C18 (B) ACQUITY UPLC BEH HILIC. Peaks: 1 = acetylcholine,
2 = choline
5.HILIC与质谱技术联用
HILIC可为强极性和强亲水性的化合物提供合适的保留。

通过优化多个色谱参数，有利于实现目标组分和基质中干扰物质的分离，从而降低基质效应的影响；而含有高比例水溶性有机相的流动相又有利于提高质谱离子化效率，进而提高质谱分析的灵敏度。

质谱响应在某种程度上是取决于流动相中有机相的比例。

采用ESI源时，毛细管中离子化的过程类似于一个电泳过程。

由于毛细管被加高压，形成带电液滴。

溶剂蒸发，离子向液滴表面移动，当液滴表面电荷产生的库仑排斥力与液滴表面的张力大致相等时，液滴会分裂成更小的液滴，对于半径<10nm的液滴, 液滴表面形成的电场足够强，电荷的排斥作用最终导致部分离子从液滴表面蒸发出来，形成了气相离子。

而有机相的表面张力比水相的表面张力小得多。

因此，在相同的条件下，流动相中有机相的比例越高，质谱的响应越高。

从图4可以看出，在HILIC柱上的响应比在RPLC柱上的响应高出十倍左右。

Figure 4. Chromatograms comparing the retention and MS response of analyte on C18 m Inertsil ODS-3; mobileμcolumn and HILIC column. (A) Column: 2.1×50mm, 3 phase: methanol-water containing 0.2% formic acid (15:85, v/v) (B) Column: m ACQUITY UPLC BEH HILIC; mobile phase: methanol-water containingμ2.1×50mm, 1.7 0.2% formic acid (85:15, v/v)
6. HILIC柱的使用
（1）初次使用HILIC柱时，应采用50倍柱体积的乙腈-水（50:50）平衡，在进第一针前，应用初始流动相平衡20倍的柱体积。

（2）HILIC柱冲柱子时，采用的是乙腈-水（50:50）来洗去极性物质。

如果解决不了问题，可以使用乙腈-水(5:95) 来冲柱子。

长时间不用时，将柱子保存在乙腈-水(95:5)中。

（3）要保证流动相中至少40%的有机相。

流动相中使用添加剂时，醋酸铵、甲酸铵的重现性优于乙酸和甲酸。

如必须使用甲酸等，0.2%优于0.1%，不要使用磷酸。

（4）水是最强的洗脱溶剂，所以强洗和弱洗溶剂与反相系统的正好相反：弱洗是初始流动相，即高比例的有机相。

并且进样溶剂最好是100%的有机相。

1.HILIC柱如何平衡？
HILIC柱使用70%的乙腈水溶液平衡。

2.HILIC柱如何保存？
HILIC柱使用90%的乙腈水溶液保存。

1. 一直使用Waters 的HILIC较多，感觉质量还行，但是要小心waters 的HILIC是分两种类型的填料的BEH HILIC和HILIC。

很多waters 的销售都不清楚之一点。

但是大家一定要注意，这两款的区别是很大的，保留的效果是不同的。

2. 费罗门公司的HILIC柱，感觉是小家碧玉型的，保留能力不是太强，但是清秀文雅，峰型很好看。

3. HILIC的流动相推荐使用乙腈。

4. 推荐使用乙酸铵，这也以后再说。

5.不能使用100% 的乙腈，推荐使用到95%就行了。

不能使用60%以下的乙腈。

所以梯度范围小。

但是足够用了。

因为100%的乙腈可能对HILIC的中亲水的部分不利于键合相的伸展开。

使得保留性能下降。

其中的解释也是经验，研究论文解释的也让人不太信服。

所以大家可以一起讨论一下这点。

使用甲醇的问题也是这样的。

在甲醇分子附近，HILIC的保留能力下降了，色谱峰型较差。

这也是经验结果。

Pubmed compound XlogP -2 -3，。