第四章色层分析法1
合集下载
生物分离工程-色层分离(一)
2 色层分离的分类
按溶质分子与固定相相互作用机理 ➢吸附层析（范德华力，氢键，静电力，共价力） ➢分配层析（溶质在两液相间分配系数不同） ➢凝胶过滤（分子大小与形状）
实验技术分类 ➢低压（小于0.5 Mpa) ➢中压 (0.5-5 Mpa) ➢高压 (5-40 Mpa) ➢电泳 (溶质在电场中移动）
➢性质： （1）亲水性比琼脂糖高（羟基数多） （2）化学稳定性及热稳定性好 （3）孔度与机械强度与交联度有关 （4）用于凝胶过滤分子筛 ➢应用：水溶液中分离蛋白质等
5 层析介质
---常用的层析介质
聚丙烯酰胺
➢性质： 1. 烯酰胺与交联剂N, N’-甲叉双丙烯酰胺共聚 2. 烷烃骨架与酰胺侧链 3. 控制交联剂比例可控制网格孔度 4. 亲水好，但不如多糖介质 5. 机械强度差 ➢应用： （1）凝胶过滤 （2） 电泳介质
流动相的移动距离＝ V/Am
Am Rf = Am K d As
5 基本概念
溶出体积
溶出体积VR :在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所通过的流动 相的体积
Vs 和 Vm 分别为固定相和流动相的总体积
滞留时间（一种溶质色谱柱所需的时间）
ν为洗脱剂的空塔速度 ；A 柱的截面积 Qe 洗脱剂的流量
5 基本概念
➢ 阻滞因子 分配层析溶质移动速度与理想流动相移动速度（ 距离）比值
5 基本概念
➢ 溶出体积 在柱色层分离中，使溶质从柱中流出时所 通过的流动相体积
➢ 分辨率 两峰之间的距离与两峰宽的平均值之比
➢ 理论塔板 流动相与固定相平均浓度达传质平衡时量之 比
5 层析介质
---常用的层析介质 琼脂糖
琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构 a 琼脂糖结构 b 亲水性凝胶结构
层析技术讲义
层析技术讲义层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），它是在1903-1906年由俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。
他将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱，并继续以石油醚淋洗，由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同，色素被逐渐分离，在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图（Chromatogram）。
当时这种方法并没引起人们的足够注意，直到1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物，人们才发现了它的广泛用途。
随着科学技术的发展以及生产实践的需要，层析技术也得到了迅速的发展。
为此作出重要贡献的当推英国生物学家Martin和Synge。
他们首先提出了色谱塔板理论。
这是在色谱柱操作参数基础上模拟蒸馏理论，以理论塔板来表示分离效率，定量的描述、评价层析分离过程。
其次，他们根据液－液逆流萃取的原理，发明了液－液分配色谱。
特别是他们提出了远见卓识的预言：一、流动相可用气体代替液体，与液体相比，物质间的作用力减小了，这对分离更有好处；二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差，应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数)，这将会大大提高分离效率。
前者预见了气相色谱的产生，并在1952年诞生了气相色谱仪，它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革；后者预见了高效液相色谱（HPLC）的产生，在60年代末也为人们所实现，现在HPLC已成为生物化学与分子生物学、化学等领域不可缺少的分析分离工具之一。
因此, Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。
如今的色层分析法经常用于分离无色的物质，已没有颜色这个特殊的含义。
但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。
现在我们简称为层析法或层析技术。
层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。
而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。
因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。
第四章色层分析法1
薄层层析：固定相在玻璃板、铝膜等支 持物上铺成薄层的层析分离。
色层分析法 第6页
2019年4月4日星期四
根据分离的原理分类
类型 原理 吸附力，疏水力和静 电力 固定相 硅胶Al2O3 、活性炭、羟基 磷灰石 硅胶、纤维素、滤纸、硅藻 土 带配基的琼脂糖、葡萄糖以 及硅胶等 交联葡聚糖、琼脂糖 树脂、离子型纤维素、葡聚 糖等离子交换剂 常用操作方式 柱层析、薄层层析
2019年4月4日星期四
色层分析法
第 23 页
在使用HA作为固定相基质时，有几点 应注意：
i) HA系干粉末时，要先在蒸馏水中浸泡，使其 膨胀度（水化后所占有的体积）达到2～ 3mL/g后，再按1:6体积加入缓冲液（如 0.01mol/L NaP(磷酸钠缓冲溶液)，PH6.8）悬 浮，以除去细小颗粒。 ii) HA悬浮液须用漩涡振荡器混合，若用磁棒 或玻璃棒搅拌时，HA的晶体结构会受破坏。
色层分析法
第 32 页
树脂的前处理
市售的树脂常含有未聚合的单体、致孔剂、分 散剂等，使用前需除去其中可能有毒性的有机 残留物。 前处理工艺合格的指标：醇洗脱液加水不显浑 浊；洗脱液蒸干后无残留物。 建议标准：不挥发性有机残留物的检查可参照 美联邦条例第170-199部分3卷21条（1998年修 订）；参照《日本药典》对塑料容器质量控制 的有关指标（电导率、易氧化物、酸洗脱液、 荧光及紫外吸收）。
非极性
500-600
2019年4月4日星期四
色层分析法
第 29 页
单体
交联剂
极性
孔径
比表面m2/g
HP-40 HP-50 GDX-104 GDX-401 GDX-501 GDX-601 Duolite S-30 Lewapol G7318
色层分析法 第6页
2019年4月4日星期四
根据分离的原理分类
类型 原理 吸附力，疏水力和静 电力 固定相 硅胶Al2O3 、活性炭、羟基 磷灰石 硅胶、纤维素、滤纸、硅藻 土 带配基的琼脂糖、葡萄糖以 及硅胶等 交联葡聚糖、琼脂糖 树脂、离子型纤维素、葡聚 糖等离子交换剂 常用操作方式 柱层析、薄层层析
2019年4月4日星期四
色层分析法
第 23 页
在使用HA作为固定相基质时，有几点 应注意：
i) HA系干粉末时，要先在蒸馏水中浸泡，使其 膨胀度（水化后所占有的体积）达到2～ 3mL/g后，再按1:6体积加入缓冲液（如 0.01mol/L NaP(磷酸钠缓冲溶液)，PH6.8）悬 浮，以除去细小颗粒。 ii) HA悬浮液须用漩涡振荡器混合，若用磁棒 或玻璃棒搅拌时，HA的晶体结构会受破坏。
色层分析法
第 32 页
树脂的前处理
市售的树脂常含有未聚合的单体、致孔剂、分 散剂等，使用前需除去其中可能有毒性的有机 残留物。 前处理工艺合格的指标：醇洗脱液加水不显浑 浊；洗脱液蒸干后无残留物。 建议标准：不挥发性有机残留物的检查可参照 美联邦条例第170-199部分3卷21条（1998年修 订）；参照《日本药典》对塑料容器质量控制 的有关指标（电导率、易氧化物、酸洗脱液、 荧光及紫外吸收）。
非极性
500-600
2019年4月4日星期四
色层分析法
第 29 页
单体
交联剂
极性
孔径
比表面m2/g
HP-40 HP-50 GDX-104 GDX-401 GDX-501 GDX-601 Duolite S-30 Lewapol G7318
第四章色层分析法1
类型 吸附层析
原理
吸附力，疏水力和静 电力
固定相 硅胶Al2O3 、活性炭、羟基
磷灰石
常用操作方式 柱层析、薄层层析
分配层析
分配系数、溶解度
硅胶、纤维素、滤纸、硅藻 纸层析、柱层析、
土
薄层层析
亲和层析
生物分子亲和力
带配基的琼脂糖、葡萄糖以
及硅胶等
薄层层析、柱层析
凝胶层析 离子交换层析
排阻效应 离子间作用力
抗污染性强；
价格便宜。
2020年5月26日星期二
色层分析法 第 14 页
吸附剂的多孔结构，粒度和粒子形状是影响色 层系统特性的基本因素。
2020年5月26日星期二
色层分析法 第 15 页
几种常用的固体吸附剂
吸附剂
特性大
孔径dp Å
硅胶 亲水无定形 40-80
Al2O3 亲水无定形
聚合物
----
20-80 -----
硅胶具有微酸性，可用于分离酸性和中性物质， 如有机酸、氨基酸、甾体激素、类脂，萜类及 色素等物质，硅胶用量一般是样品量的
３０～３６倍。
2020年5月26日星期二
色层分析法 第 20 页
（2）氧化铝
Al2O3是由Al(OH)３脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al－ＯＨ， 由于羟基的Ｈ键作用而能吸附其它物质。
2020年5月26日星期二
色层分析法 第 13 页
2．吸附剂的选择
高选择性以实现很好分离；
高容量以减少吸附剂的使用量；
对于快速吸剂具有很好的动力学和传递特性；
具有化学和热稳定性，在流动相中不溶解以保持吸附剂特性；
具有一定的机械强度和惰性，防止破碎和腐蚀；
色层分析法学习
第8页/共129页
色层分析法/共129页
色层分析法
二、分配柱层析 分配柱层析是利用各组分在两种不相混溶的溶剂中的 分配系数不同而得到分离，它相当于一种连续性的溶剂抽 提法。 1．分配系数K 一定量的溶质在两种不相溶的溶剂中达到平衡时，溶质在 两种溶剂中的浓度比值为一常数，此常数称为分配系数。
0-14
第21页/共129页
核苷酸类物质 分离提纯等
上海化工 学院
（美） Amberlite
IRA-400
色层分析法
产品 牌号
交换 基团
出
厂 离 子 形
形 状
粒度 （目
）
水分 （% ）
视比重 （克/毫
升）
式
弱酸 101× 128
（724 ）
— COOH
（甲 基丙 烯酸 型）
—
H型
球 状
1650
≤60
第6页/共129页
色层分析法
用作吸附剂的材料很多，可分为无机吸附剂与有机吸 附剂，常用的无机吸附剂有氧化铝、碳酸钙、氧化钙、氧 化镁、氧化锌、磷酸氢钙、硅酸、活性炭等。有机附吸附 剂有蔗糖、乳糖、淀粉、菊根粉、纤维素等。按其吸附力 的大小分为弱、中、强三类，见表6-1。
表6-1 吸附剂按吸附力分类
③ Zn2+＞Cu2+＞Ni2+＞Co2+＞Fe2+＞Ba2+＞Sr2+＞Ca2+＞ Mg2+
弱酸性阳离子交换树脂对氢离子的亲和力特别高，因 此再生为氢型时仅需很少量的酸。
第23页/共129页
色层分析法
强碱性阴离子交换树脂对各种离子的亲和力次序如下： 柠檬酸根＞SO42-＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN＞Cl-＞HCOO-＞OH-＞F-＞CH3COO弱碱性阴离子交换树脂对氯氧根离子有较高的亲和力。 对各种酸的亲和力次序如下： 芳香磺酸＞柠檬酸＞铬酸＞硫酸＞酒石酸＞草酸＞磷 酸＞砷酸＞钼酸＞硝酸＞氢碘酸＞氢溴酸＞硫氰酸＞盐酸 ＞氢氟酸＞甲酸＞乙酸＞碳酸 离子交换柱层析法就是利用各种离子对离子交换树脂 的亲和力的不同而达到分离的目的。
色层分析法/共129页
色层分析法
二、分配柱层析 分配柱层析是利用各组分在两种不相混溶的溶剂中的 分配系数不同而得到分离，它相当于一种连续性的溶剂抽 提法。 1．分配系数K 一定量的溶质在两种不相溶的溶剂中达到平衡时，溶质在 两种溶剂中的浓度比值为一常数，此常数称为分配系数。
0-14
第21页/共129页
核苷酸类物质 分离提纯等
上海化工 学院
（美） Amberlite
IRA-400
色层分析法
产品 牌号
交换 基团
出
厂 离 子 形
形 状
粒度 （目
）
水分 （% ）
视比重 （克/毫
升）
式
弱酸 101× 128
（724 ）
— COOH
（甲 基丙 烯酸 型）
—
H型
球 状
1650
≤60
第6页/共129页
色层分析法
用作吸附剂的材料很多，可分为无机吸附剂与有机吸 附剂，常用的无机吸附剂有氧化铝、碳酸钙、氧化钙、氧 化镁、氧化锌、磷酸氢钙、硅酸、活性炭等。有机附吸附 剂有蔗糖、乳糖、淀粉、菊根粉、纤维素等。按其吸附力 的大小分为弱、中、强三类，见表6-1。
表6-1 吸附剂按吸附力分类
③ Zn2+＞Cu2+＞Ni2+＞Co2+＞Fe2+＞Ba2+＞Sr2+＞Ca2+＞ Mg2+
弱酸性阳离子交换树脂对氢离子的亲和力特别高，因 此再生为氢型时仅需很少量的酸。
第23页/共129页
色层分析法
强碱性阴离子交换树脂对各种离子的亲和力次序如下： 柠檬酸根＞SO42-＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN＞Cl-＞HCOO-＞OH-＞F-＞CH3COO弱碱性阴离子交换树脂对氯氧根离子有较高的亲和力。 对各种酸的亲和力次序如下： 芳香磺酸＞柠檬酸＞铬酸＞硫酸＞酒石酸＞草酸＞磷 酸＞砷酸＞钼酸＞硝酸＞氢碘酸＞氢溴酸＞硫氰酸＞盐酸 ＞氢氟酸＞甲酸＞乙酸＞碳酸 离子交换柱层析法就是利用各种离子对离子交换树脂 的亲和力的不同而达到分离的目的。
第四章色层分析法1
常用的吸附剂有Al2O3，硅胶， 羟基磷灰石，聚酰胺等。
2019/11/19
18
（1）硅胶
硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂
2019/11/19
19
活化：在１０５～１１０℃加热３０min活化 不同形式（H/G/F） 粘合剂（煅石膏：牢度差，不能用于分离无机 物；羧甲基纤维素：牢度好，不能用腐蚀性显 色剂；淀粉：不能用于分离有机物）
（adsorption chromatography）
1.原理
2.吸附剂的类型及其选择
3.流动相及其选择
2019/11/19
8
吸附
指在固体或液体内部或表面的选择性传递。 被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。
2019/11/19
图15.1
9
吸附层析
混合物随流动相通过由吸附剂组成的 固定相时在固定相和流动相作用下发生 吸附、脱附、再吸附、再脱附的反复过 程。
XAD-9
苯乙烯 苯乙烯 苯乙烯 α -甲基丙烯酸甲酯
亚砜
二乙烯苯
二乙烯苯
二乙烯苯
双（α -甲基丙烯酸） 乙二醇酯
非极性 非极性 非极性 中极性
极性
XAD-10
丙烯酰胺
极性
XAD-12
氧化氮类
强极性
Diaion 系列
HP-10
苯乙烯
二乙烯苯
非极性
HP-20
苯乙烯
二乙烯苯
非极性
HP-30
苯乙烯
二乙烯苯
中药提取液－通过吸附树脂－吸附上有效成分的树脂
－洗脱－洗脱液－回收溶液－药液－干燥－半成品
由于吸附和筛选原理，有机化合物根据吸附力的不同 及分子量的大小，在吸附树脂上经一定的溶剂洗脱而 分开
生物分离工程之色层分离法完整
聚丙烯酰胺
性质：
（1）丙烯酰胺与交联剂N, N’-甲叉双丙烯酰
胺共聚
（2）烷烃骨架与酰胺侧链
（3）控制交联剂比例可控制网格孔度
（4）亲水好，但不如多糖介质
(5) 机械强度差
应用：（1）凝胶过滤
（2） 电泳介质
亲和层析
亲和层析(Affinity Chromatography)是利用生物体内存在的特异性相互作用的分子对而设 计的层析方法。
环氧氯丙烷活化反应式
环氧基的氨化及偶联配基反应
活化方法（3）
C 对甲苯磺酰氯活化 （1）用于活化含羟基基质、将羟基转化为磺酰
基、在配基偶联后容易脱落、不引入电荷。 （2）配基与羟基间形成稳定化学键。 （3）活化操作需在无水丙酮环境中进行，偶联
配基根据情况、既可在有机相中进行、亦可在 水相中进行。
得珠状介质。 ③采用交联剂增加介质的机械强度
琼脂糖的基本结构单位和亲水性凝胶结构 a 琼脂糖结构 b 亲水性凝胶结构
介质商品种类 Sepharose 2B, Sepharose 4B, Sepharose 6B。 经过交联而增加机械强度的琼脂糖 Sepharose CL-2B, Sepharose CL-4B, Sepharose CL-6B 应用 水溶液中分离蛋白质
“层析谱的本质是使一种液体均匀地渗过一个相当细碎的物质的柱体，这些物质通过某种过 程有选择地阻留了液体内的某些组分。”
——马丁（A. J. P. Martin）（英）
层析分离法
常用的层析技术有 (亲和层析、离子交换层析、凝胶排阻层析、凝胶电泳） 特点： （1） 纯化倍数高 （2） 操作规模小，放大困难 （3） 最终产品纯化 （4） 适用于价格昂贵的产品
(2) 细孔硅胶（1.5—2.0nm ) • (3) 中孔硅胶 (4.0一5.0nm) • (4) 粗孔硅胶 (10.nm以上) • 应用：吸附层析剂与分配层析剂 优先吸附极性分子及不饱和的碳氢化合物，用于天然产物分离， 可
第四章色层分析法1
11
吸附等温线：在一定温度下，某种组分在吸附
剂表面达平衡状态时在两相中浓度的相对关系 曲线。
吸附等温线的斜率KD表示分配系数，Cs表示 溶质在固定相中的浓度，Cm表示溶质在流动相 中的浓度达到平衡时在固定相中的浓度
2019/10/12
12
线形的吸附等温线 非线形的吸附等温线
2019/10/12
13
柱层析：固定相装填在管中成柱形，在 柱中进行的层析分离；
纸层析：利用滤纸作为固定相的层析分 离；
薄层层析：固定相在玻璃板、铝膜等支 持物上铺成薄层的层析分离。
2019/10/12
6
根据分离的原理分类
类型 吸附层析
原理
吸附力，疏水力和静 电力
固定相 硅胶Al2O3 、活性炭、羟基
磷灰石
常用操作方式 柱层析、薄层层析
2019/10/12
21
活度级别
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
2019/10/12
Al2O3 ０ ３ ６
１０ １５
含水量（%）
硅胶 ０ ５
１５ ２５ ３８
22
（3）羟基磷灰石
化学式[Ca5(PO4)3OH]2，简称HA。 国外的Bio－Rad公司生产的HA有三种规格，分 别适用于不同条件。由于HA的吸附容量高，稳 定性好（在T<85℃，PH5.5~10.0均可使用）。 HA的Ca2＋基团和生物表面的负电荷基团的相 互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要 的作用。HA的PO43-基团与生物分子表面的阳 电荷基团的相互反应，起着次要的作用。
2019/10/12
10
1．原理
吸附层析是通过样品在固定相和流动相之间的 吸附、脱附作用而实现分离的，这种吸附作用 是一种物理吸附，通常是单分子层或双分子层 或多分子层。
生物分离工程之色层分离法(完整)
活化方法（1）
A 溴化氰法 溴化氰在碱性条件下与多糖上的羟基反应导入氰酯键或亚氨碳 酸酯到基质上、进而与配基偶联 优点: （1） 适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质 （2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联 （3）操作步骤简单,重现性好。 （4）偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。 缺点： （1）形成的异脲键易产生非特异性吸附； （2）共价键不稳定,配基容易脱落； （3）活化操作危险性大，反应后的残余液需经处理再排放 。
对甲苯磺酰氯活化反应式
手臂（spacer)
• 作用 ：减少亲和作用空间位阻 • 连接：通过化学反应与活化基团连接 • 手臂化合物： 乙二胺 NH2-CH2-CH2-NH2 • 已二胺 NH2-CH2-CH2-CH2-CH2- CH2-CH2- NH2 • 6-氨基已酸NH2-CH2-CH2-CH2-CH2- CH2COOH • 环氧氯丙烷 • 1、4－ 丁二醇缩水甘油醚
层析法的发展过程
1903年
Tswett发表了吸附色谱分离植物色素的论文， 三年后他在另外两篇论文中正式提出色谱法。 1931年 色谱法提出后，并未立即受到重视。经过大 约20年，由于Lederer的工作，人们才重视色谱技术。 1938年 Izmailov和Shraiber第一次使用薄层色谱法。 1938年 Taylor和Uray用离子交换分离锂和钾的同位 素。40年代，合成离子交换树脂商品出现后，离子 交换色谱才得到广泛应用。1944年在美国橡树岭国 家实验室和衣阿华州立大学分离和鉴定了稀土元素。 在1944年到50年代中，芝加哥大学和加州大学完成 了超铀元素的分离。
E=
(r nE / E 1) 2 fr e 2 2 2nE /( E 1) 2nE /( E 1) 1
色层分析法简介
色層分析法簡介色層分析法之定義與原理•色層分析( chromatography)簡稱層析。
–係一種分離技術。
–操作過程：利用含混合物之移動相(mobile phase)流經固定相(stationary phase) 。
–分離機制：•混合物中各成分在固定相和移動相之間的分配係數不同(即親和力不同) 。
•各成分移動速率不同，而達到分離之目的。
–化合物與靜相親和力較強，則沖提較慢(即滯留時間長) –化合物與移動相的親和力較強，則沖提較快(即滯留時間短)。
色層分析法之發展•20世紀初，Tswett發現當溶有植物萃取液之石油醚倒於內含碳酸鈣顆粒之玻璃管柱，再加入石油醚使其自然流下時，植物色素被分離而於管柱內呈現不同顏色之色帶。
•氣相層析儀。
•HPLC。
•離子層析、超臨界流體層析S e p a ra tio n o f c o m p o u n d s, a n dF lo wABCD層析分離示意圖層析之原理•t : Retention time滯留時間層析之分類•依兩相之物理性質分類：–氣相層析法(GC)：以氣體為移動相•氣固層析法(GSC) 氣液層析法(GLC)–液相層析法(LC)：以液體為移動相•液固層析法(LSC) 液液層析法(LLC)–超臨界流體層析法(SFC)層析之分類依固定相之使用型式分類：•管柱層析法(Column Chromatography)•平面層析法(Planar Chromatography) 於平面介質上進行分離•濾紙層析法(Paper Chromatography)•薄層層析法(Thin Layer Chromatography )層析之分類依分離原理分類–吸附式層析法–分配式層析法–離子交換式層析法–大小排除層析法–Affinity 層析法層析圖及相關名詞介紹•基線：於正常操條件下，僅有流動相通過檢出器時之訊號曲線。
•層析峰：由管柱流出之成分於通過檢出器時之產生之訊號對時間曲線。
色层分析法之原理与应用讲课教案
2020/6/4
色層分析法之定義與原理
• 色層分析( chromatography)簡稱層析。
– 係一種分離技術。 – 操作過程：利用含混合物之移動相(mobile phase)流經
固定相(stationary phase) 。 – 分離機制：
• 混合物中各成分在固定相和移動相之間的分配係數不同(即親和 力不同) 。
管柱長度
L=NH N=L/H
2020/6/4
解析度 Resolution
Rs=Z/(WA/2+WB/2)
No Image
No Image
2020/6/4
如何增加解析度
增加理論板數(N)：即增加管柱 長度或減小理論板高．
增加選擇因子(分離因子)
No Image
α
1.0 1.001 1.01 1.1 1.5 2.0
(selectivity factor)：在相同操作條件下，成分與參 2020/6考/4 成分調整滯留時間之比。
影響分離效果之因子
• 分配係數(partition coefficient) • 容量因子(capacity factor) • 選擇因子(separation factor) • 柱效率及理論板數 • 解析度(resolution)
• 薄層層析法(Thin Layer Chromatography)
2020/6/4
層析之分類
依分離原理分類
– 吸附式層析法 – 分配式層析法 – 離子交換式層析法 – 大小排除層析法 – Affinity 層析法
2020/6/4
層析圖及相關名詞介紹
hБайду номын сангаас
Wh/2
W
• 基線：於正常操條件下，僅有流動相通過檢出器時之 訊號曲線。
色層分析法之定義與原理
• 色層分析( chromatography)簡稱層析。
– 係一種分離技術。 – 操作過程：利用含混合物之移動相(mobile phase)流經
固定相(stationary phase) 。 – 分離機制：
• 混合物中各成分在固定相和移動相之間的分配係數不同(即親和 力不同) 。
管柱長度
L=NH N=L/H
2020/6/4
解析度 Resolution
Rs=Z/(WA/2+WB/2)
No Image
No Image
2020/6/4
如何增加解析度
增加理論板數(N)：即增加管柱 長度或減小理論板高．
增加選擇因子(分離因子)
No Image
α
1.0 1.001 1.01 1.1 1.5 2.0
(selectivity factor)：在相同操作條件下，成分與參 2020/6考/4 成分調整滯留時間之比。
影響分離效果之因子
• 分配係數(partition coefficient) • 容量因子(capacity factor) • 選擇因子(separation factor) • 柱效率及理論板數 • 解析度(resolution)
• 薄層層析法(Thin Layer Chromatography)
2020/6/4
層析之分類
依分離原理分類
– 吸附式層析法 – 分配式層析法 – 離子交換式層析法 – 大小排除層析法 – Affinity 層析法
2020/6/4
層析圖及相關名詞介紹
hБайду номын сангаас
Wh/2
W
• 基線：於正常操條件下，僅有流動相通過檢出器時之 訊號曲線。
第四章 色层分离法
HETP m1u 考虑u、d对HETP的影响，有下列关系式：HETP ＝mdb1ub2 b2 0.2 ~ 0.6 b1 1.4 ~ 2.0
HETP m2 d
a2
a1
§4.4离子交换色层
§ 4.4.1 分配容量
[ RA] [ A] K [ RB] [ B ]
A B
以 W S 表示色层柱内交换剂的质量，Vm表示流动相 （淋洗剂）的体积
t R2 t R1
,
因 t R t R ，且 与 总是大于1， 与
,
1 k2 1 k1
选择性越高。
越大，柱子的
§4.3 基本理论
§ 4.3.1 平衡塔板理论
（Martin塔板理论） 1.基本假设
实际情况:流动相在色层柱内 不断向下移动时，组分在两相间 发生分配，此时柱内的组分浓度 在两相中的变化是连续的，分配 是不平衡的。
2）α影响
若α＝1两组分不可能分离，略α大于1就可能实现分离，α ＝2分离就相当容易实现。当α＞1，式4－23中（α－1）／α， 可从0.001一直增加到1，变化范围达103，相比之下若k从1增加 到50，k/(1+k)只从0.5变到接近于1，变化范围只有0.5，显然相 对保留值是提高分离度更重要的因素。
1 2
W 4
§ 4.2.3 保留值
保留值反映了溶质与固定相作用力的大小，是 色谱过程热力学特性的重要参数。通常用保留时间 和保留体积表示。 1.比移值
溶质谱带平均迁移速度UX小于流动相迁移速度U，定义 UX与U之比值为比移值Rf.
溶质谱带平均移动速度 UX Rf 溶剂（流动相）的移动速度 U
§ 4.3.2 色层分离理论 1、 分离度（分辨率）
色彩学第4章颜色的混色系统CIE色度学系统表色法
4.1 颜色匹配
4.1.2 三刺激值和色度图
A. 三刺激值
在颜色匹配中，用于颜色混合以产生任意颜色的三种颜色 叫做三原色 。通常加色混色中使用红、绿、蓝三种颜色光为三 原色是为了得到最多的混合色。
颜色匹配实验中，与待匹配色实现颜色匹配时所需要的三 原色的数量，称为三刺激值，记作R、G、B。一种颜色与一组R、 G、B值相对应，R、G、B值相同的颜色，颜色感觉(外貌)必定相 同。
D. 色度坐标和色度图
三原色各自在R+G+B总量中的相对比例叫做色度坐标，用 符号r，g，b来表示。
色度坐标与三刺激值的关系如下：
r=R/(R+G+B) g=G/(R+G+B)
b=B/(R+G+B)=1-r-g 以色度坐标r，g表示的平面 图称为色度图。又称为麦克 斯韦三角形。
4.1 颜色匹配
第四章 颜色的混色系统
4.2 CIE标准色度系统
4.2 CIE标准色度系统
为了统一计算颜色的方法和数值，现代色度学采用CIE所规 定的一系列颜色测量原理、条件、数据和计算方法，称为CIE标 准色度系统。这一色度系统以两组基本颜色视觉实验数据为基础：
•CIE1931标准色度观察者光谱三刺激值
1°-4°视场
•CIE1964补充标准色度观察者光谱三刺激值 10°视场左右
16、我总是站在顾客的角度看待即将推出的产品或服务，因为我就是顾客。2021年10月10日星期日5时36分22秒05:36:2210 October 2021
17、当有机会获利时，千万不要畏缩不前。当你对一笔交易有把握时，给对方致命一击，即做对还不够，要尽可能多地获取。上午5时36分22秒上午5时36分05:36:2221.10.10
分离分析
色层分析法的简介及应用摘要：本文简要介绍了色层分析法的定义、原理、分类及其在生物和医学制药方面的应用；并简要介绍了色层分析法的发展前景。
关键词：色层分析法；生物；医学制药；发展前景1.色层分析法的定义色谱法（chromatography）又称“色谱分析”、“色谱分析法”、“层析法”，是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学、生物化学等领域有着非常广泛的应用。
色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。
2.色层分析法的机理色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。
3.色层分析法的分类3.1按两相状态气相色谱法可分为气固色谱法和气液色谱法，液相色谱法可分为液固色谱法和液液色谱法3.2按固定相的装填方式不同分类利用滤纸作为固定相的层析分离可分为薄层层析和柱层析。
薄层层析是固定相在玻璃板、铝膜等支持物上铺成薄层的分离分析；柱层析是固定相装填在管中成柱形，在柱中形成进行的层析分离。
3.3按分离的原理不同分类根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。
4.吸附色谱吸附层析是用吸附剂作固定相，利用被分析组分对吸附剂表面吸附能力的不同和在流动相中溶解度的差异来进行分离分析的方法。
常见的吸附剂有活性炭，氧化铝，硅胶、氧化镁、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉和糖等。
吸附剂要有高选择性以实现很好的分离，高容量以减少吸附剂的使用量，对于快速吸附具有很好的传递性，具有化学和热稳定性，在流动相中不溶解以保持吸附的特性，具有一定的机械强度和惰性，以防止破坏和腐蚀；易于充填或铺层、抗污染性强，价格便宜。
吸附剂在使用前要先过筛，除去大颗粒；或使用悬浮法，除去细小颗粒，要用酸、碱浸泡，再用沸水煮，清水洗，最后用有机溶剂如甲醇处理，得到几无杂质，颗粒又均匀的吸附剂！吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。
第四章色层分析法1
11
吸附等温线：在一定温度下，某种组分在吸附
剂表面达平衡状态时在两相中浓度的相对关系 曲线。
吸附等温线的斜率KD表示分配系数，Cs表示 溶质在固定相中的浓度，Cm表示溶质在流动相 中的浓度达到平衡时在固定相中的浓度
2020/1/5
12
线形的吸附等温线 非线形的吸附等温线
2020/1/5
13
2．吸附剂的选择
高选择性以实现很好分离； 高容量以减少吸附剂的使用量； 对于快速吸剂具有很好的动力学和传递特性； 具有化学和热稳定性，在流动相中不溶解以保持吸附剂特性； 具有一定的机械强度和惰性，防止破碎和腐蚀； 易于充填或铺层； 不会与欲分离试样和流动剂发生化学反应； 抗污染性强； 价格便宜。
2020/1/5
（adsorption chromatography）
1.原理
2.吸附剂的类型及其选择
3.流动相及其选择
2020/1/5
8
吸附
指在固体或液体内部或表面的选择性传递。 被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。
2020/1/5
图15.1
9
吸附层析
混合物随流动相通过由吸附剂组成的 固定相时在固定相和流动相作用下发生 吸附、脱附、再吸附、再脱附的反复过 程。
2020/1/5
21
活度级别
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ
2020/1/5
Al2O3 ０ ３ ６
１０ １５
含水量（%）
硅胶 ０ ５
１５ ２５ ３８
22
（3）羟基磷灰石
化学式[Ca5(PO4)3OH]2，简称HA。 国外的Bio－Rad公司生产的HA有三种规格，分 别适用于不同条件。由于HA的吸附容量高，稳 定性好（在T<85℃，PH5.5~10.0均可使用）。 HA的Ca2＋基团和生物表面的负电荷基团的相 互反应，在用HA分离生物分子过程中起着重要 的作用。HA的PO43-基团与生物分子表面的阳 电荷基团的相互反应，起着次要的作用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
类型 吸附层析
原理
吸附力，疏水力和静 电力
固定相 硅胶Al2O3 、活性炭、羟基
磷灰石
常用操作方式 柱层析、薄层层析
分配层析
分配系数、溶解度
硅胶、纤维素、滤纸、硅藻 纸层析、柱层析、
土
薄层层析
亲和层析
生物分子亲和力
带配基的琼脂糖、葡萄糖以
及硅胶等
薄层层析、柱层析
凝胶层析 离子交换层析
排阻效应 离子间作用力
吸附等温线：在一定温度下，某种组分在吸附
剂表面达平衡状态时在两相中浓度的相对关系 曲线。
吸附等温线的斜率KD表示分配系数，Cs表示 溶质在固定相中的浓度，Cm表示溶质在流动相 中的浓度达到平衡时在固定相中的浓度
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 12 页
线形的吸附等温线 非线形的吸附等温线
抗污染性强；
价格便宜。
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 14 页
吸附剂的多孔结构，粒度和粒子形状是影响色 层系统特性的基本因素。
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 15 页
几种常用的固体吸附剂
吸附剂
特性大
孔径dp Å
硅胶 亲水无定形 40-80
Al2O3 亲水无定形
聚合物
----
20-80 -----
常用的吸附剂有Al2O3，硅胶， 羟基磷灰石，聚酰胺等。
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 18 页
（1）硅胶
硅胶是由聚硅酸脱水制得的颗粒状吸附剂
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 19 页
活化：在１０５～１１０℃加热３０min活化 不同形式（H/G/F） 粘合剂（煅石膏：牢度差，不能用于分离无机 物；羧甲基纤维素：牢度好，不能用腐蚀性显 色剂；淀粉：不能用于分离有机物）
指在固体或液体内部或表面的选择性传递。 被吸附的物质称为溶质，固体材料称为吸附剂。
2020年7月29日星期三
图15.1
色层分析法 第 9 页
吸附层析
混合物随流动相通过由吸附剂组成的 固定相时在固定相和流动相作用下发生 吸附、脱附、再吸附、再脱附的反复过 程。
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 10 页
1944年, 纸层析。 50年代开始, 出现了气相层析、液相层析、高
效液相层析、薄层层析、离子交换层析、凝胶 层析、亲和层析等,层析法和其它技术的联用。
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 3 页
茨维特的实验
石油醚
碳酸钙
色层分析法是由流动相，带着被分离的 物质流经固定相，在移动过程中，各种 溶质受到固定相不同程度的作用，从而 使试样中的各种组分分离。
硅胶具有微酸性，可用于分离酸性和中性物质， 如有机酸、氨基酸、甾体激素、类脂，萜类及 色素等物质，硅胶用量一般是样品量的
３０～３６倍。
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 20 页
（2）氧化铝
Al2O3是由Al(OH)３脱水制得，Al2O3表面存在铝羟基Al－ＯＨ， 由于羟基的Ｈ键作用而能吸附其它物质。
1．原理
吸附层析是通过样品在固定相和流动相之间的 吸附、脱附作用而实现分离的，这种吸附作用 是一种物理吸附，通常是单分子层或双分子层 或多分子层。
包括几种作用力，被分离样品与吸附剂之间相 反电荷基团与基团之间的静电引力，氢键、偶 极分子之间定向力及范德华力等。
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 11 页
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 5 页
按固定相的装填方式分类
柱层析：固定相装填在管中成柱形，在 柱中进行的层析分离；
纸层析：利用滤纸作为固定相的层析分 离；
薄层层析：固定相在玻璃板、铝膜等支 持物上铺成薄层的层析分离。
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 6 页
根据分离的原理分类
附过程中，离子与偶极、偶极与偶极的相互作 用起主导作用。
非极性吸附剂如活性碳，硅胶等，吸附作用主
要是色散力作用的结果。
影响吸附剂性质因素：化学结构、吸附剂的溶
剂化作用以及吸附剂的预处理、吸附剂的物理 状态
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 17 页
在选择吸附剂时，一般是根据吸附剂和被吸附 物质理化性质进行的。极性强的吸附剂易吸附 极性强的物质、非极性的吸附剂易吸附非极性 的物质。但是为了便于解吸附，分离弱极性的 组分选用极性强的吸附剂，分离极性较强的组 分应选用极性小的吸附剂。
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 13 页
2．吸附剂的选择
高选择性以实现很好分离；
高容量以减少吸附剂的使用量；
对于快速吸剂具有很好的动力学和传递特性；
具有化学和热稳定性，在流动相中不溶解以保持吸附剂特性；
具有一定的机械强度和惰性，防止破碎和腐蚀；
易于充填或铺层；
不会与欲分离试样和流动剂发生化学反应；
交联葡聚糖、琼脂糖
树脂、离子型纤维素、葡聚 糖等离子交换剂
柱层析 柱层析、薄层层析
2ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ20年7月29日星期三
色层分析法 第 7 页
一．吸附层析
（adsorption chromatography）
1.原理
2.吸附剂的类型及其选择
3.流动相及其选择
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 8 页
吸附
表面积Sg m2/g
300-500 100-350 80-700
颗粒密度ρp g/cm
1．09 1．25 ----
25oC,4.6mmHg 下吸附水能力
wt%(干重) 11
7
----
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 16 页
活化
吸附剂一般可分为极性和非极性两类。
极性吸附剂包括氧化物、氢氧化物和盐，在吸
第三章 色层分析法
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 1 页
色层分析法提纲
吸附层析 分配层析 亲和层析 凝胶层析 实验技术
2020年7月29日星期三
色层分析法 第 2 页
●概述
色层分析法最早始于1900年。
1931年,R.Kuhn 等人分离复杂的有机混合物
1941年, 分配层析概念以及液-液分配层析的塔 板理论。
Ａl2O3可分为中性、酸性、碱性三种。
中性氧化铝适用于醛、酮、酯、内酯化合物及某些苷的分离； 酸性氧化铝适用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸， 以及对酸稳定的中性物质的分离； 碱 性Ａl2O3适用于分离碱性化合物如生物碱、醇以及其它中 性和碱性物质。 一般讲，能用酸性或碱性氧化铝分离的物质 也可 用中性的氧化铝分离。 一般Ａl2O3用量为样品量的5～２０倍。