第五章 酶学诊断

L丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶
三磷酸腺苷：肌酸转磷酸酶 甘油三酯酰基水解酶 酰基胆碱酰基水解酶 正磷酸单酯磷酸水解酶 正磷酸单酯磷酸水解酶 5‘-核糖核苷酸磷酸水解酶 1,4- -糖苷糖苷水解酶
二、同工酶及亚型的测定
（一）同工酶的概念与特征 同工酶（isoenzyme）是催化相同的化学反 应，而酶蛋白的分子结构、理化性质和免 疫性能都存在差异的一组酶。 1959年Markert首次用电泳分离法发现动物 的乳酸脱氢酶具有多种分子形式，并将其称 为同工酶。
酶促反应进程曲线表明，只有初速度才能真正 代表酶活性，一般要求初速度达到最大速度的 90%～95%、底物消耗率为1%～5%。这样既可以近似 地表示酶活性，又不致于使底物浓度过高而造成浪 费。
5.鉴定酶的种类
Km值是酶的特征常数，在反应条件一定时，只 与酶的种类和底物的性质有关，与酶的浓度无关。 不同种类的酶其Km值不同，对于一种未知的酶，可 在规定的条件下测定其Km值加以鉴定。
ALT ALTs、 ALTm
AST ASTs、 ASTm
心肌梗死、肝病
心肌梗死、肝病
检测同工酶及其亚型的临床意义☆ 1.测定某一种或几种酶诊断疾病 2.组织分布、细胞内定位、发生发育方面 都可能有所差异，可增加诊断的特异性. 例：CK，大量存在于三种肌肉组织中，单 独总CK升高很难判断；骨骼肌CK-MM，平滑 肌CK-BB，心肌CK-MB*。
（二）同工酶的分类与命名 按基因分类法： 单基因决定的同工酶、等 位基因同工酶、多基因决定的同工酶和修饰 的同工酶。 常用的分类方法是按组织来源分类。
同工酶不仅存在于同一个个体的不同组织中， 甚至同一组织、同一细胞的不同亚细胞结构 中。
人体重要的同工酶 酶
CK LD
同工酶种类
CK-BB CK-MB CK-MM
【酶促反应动力学】
概念
研究各种因素对酶促反应速度影响的学科--酶促反应动力学。
酶促反应速度：用单位时间内底物的消耗量 或产物的生成量表示
V=Vmax[S]/Km+[S]
米-曼氏方程（michaelis menten equation)
【Km】 Km的定义
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
丙氨酸氨基转移酶
肌酸激酶 脂肪酶 胆碱酯酶 碱性磷酸酶 酸性磷酸酶 5‘-核苷酸酶 -淀粉酶
ALT
CK LPS(LIP) ChE ALP(AKP) ACP 5-‘NT AMY(AMS)
2.6.1.2
2.7.3.2 3.1.1.3 3.1.1.8 3.1.3.1 3.1.3.2 3.1.3.5 3.2.1.1
第五章 诊断酶学
Diagnostic Enzymology
目的： 学习并掌握血清酶的基本知识及其在 临床检验诊断中的应用。 学习内容：
第一节 概述 第二节 酶测定技术 第三节 常用酶及同工酶测定的临床应用
第一节
概
述
与酶催化反应有关的名词
酶促反应：酶催化的反应； 酶活性(activity)：酶催化反应的能力； 底物(substrate，S)：酶所作用的物质； 产物(product，P)：酶促反应的生成物； 酶的激活剂(activator）：加速酶促反应 的物质； 酶的抑制剂(inhibitor ）：减慢或终止酶 促反应的物质
2.选择酶的最适底物 Km值取决于酶的种类和底物的性质，在酶一定时， 不同底物有不同的Km值, Km值最小的底物为酶的最适 底物。 酶活力测定时，应优先选择酶的最适底物，使酶 促反应容易进行，并节省底物用量。
3.计算不同底物浓度时酶促反应速度和相当于最 大反应速度的比率 根据米-曼氏方程可以计算 4.设计适宜的底物浓度，可通过米-曼氏方程 来推算工具酶的用量。
固相酶和离子敏感型电极组成的生物传感器，可用 于测定由酶催化的反应底物
（三）代谢物浓度的酶法测定技术
1.终点法
直接法 酶偶联法
2.动力学法
第二节 酶活性浓度的测定技术
一、酶活性测定
根据测定方法分类： 量气法、分光光度法（最常用）、荧光 法、放射核素法、电极法和其它方法。 根据对酶促反应时间的选择不同分类： 定时法 连续监测法
1. 选合适的底物、辅因子、活化剂、变构剂的 种类和浓度。 2. 指示酶和辅助酶的种类和浓度。 3. 反应混合液的最适pH，缓冲液种类和浓度。 其它影响酶活性的因素，如去除各种抑制剂。 4. 在某些情况下，为了获得更好的测定重复性 或更大的临床价值，可考虑对上述“最适条 件”作适度的修改。
(三) 酶的命名 1. 习惯命名法：根据酶所催化的底物、反应 的性质以及酶的来源等进行命名。 2. 系统命名法：规定每一种酶均有一个系统 名称，它标明酶的底物与反应性质，底物 之间以“：”分隔开。 3. 应用：为应用方便，对每一个酶同时推荐 一个习惯命名。
活性中心以外 的必需基团
底物
催化基团
结合基团
活性中心
目录
酶的功能及其特性
功能： 对生物体内的化学反应起催化作用。 酶催化作用的特性： 高度催化效率、高度特异性及高度可调
节性。
（二）酶的催化作用机制
酶底物复合物
E+S
ES
E+P
*诱导契合假说(induced-fit hypothesis) 酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、 相互变形和相互适应，进而相互结合。这一过 程称为酶-底物结合的诱导契合假说 。
-谷氨酰转移酶
糖原磷酸化酶 谷胱甘肽转移酶 门冬氨酸氨基转移酶
-GT/GGT/GGTP
GP GST AST
2.3.2.2
2.4.1.1 2.5.1.18 2.6.1.1
-谷氨酰肽：氨基酸-谷氨酰转移酶
1,4--D葡聚糖：磷酸-D-葡萄糖基转移酶 RX:谷胱甘肽R-转移酶 L(天)门冬氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶
(四) 酶的分类与编号 氧化还原酶类（oxidoreductases） 转移酶类（transfereases） 水解酶类（hydrolases） 裂解酶类（lyases） 异构酶类（isomerases） 合成酶类（synthetase）
临床常用酶的名称与编号
习惯用名 乳酸脱氢酶 异柠檬酸脱氢酶 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 谷氨酸脱氢酶 单胺氧化酶 英文缩写 LD(LDH) ICD(ICDH) G6PD(G6PDH) GLD(GLDH) MAO EC 编号 1.1.1.27 1.1.1.42 1.1.1.49 1.4..1.3 1.4.3.4 系统名 L乳酸：NAD+氧化还原酶 异柠檬酸:NADP+氧化还原酶 葡萄糖-6-磷酸：NADP+氧化还原酶 L谷氨酸： NAD+氧化还原酶 单胺： 氧化还原酶
优点:
能动态观测酶促反应进程，可以明显地找到反
应的线性期，结果准确可靠，标本和试剂用量少，
可在较短时间内完成测定。
缺点： 要求高，要求能够精确地控制温度、pH值和底
物浓度等反应条件，要求仪器具有恒温装臵及自动
监测功能，半自动及自动生化分析仪都能达到这些
要求。
直接连续监测法： 特点： 使用各种分析手段，在不停止酶反应 条件下直接测反应体系中底物或产物的变 化，从而计算出酶活性浓度。 应用最多的方法为分光光度法。 应用最广的反应系统 • NAD(P)H，可以测定大部分的脱氢酶， • 色素原底物，其本身为无色或微黄色，。

酶活性浓度测定就是要使酶促反应的初速度 (v)达到最大速度Vmax，即在过量底物存在 下的零级反应期的速度。
【酶促反应的影响因素和反应条件的选择】
影响酶促反应的因素： –酶浓度 –底物浓度 –pH –温度 –电解质 –辅酶 –激活剂 –抑制剂
酶促反应的最适条件：
我国检验学会文件提出的最适条件为
脱氢酶系统
利用氧化-还原酶反应使其连接到NAD(P)NAD(P)H的正/逆反应后，通过分光光度法或其他方 法直接测定NAD(P)H的变化量。
（二）酶循环法 （enzymatic cycling methods）
是采用两种工具酶进行的循环反映，使被检物信 号放大扩增，从而提高检测灵敏度的酶学方法， 可用于检测微量的标本
(一)酶的组成、结构与功能

组成 单纯酶(simple enzyme)： 仅由氨基酸残基构成的酶 结合酶（conjugated enzyme)： 由蛋白质部分和非蛋白质部分（辅 助因子）构成的酶。
结构
*单体酶：
具有一、二、三级结构
*寡聚酶： 具有一、二、三、四级结构 每一种酶分子内具有与催化功能密切相关的空间结 构区域---活性中心（active center）
酶循环法测定血总胆汁酸
•固相酶（immobilized enzymes）
固相酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之 成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。 物理法：吸附法、包埋法 化学法：共价偶联法、交联法
优点:仍具高效催化性和高度专一性；提高了酶对 酸碱和温度改变的承受能力；反应后易与反应产物 分离
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度 相当于最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的 特征常数，具有重要的应用价值。 大多数酶Km在10-6~10-2mmol/L之间
Km值的应用
1.反映酶与底物的亲合力 Km值越大，酶与底物亲合力越小， Km值越小，酶与底物亲合力越大。
（一）定时法
定义：测定酶促反应开始后一段时间内底物的减 少量或产物的增加量。
特点：
优点是简单。 缺点是难以确定反应时间段酶促反应是否处于线 性期。
注意：固定时间法时间段的预定不宜太长，一般 以30～60分钟为宜。
（二）连续监测法 定义：测定底物或产物随时间的变化量， 又称为速率法。 原理： 该方法每隔一定时间（10s～60s）测定 一次底物或产物的变化量，连续测定多点， 然后将测定结果对时间作图，绘制反应速度 曲线。