检测锌离子的荧光探针

检测锌离子的荧光探针

姓名：徐英学号：51007008 专业：应用化学

摘要：锌是人体必需的微量元素之一，是维持机体正常生长发育、新陈代谢的重要物质。锌的过量与不足都会导致人体代谢异常，产生疾病，因此，Zn2+含量的测定在临床、医药、食品、环境监测及科研中都有极其重要的意义。本文简要综述了测定细胞内游离锌离子荧光探针物质的化学规律、性质和优缺点。

关键词：Zn2+、荧光探针、定量检测

1、前言

在自然界元素的丰度顺序中，锌排在第25位，在地壳中的平均含量波动于0.004-0.02%之间。锌是位于元素周期表第II副族的过渡金属元素，具有3d104s2的价电子结构，通常只失去s电子而成+2氧化态。Zn2+的原子半径较小，且因其带两个正电荷，所以它对电子的亲和力很高，是一个强的质子受体[1]。

1940 年Eggleton首先提出人类需要锌[2]。Prasad和Sandstead 等研究明确了锌是人类必需的微量元素[3]。Zn2+是人体内第二富集的过渡金属，广泛分布于人体内部。

据研究表明，锌在许多生理、生化过程中发挥着极为重要的作用，例如:锌离子是组成三百多种生物酶活性催化中心的重要金属离子之一；它可作为金属蛋白酶的结构因子或转录因子；可以和许多调控酶相互作用，作为第二信使触发或阻断诸如细胞凋亡等重要生理过程；具有调控大量离子通道的能力，参与神经传导的过程；同时，锌离子在中枢神经系统（CNS）中还扮演着非常重要的角色。新近研究还表明，锌离子的浓度大小与多种疾病的发生紧密相关[4]。

缺锌对机体有重要影响: 一是对生长发育和组织再生的影响；二是对性器官和性功能的影响；三是锌依赖酶(含锌酶)的活性降低；四是缺锌可使胰岛素降解加剧，引起血中胰岛素水平下降及对葡萄糖利用率减少，葡萄糖耐量下降；五是缺锌可引起血液内视黄醇结合蛋白的浓度降低，影响组织对维生素A 的利用，使人的暗适应能力下降，还有对皮肤及味觉等的影响[5]。虽然缺锌给人体带来了极大的伤害，但是人体内锌含量的超标也会造成同样大的伤害，如：补锌过量会使人的免疫力下降；可诱发人体的铜缺乏；过量补锌可降低机体内血液、肾和肝内的铁含量，出现小细胞低色素性贫血，红细胞生存期缩短，肝脏及心脏中超氧化物歧化酶等酶活性下降 (6)

因此，若能实时跟踪、监测生物体中的锌离子，就有可能使人们在细胞层次或者组织层次上进行锌离子的生理、生化行为的研究。这对揭开生物体系中锌离子与生物体内许多重要生理、生化功能之间的关系之谜具有极其重要的科学价值。

自1987年第一个锌离子荧光探针(TsQ)诞生以来，陆续研制开发了几种锌离子荧光探针，如Zinquin，Zinpyr-l，ACF-l，ACF-2，NewportGreen等。人类利用这种方便快捷的方式检测Zn2+，为研究生物体内Zn2+的功能和性质以及它的结合方式，探索锌在生物体中的作用做出了卓越的贡献[7]。但在测定生物活体内的游离Zn2+的浓度方面仍存在一定的困难。

2、荧光离子探针识别机理及影响因素

在锌离子的荧光检测中，最关键的是荧光选择性配体的设计。目前报道的荧光选择性配体的基本结构可分为:荧光发色团—间质—识别基团三部分(如图1所示) [4]，其设计大多基于光致电荷迁移(PCT)和电子迁移(PET)两种荧光机理。也有将两种机理结合起来设计的荧光配体。但无论基于何种机理，荧光配体中的荧光发色团和识别基团的选择均极为重要。

图1荧光选择性配体及其对离子识别的工作原理示意图荧光发色团是构成荧光离子探针的最基本单元，其主要功能是实现识别信息到荧光信号的转换。一般说来，一切具有荧光信号的有机基团都可以作为离子探针的荧光发色团。常用的荧光发色团有以萘，蒽和芘等为主要代表的稠环芳烃类；丹酰基团；以荧光素和罗丹明为代表的呫吨类荧光基团；氟硼二吡咯类；香豆素；1，8-萘酰亚胺等荧光基团(如图2所示) [1]。

图2常用的荧光发色团

间质的作用是将荧光发色团和识别基团连接起来，使之成为一个完整的体系。它以多种形式存在，在很多类型的探针中，起到调节的作用。但是，我们应该知道并非所有的探针都具有间质，一些基于分子内电荷转移机理的探针就没有间质存在[8]。识别基团主要功能在于识别和结合客体，识别基团是荧光离子探针设计中的重中之重，他选择决定了探针分子的选择性和效率。

荧光离子探针的识别性能评价主要受选择性、灵敏性、水溶性、实时性和原位检测性能这五种因素的影响[1]。

选择性主要是指探针分子和识别目标的作用区别于其它因素的情况；灵敏度主要是指探针分子对检测产物的最低检测程度，是灵敏性的表现形式；水溶性是探针分子应用价值的重要基础；实时性主要是指探针分子对检测物的响应速度。响应速度越快说明探针分子的实用性越高，越有利于在实际生活和生产之中应用；原位检测性能则取决于探针分子同被检测体系之间的相容性。相容性越好，则原位检测性能越好。其实在一定限度内，仪器对荧光探针检测的空间分辨率有着重要影响。

3、锌离子荧光探针作用机理

人们先后研究和建立了多种方法用以检测锌离子，如分光光度法，荧光探针法，电离质谱法和核磁共振法等。但是，生物体中的锌大多以络合形式存在分子内和分子间的游离Zn2 +的浓度很低。近年来，人们已经了解到Zn2 + 的几种传输器的结构、功能以及它的传输形式，但Zn2 + 的吸收、传输、分配及其与蛋白质结合的控制因素还须进一步解释。而进一步

了解锌的作用的关键是在一个比较宽的浓度范围内在细胞内和细胞外定量检测锌的流量和水平[10]。

荧光探针法是对锌离子进行定性、定量分析的重要方法，它不仅简便实用，而且在灵敏度、选择性、时间分辨等方面均有突出的优点，所应用的探针应具备以下基本条件：(1) 稳定性高；(2) 对Zn2 + 有高选择性，不受或很少受其它金属离子的干扰；(3) 与Zn2 + 有络合性；(4) 能够快速感光；(5) 容易快速传递到目标体系；(6) 具有实用性。当然，应用在生物体系中还应该有合适的荧光信号性质：( 1) 强荧光；( 2) 激发波长超过340nm(能穿过玻璃显微镜的目镜并能把由于紫外光对细胞造成的伤害减少到最小)；(3) 与金属离子络合后其发射波长比络合前有> 80nm 的斯托克位移，可消除激发光对荧光测定的干扰等[9]。

目前报道的生物应用锌离子荧光探针按作用机理可分为以下几类：

(1)基于光诱导电子转移(Photoinduced ElectronTransfer PET)的荧光探针；

(2)基于分子内共轭电荷转移(Intramolecular Charge Transfer ICT)的荧光探针；

(3)基于荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET)的荧光探针；

(4)基于鳌合诱导荧光增强的荧光探针；

(5)化学反应类；

(6) C=N异构化机理。

下面我将对以上的六个作用机理用举例的方式进行描述。

3.1基于光诱导电子转移机理的荧光探针

光诱导电子转移是指发光体(电子给体或受体) 受到光激发后，与接受体(电子给体或受体) 之间的电子转移反应。这种电子转移反应导致发光体的荧光淬灭，但当接受体接受了阳离子后，使接受体丧失了提供或接受电子的能力，从而使发光体的荧光恢复。在这类探针中，荧光团一般作为电子受体，而阳离子接受体(例如:氨基) 作为电子给体[11]。其作用机理如图3所示：

图3基于PET原理的荧光化学传感器模型

6-甲氧基-8-对甲苯磺酰胺喹啉(TSQ，1)是第一例用于大脑、心脏及其它组织切片中Zn2 +浓度检测的荧光探针。TSQ虽然可用于在生理条件下较高浓度的Ca2 +和Mg2 +存在时Zn2 +的检测，但TSQ-Zn2 +络合物的结构和稳定常数尚不清楚，TSQ/ Zn2 +可能以1∶1 或2∶1 的形式络合，并且荧光强度在不同的介质中变化较大，所以用TSQ进行定量分析Zn2 + 还有待于进一步研究[10]，另外它的水溶性不好，不适合在活组织中对锌进行测定和成像。为进一步了解TSQ类荧光探针的化学结构，OHalloran小组研究了2-甲基-6-甲氧基-8-对甲苯磺酰胺喹啉(2)。结果表明，在中性DMSO/水(50/50)的混合溶液中，2- Zn2 +的络合形式主要是2:1。其中，脱质子的酰亚胺的氮原子及喹啉环上的氮原子与Zn2 +配位[4]。