生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点-生物质谱分析蛋白质磷酸化位(2021整理)
应用生物质谱分析蛋白质磷酸化位点工程完成人员：王红霞李卫华李爱玲刘炳玉工程完成单位：军事医学科学院国家生物医学分析中心摘要蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于说明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一。
我们用天然磷酸化蛋白建立了中性丧失扫描和固相金属亲和色谱〔IMAC〕两种基于质谱的磷酸化蛋白分析方法。
应用这两种方法均可将从蛋白质酶切混合物中找出磷酸化肽段，进而通过序列分析定位磷酸化位点。
两种方法具有不同的特点及局限性，具体研究中还要视具体情况优化实验条件。
蛋白质可逆磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白质翻译后修饰〔PTM〕。
在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
细胞内蛋白质的磷酸化在信号传导中发挥着非常重要的作用。
蛋白质组研究的一个重要方面就是蛋白质磷酸化修饰的分析鉴定。
目前没有一个自动测序方法能够对三种主要的磷酸化氨基酸，即磷酸化丝氨基酸〔pSer〕、磷酸化苏氨基酸〔pThr〕和磷酸化酪氨酸〔pTyr〕。
毛细管电泳〔CE〕可以分析蛋白质或多肽的磷酸化及磷酸化氨基酸，但是鉴定蛋白质磷酸化位点首先要用高效液相色谱〔HPLC〕别离蛋白的酶解肽段，然后用CE筛测磷酸化肽，最后用自动Edman降解氨基酸分析法确定其磷酸化位点，工作量大，不是快速和高通量分析方法。
生物质谱〔MS〕是揭示蛋白质许多翻译后修饰和蛋白质一级结构分析的一个不可缺少的工具，所用的蛋白质样品量在fmol水平。
是唯一能够与蛋白质组研究水平相匹配的方法。
近年来，生物质谱的开展显著地促进了对具有生物学功能的磷酸化蛋白质的研究，是国际上当前最重要的一个前沿领域，也是目前蛋白质组研究的一个重要方面。
这种方法的成功建立，将使人们对磷酸化蛋白质的研究跨上一个新的台阶，对功能性蛋白的寻找和作用机制探寻具有重要意义，在国内具有广泛的需求。
质谱检测磷酸化位点
质谱检测磷酸化位点质谱检测磷酸化位点磷酸化是一种常见的细胞信号传递方式，它涉及到许多生物体内的重要功能和代谢过程。
磷酸化通常是通过酶催化的过程来完成的，这种过程可以在细胞中发挥重要的作用，从而调节许多细胞生理和生化过程。
质谱技术作为一种能够非常准确地检测生物大分子结构和化学修饰的方法，已经被广泛应用于检测蛋白质分子的磷酸化位点。
磷酸化已经被证明对许多重要的生理过程发挥着至关重要的作用，如代谢、信号传导，细胞增殖、分化和凋亡等。
许多的细胞机制都是通过磷酸化来实现的。
因此，检测磷酸化位点以及分子机制的研究对于理解细胞信号通路和代谢途径的调节至关重要。
质谱技术作为一种高灵敏度的分析方法，已经被广泛应用于蛋白质磷酸化的研究。
这种方法非常适合于检测蛋白质上的磷酸化修饰位置，因为它不仅可以检测蛋白质的质量，而且还可以同时检测其修饰位置。
这种方法具有高灵敏度、高分辨率和高通量的优势，因此适用于大规模的磷酸化位点的筛选和鉴定研究。
在质谱技术中，主要使用质谱分析仪来研究蛋白质和修饰分子的化学和物理特性。
利用电喷雾质谱仪（ESI-MS）或是基质辅助激光解吸/离子化质谱仪（MALDI-TOF-MS）等质谱分析仪器，可以得到蛋白质的质量信息以及化学修饰信息。
在目前的研究中，一些研究者还将质谱技术与低温离子化电离质谱（LTQ-Orbitrap）和离子诱导解离/碎片化（CID/ETD）等技术相结合，以完成更加高效的磷酸化位点的筛选和鉴定。
除了质谱技术，生物芯片技术也被广泛用于磷酸化位点的检测。
例如，磷酸化特异性抗体数组可以用于研究酶促磷酸化事件，这种方法可以直接检测磷酸化的靶蛋白和磷酸化位点。
然而，与质谱技术相比，磷酸化特异性抗体的基础更为狭窄，这种方法受到抗体选择和特异性的限制比较大。
在磷酸化位点研究的应用中，目前的研究主要集中在三类蛋白质：激酶、转录因子和膜蛋白质。
这些蛋白质在生理和病理中发挥着至关重要的作用。
因此，发现和鉴定它们特定的磷酸化位点对于了解这些重要分子的功能非常重要。
磷酸化质谱
磷酸化质谱
磷酸化质谱是一种用于研究蛋白质磷酸化的分析方法。
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰，它能够调节蛋白质的功能、定位和相互作用。
磷酸化质谱通过将蛋白质酶切成小片段，然后用质谱仪分析这些片段中的磷酸化位点，从而确定蛋白质的磷酸化模式和位置。
磷酸化质谱的过程包括样品制备、酶解、富集和质谱分析。
首先，样品需要经过预处理，包括去除污染物和离子对样品的影响等。
然后，样品被酶解成小片段，通常是通过胰蛋白酶消化。
接下来，磷酸化位点需要被富集，通常是通过亲和层析法或磷酸化特异性抗体捕获。
最后，富集后的样品被送入质谱仪进行分析，通过检测质量/电荷比和碎片离子的质量，确定蛋白质的磷酸化情况。
磷酸化质谱在蛋白质组学、信号转导和疾病研究等领域具有广泛的应用。
它能够帮助研究人员了解蛋白质的功能、调控机制和相互作用，以及研究疾病发生发展的分子机制。
同时，磷酸化质谱还可以用于新药研发和药物筛选，为药物研发提供重要的分子信息。
总之，磷酸化质谱是一种重要的分析方法，对于研究蛋白质磷酸化和相关生命科学领域具有重要意义。
质谱鉴定磷酸化位点
质谱鉴定磷酸化位点
质谱鉴定磷酸化位点是一种通过质谱技术来鉴定蛋白质分子中磷酸化位点的方法。
磷酸化是一种常见的蛋白质修饰方式，可以影响蛋白质结构和功能。
因此，研究蛋白质中的磷酸化位点对于理解蛋白质的功能调控具有重要意义。
质谱鉴定磷酸化位点一般包括以下步骤：提取蛋白质，酶解蛋白质，富集磷酸化肽段，质谱分析并鉴定磷酸化位点。
其中，富集磷酸化肽段是关键的步骤，常见的富集方法包括亲和层析、钛离子层析和IMAC等。
质谱分析是鉴定磷酸化位点的关键环节。
常用的质谱技术包括MALDI-TOF和ESI-MS等。
通过质谱鉴定磷酸化位点，可以得到蛋白质的磷酸化修饰情况，为后续的蛋白质功能研究提供重要数据。
总之，质谱鉴定磷酸化位点是一种重要的蛋白质研究方法，对于揭示蛋白质功能调控机制有着重要的作用。
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生物质谱分析蛋白质磷酸化位点
磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。
本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。
关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。
蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。
据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。
对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。
真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。
大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。
因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。
虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。
在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。
蛋白质磷酸化检测方法
蛋白质磷酸化检测方法蛋白质磷酸化是一种重要的细胞信号转导过程，对于细胞的生命周期、增殖、分化和凋亡等过程起着关键的调控作用。
因此，研究蛋白质磷酸化具有重要的生物学意义。
本文将介绍蛋白质磷酸化的检测方法。
蛋白质磷酸化是通过将磷酸基团与蛋白质分子中的特定氨基酸残基（通常是丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸）发生酯化反应而实现的。
磷酸化事件的发生可以改变蛋白质的构象、电荷和亲和性，从而调控蛋白质的功能。
因此，准确、高效地检测蛋白质磷酸化状态对于揭示细胞信号转导网络的正常功能和疾病机制具有重要意义。
常用的蛋白质磷酸化检测方法主要包括免疫印迹、质谱分析和磷酸化特异性抗体法。
免疫印迹是一种常用的蛋白质磷酸化检测方法，它利用特异性抗体与目标蛋白质结合，然后通过二抗与特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色方法来检测特定蛋白质的磷酸化状态。
这种方法操作简便、成本低廉，可以检测多个磷酸化位点。
然而，免疫印迹方法受到抗体的特异性和灵敏度的限制，且无法确定磷酸化的具体位点。
质谱分析是一种高度灵敏的蛋白质磷酸化检测方法，它基于质谱仪对蛋白质及其修饰产物的质量和电荷进行精确测量。
质谱分析可以通过直接检测磷酸化肽段的质量来确定蛋白质的磷酸化位点。
这种方法可以同时检测多个磷酸化位点，并且能够鉴定未知的磷酸化位点。
但是，质谱分析方法需要复杂的样品前处理和数据分析，操作技术要求较高，对设备和实验条件也有一定要求。
磷酸化特异性抗体法是一种基于特异性抗体识别磷酸化氨基酸残基的蛋白质磷酸化检测方法。
该方法利用磷酸化特异性抗体与磷酸化蛋白质结合，然后通过二抗与特异性抗体结合，最后通过化学发光或染色方法来检测特定蛋白质的磷酸化状态。
与免疫印迹相比，磷酸化特异性抗体法可以准确地确定磷酸化的位点。
但是，该方法也受到抗体的特异性和灵敏度的限制。
除了上述常用的蛋白质磷酸化检测方法之外，还有一些新兴的技术在蛋白质磷酸化研究中得到了广泛应用。
例如，蛋白质芯片技术可以同时检测上千个蛋白质的磷酸化状态，从而在大规模的磷酸化研究中发挥了重要作用。
磷酸化位点鉴定
磷酸化位点鉴定磷酸化是细胞内一种重要的化学修饰方式，通过磷酸化修饰蛋白质分子，可以调控细胞信号传导、基因转录、蛋白质结构和功能等关键生物过程。
因此，磷酸化位点的准确鉴定对于揭示蛋白质功能和疾病机制具有重要意义。
在过去的几十年里，研究人员通过多种方法对磷酸化位点进行了鉴定。
其中最常用的方法是质谱分析技术。
质谱分析技术基于蛋白质分子的质量和电荷特性，可以准确测定蛋白质中磷酸化位点的位置和数量。
质谱分析技术通常包括前处理、质谱仪测定和数据分析三个步骤。
前处理是质谱分析的第一步，其主要目的是从复杂的蛋白质混合物中提取目标蛋白，去除其他干扰物。
前处理方法包括蛋白质提取、蛋白质消化和磷酸化肽片段富集等。
蛋白质提取是将目标蛋白从细胞或组织中提取出来，常用的方法有细胞裂解、组织切片和血清分离等。
蛋白质消化是将蛋白质分子酶解成肽段，常用的酶有胰蛋白酶和胃蛋白酶等。
磷酸化肽片段富集是通过化学反应或亲和层析等方法富集含磷酸化位点的肽段，以提高其在质谱分析中的检测灵敏度。
质谱仪测定是质谱分析的核心步骤，其主要目的是测定蛋白质和肽段的质量和电荷特性。
常用的质谱仪包括MALDI-TOF、ESI-TOF和Q-TOF等。
MALDI-TOF质谱仪基于基质辅助激光解析电离离子化技术，可以测定蛋白质的分子质量。
ESI-TOF质谱仪基于电喷雾电离技术，可以测定蛋白质和肽段的质量和电荷比。
Q-TOF质谱仪基于四极杆和时间飞行二次质谱仪的结合，具有高分辨率和高灵敏度。
质谱仪测定的结果通常以质谱图的形式呈现，通过质谱图可以确定磷酸化位点的位置和数量。
数据分析是质谱分析的最后一步，其主要目的是从质谱数据中提取有用的信息。
数据分析方法包括数据库搜索、序列比对和谱图解析等。
数据库搜索是将质谱数据与已知蛋白质序列进行比对，以确定磷酸化位点的位置和数量。
序列比对是将质谱数据与已知蛋白质序列进行比对，以确定磷酸化位点的保守性和功能。
谱图解析是将质谱数据与已知谱图进行比对，以确定磷酸化位点的质量和电荷特性。
磷酸化位点的精确定位：质谱技术的实验设计与分析流程
磷酸化位点的精确定位：质谱技术的实验设计与分析流程磷酸化是蛋白质修饰中的一种重要形式，对于调控蛋白质的结构和功能起着关键作用。
质谱技术是一种强大的工具，可以帮助我们精确定位蛋白质中的磷酸化位点。
本文将详细介绍质谱技术在磷酸化位点研究中的实验设计和分析流程，着重强调质谱如何帮助我们发现和验证磷酸化位点。
一、实验设计在磷酸化位点的研究中，实验设计是非常重要的一步。
以下是一些关键的实验设计要点：1.样品准备：样品的选择和制备非常重要。
通常，我们会选择含有磷酸化位点的蛋白质样品，并确保其纯度和完整性。
2.消化酶选择：酶的选择对于磷酸化位点的检测至关重要。
常用的酶包括胰蛋白酶、胰蛋白酶K和胰蛋白酶LysC等。
需要根据样品的特性和磷酸化位点的位置选择适当的酶进行消化。
3.磷酸化酶切：磷酸化位点通常会被特定的磷酸化酶切割，以将磷酸化残基暴露在消化产物中。
这有助于质谱的检测和定位。
二、分析流程质谱分析是磷酸化位点研究的关键步骤。
以下是质谱分析的流程：1.质谱仪的选择：质谱仪的选择取决于实验的需求和目标。
常用的质谱仪包括MALDI-TOF质谱仪、ESI质谱仪和Q-TOF质谱仪等。
2.质谱条件优化：针对磷酸化位点的特性，需要优化质谱条件。
包括碰撞诱导解离（CID）能量、碰撞能量和质谱扫描模式等参数的设定。
3.数据采集与解析：通过质谱仪采集数据，并使用数据分析软件进行解析。
常用的软件包括Mascot、MaxQuant和Skyline等。
通过与数据库比对，可以识别出磷酸化位点，并确认其定位。
三、磷酸化位点的验证磷酸化位点的验证是确保研究结果的可靠性和准确性的关键步骤。
以下是常用的验证方法：1.荧光标记酶切法：可使用磷酸化特异性的酶对样品进行切割，然后使用质谱分析来确认磷酸化位点。
2.磷酸酶处理法：可使用磷酸酶对磷酸化位点进行去磷酸化处理，然后使用质谱分析来验证磷酸化位点。
3.定点突变法：可通过定点突变将磷酸化位点改变为非磷酸化位点，然后使用质谱分析来确认磷酸化位点。
蛋白磷酸化实验方法
蛋白磷酸化实验方法蛋白磷酸化实验方法主要包括以下几种：1. Western blot：这是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，利用SDS-PAGE分离生物样品，随后转移到膜上(通常是PVDF或尼龙膜)，之后利用磷酸化特异的抗体来鉴定目的蛋白。
2. 放射性标记法：先用32P标记ATP，通过细胞代谢标记到磷酸化蛋白质上，再经一维或二维凝胶电泳或色谱法进行分离，最后通过放射自显影进行检测。
3. 免疫印迹法：基于抗体特异性结合抗原的原理，利用抗磷酸化氨基酸抗体与电泳分离得到的磷酸化蛋白质进行免疫印迹反应来检测磷酸化蛋白质。
在实验中，通常将免疫印迹与免疫沉淀结合使用，因为磷酸化蛋白质的含量较低，先利用免疫沉淀法对磷酸化蛋白质进行富集，可以降低非磷酸化蛋白质的干扰。
4. 荧光染色法：利用荧光染料直接对凝胶中结合在酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基上的磷酸进行选择性染色，再通过荧光扫描仪检测就能直接鉴别出磷酸化的蛋白质。
5. 质谱法：首先将含磷酸化修饰的蛋白样品进行酶切，然后对酸化肽段进行富集，再将富集得到的磷酸化肽段进行串联质谱分析，最后利用质谱数据结合生物信息学分析对磷酸化蛋白质进行鉴定。
6. ELISA：ELISA已逐渐成为测定蛋白磷酸化的一种有力方法。
这种微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特异的捕获抗体，与磷酸化状态无关。
随后让目的蛋白结合在抗体包被的分析板中，目的蛋白可以是纯的，也可以是复杂的异质样品(如细胞裂解液)中的一个组分。
加入待分析的磷酸化位点特异的检测抗体。
这些分析通常设计为显色或荧光检测。
产生的信号强度与最初样品中存在的磷酸化蛋白的浓度成正比。
与更为传统的免疫印迹相比，磷酸化特异的ELISA技术具有一些优点。
首先，利用经过校准的标准品，可轻松定量结果。
其次，以三明治形式使用目的蛋白特异的两个抗体，带来了高的特异性。
第三，ELISA的灵敏度更高允许使用更少量样品，检测低丰度的蛋白。
最后，微孔板形式的通量比传统的Western blotting要高得多。
磷酸化蛋白质组学常用分析和定量方法
蛋白质的磷酸化修饰是生物体内重要的共价修饰方式之一。
蛋白质的磷酸化和去磷酸化这一可逆过程几乎调节着包括细胞的增殖、发育、分化、信号转导、细胞凋亡、神经活动、肌肉收缩及肿瘤发生等过程在内的所有生命活动。
目前已知有许多人类疾病是由于某些异常的磷酸化修饰所引起，而有些磷酸化修饰却是某种疾病所导致的后果。
在哺乳动物细胞生命周期中，大约有1/3的蛋白质发生过磷酸化修饰；在脊椎动物基因组中，有5%的基因编码的蛋白质是参与磷酸化和去磷酸化过程的蛋白激酶和磷酸（酯）酶。
磷酸化修饰本身所具有的简单、灵活、可逆的特性以及磷酸基团的供体ATP的易得性，使得磷酸化修饰被真核细胞所选择接受而成为一种最普遍的调控手段。
鉴于磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要意义，探索磷酸化修饰过程的奥秘及其对细胞功能的影响已成为众多生物化学家及蛋白组学家所关心的内容。
用蛋白质组学的理念和分析方法研究蛋白质磷酸化修饰，可以从整体上观察细胞或组织中磷酸化修饰的状态及其变化，这对以某一种或几种激酶及其产物为研究对象的经典分析方法是一个重要的补充，同时提供了一个全新的研究视角，并由此派生出磷酸化蛋白质组学（phosphoproteomics）这一新概念。
在蛋白质组学水平进行磷酸化蛋白质的分析定量研究已引起人们广泛关注，各种技术也相应地发展起来.1.1 免疫亲和色谱富集磷酸化蛋白质最简单的方法就是用识别磷酸化氨基酸残基的特异抗体进行免疫共沉淀，从复杂混合物中免疫沉淀出目标蛋白质。
目前，仅有酪氨酸磷酸化蛋白质的单克隆抗体可以用来进行有效的免疫共沉淀。
这是因为该抗体具有较强的亲和力和特异性，可以有效地免疫沉淀酪氨酸磷酸化的蛋白质。
Imam-Sghiouar等人从B-淋巴细胞中通过免疫沉淀获得酪氨酸磷酸化的蛋白质，然后再用二维电泳分离技术并结合质谱分析方法，鉴定出多个与斯科特综合症相关的酪氨酸磷酸化的蛋白质。
由于抗磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，所以令抗原抗体的结合位点存在空间障碍，特异性较差。
磷酸化蛋白质组如何鉴定
磷酸化蛋白质组如何鉴定磷酸化蛋白质（Phosphorylated protein）是指在特定氨基酸残基上附加了一个磷酸基团（PO4）的蛋白质。
磷酸化是一种重要的蛋白质修饰方式，可以调节蛋白质的结构、功能和相互作用，进而控制细胞的信号转导、代谢和增殖等生物学过程。
因此，鉴定磷酸化蛋白质组对于理解蛋白质调控网络具有重要意义。
本文将介绍几种常用的磷酸化蛋白质组鉴定方法。
一、质谱法质谱法是目前最常用的鉴定磷酸化蛋白质组的方法之一，主要分为两种：质谱分析前磷酸化富集和质谱分析后磷酸化识别。
1.质谱分析前磷酸化富集质谱分析前磷酸化富集主要包括亲和富集、非亲和富集和凝胶富集等。
亲和富集是利用特定亲和剂与磷酸化蛋白质结合，然后用洗脱剂将磷酸化蛋白质洗脱出来进行质谱分析。
常用的亲和剂有磷酸化特异性抗体、磷酸化结合结构域和亲和岛等。
非亲和富集是利用质谱分析前的蛋白质化学改变，如巯基化、新生代谢标记等来增加磷酸化蛋白质的质谱分析信号，进而富集磷酸化蛋白质。
凝胶富集是将细胞提取物先进行电泳分离，然后使用聚焦法将不同等电点区域的蛋白质提取，再进行质谱分析。
2.质谱分析后磷酸化识别质谱分析后磷酸化识别主要通过质谱数据分析软件来鉴定磷酸化位点。
质谱分析常用的方法包括肽段质谱法、质谱配对法和磷酸化肽酶法等。
其中，肽段质谱法是将蛋白质经酶切分解成肽段后进行质谱分析，通过质谱数据分析鉴定磷酸化位点；质谱配对法是对酶切后的肽段进行残基识别和质谱数据匹配，进而确定磷酸化位点；磷酸化肽酶法是酶切肽段后通过特定的肽酶去除非磷酸化肽段，进而富集磷酸化肽段进行质谱分析。
二、免疫化学检测法免疫化学检测法是利用抗体与磷酸化蛋白质特异性结合，并使用标记物进行检测的方法。
常用的免疫化学检测方法有免疫印迹、免疫荧光和免疫组化等。
1.免疫印迹免疫印迹是利用抗体与磷酸化蛋白质特异性结合，然后使用辅助抗体与标记物结合，通过酶学反应或化学发光的方式检测磷酸化蛋白质的存在。
磷酸化位点的预测分析
磷酸化位点的预测分析磷酸化是一种广泛存在于细胞内的共价修饰方式，通过将磷酸基团与蛋白质残基中的氨基酸残基（通常为丝氨酸、蘇氨酸或酪氨酸）结合，可以调控蛋白质的结构、功能和互作。
磷酸化位点的预测分析可以帮助我们理解磷酸化的生物学功能、作用机制以及与疾病的关联。
在本文中，我们将讨论磷酸化位点的预测方法、常见的预测算法以及它们的应用。
基于实验数据的方法包括质谱分析和抗体法。
在质谱分析中，通过质谱仪测定蛋白质样品中磷酸化残基的质量和位置，从而确定磷酸化位点。
这种方法可以提供高通量的磷酸化位点信息，但需要大量的实验时间和资源。
抗体法是通过特异性抗体与磷酸化蛋白结合，然后通过免疫共沉淀或免疫组化等技术方法来检测磷酸化位点。
这种方法对于磷酸化位点的鉴定和定量较为敏感，但仍需要验证和进一步分析。
基于计算机算法的方法是通过分析蛋白质序列和结构特征来预测磷酸化位点。
下面我们将介绍几种常见的预测算法。
1. 序列检索法：利用公开的数据库，如UniProt，与已知磷酸化位点具有相似序列特征的蛋白质。
这种方法基于假设，即具有相似序列的蛋白质可能具有相似的功能和磷酸化位点。
2. 机器学习方法：通过分析已知的磷酸化位点和非磷酸化位点的序列和结构特征，训练模型来预测未知蛋白质序列中的磷酸化位点。
常用的机器学习算法包括支持向量机（SVM）、随机森林（Random Forest）和人工神经网络（Artificial Neural Network）等。
3. 结构基因组学方法：利用蛋白质的三维结构信息，预测磷酸化位点。
这种方法基于假设，即磷酸化位点通常位于蛋白质的一些结构域或域间区域。
常用的结构基因组学方法包括THreader、NetSurfP和Phospho3D等。
这些预测算法往往结合使用，以提高预测的准确性和可靠性。
此外，还有一些综合性的磷酸化位点数据库和在线工具可供使用。
例如，PhosphoSitePlus、Phospho.ELM、PhosphoNet和PhosphoNetX等数据库可以提供已知的磷酸化位点信息，并具有预测功能。
磷酸化蛋白质组学研究的主要内容和方法
磷酸化蛋白质组学研究的主要内容和方法磷酸化蛋白质组学研究是一种重要的生物学研究方法，主要用于揭示蛋白质磷酸化在细胞信号传导和调控中的作用机制。
本文将介绍磷酸化蛋白质组学研究的主要内容和方法。
一、磷酸化蛋白质组学研究的主要内容磷酸化蛋白质组学研究主要包括以下几个方面的内容：1. 磷酸化蛋白质的鉴定：通过质谱技术，对细胞或组织中的蛋白质进行分离、提取和纯化，然后利用质谱仪对蛋白质进行鉴定和定量分析，确定其磷酸化状态和磷酸化位点。
2. 磷酸化蛋白质的功能研究：通过生物信息学分析、蛋白质相互作用网络等方法，研究磷酸化蛋白质在细胞信号传导和调控中的功能和作用机制，揭示磷酸化蛋白质在生物体内的生理和病理过程中的重要作用。
3. 磷酸化蛋白质的动态调控研究：通过时间序列实验和药物刺激等方法，研究磷酸化蛋白质在不同生理和病理条件下的动态调控，分析其变化规律和潜在的调控机制。
二、磷酸化蛋白质组学研究的主要方法磷酸化蛋白质组学研究主要依赖于以下几种方法：1. 蛋白质提取和纯化：通过细胞裂解、离心、蛋白质抽提和纯化等步骤，将目标蛋白质从复杂的生物样品中分离出来，使其具备进一步分析的条件。
2. 质谱分析：利用质谱仪对蛋白质进行分析和鉴定。
常用的质谱技术包括质谱仪联用气相色谱、液相色谱、飞行时间质谱等，可以鉴定蛋白质的氨基酸序列、磷酸化位点等信息。
3. 生物信息学分析：通过计算机分析和比较不同蛋白质的氨基酸序列、结构和功能，预测磷酸化位点和磷酸化蛋白质的功能。
4. 蛋白质相互作用网络分析：通过构建蛋白质相互作用网络，研究磷酸化蛋白质与其他蛋白质的相互作用关系和信号传导通路。
5. 功能验证实验：通过基因敲除、过表达、药物干预等实验手段，验证磷酸化蛋白质的功能和调控机制。
总结起来，磷酸化蛋白质组学研究主要涉及磷酸化蛋白质的鉴定、功能研究和动态调控研究，主要依赖于蛋白质提取和纯化、质谱分析、生物信息学分析、蛋白质相互作用网络分析和功能验证实验等方法。
磷酸化蛋白磷酸化位点确定
磷酸化蛋白磷酸化位点确定
磷酸化蛋白的磷酸化位点确定通常涉及以下几个步骤：
1.样本准备：需要对磷酸化蛋白进行纯化，确保蛋白质尽可能均一。
这是为了
减少后续分析中的干扰物质，提高磷酸化位点检测的准确性。
2.质谱分析：质谱是确定磷酸化位点的重要手段。
通过质谱分析，可以识别出
磷酸化多肽的存在，并进一步根据氨基酸序列确定磷酸化的具体位置。
3.Western Blot：Western blot是一种常用的评估蛋白磷酸化状态的方法。
在这
种方法中，使用能够特异性识别磷酸化位点的抗体进行孵育，从而检测特定蛋白的磷酸化状态。
4.生物信息学预测：还可以使用生物信息学方法来预测蛋白质的磷酸化位点。
这些方法通常基于已知的磷酸化位点和蛋白质序列的特征，通过算法来预测可能的磷酸化位点。
5.实验验证：通过实验验证预测结果是非常重要的。
这可能包括使用突变技术
来改变预测的磷酸化位点，然后观察这种改变对蛋白质功能的影响。
6.数据分析：收集到的数据需要进行详细的分析，以确定磷酸化位点的准确性
和功能性。
总的来说，在实际操作中，可能需要结合多种技术和方法来确定磷酸化蛋白的磷酸化位点。
这些方法的选择和应用取决于具体的研究目的和实验条件。
此外，实验过程中应注意避免可能影响结果准确性的因素，如样本污染、操作不当等。
磷酸化位点鉴定
磷酸化位点鉴定
生物体内的代谢过程往往需要受到磷酸化的调控，而磷酸化作用主要是在蛋白质分子
上完成的。
随着技术手段的不断发展，磷酸化位点的鉴定已经成为了研究蛋白质调控机制
的关键问题之一。
磷酸化位点鉴定的方法主要分为两类，一种是基于蛋白质组学技术的高通量筛选方法，另一种则是针对单个蛋白质或位点的研究，采用分子生物学、生物化学等技术去探究这些
位点的磷酸化作用和生物学功能。
其中基于蛋白质组学技术的高通量筛选方法相对较为简单，具有较高的精度和可信度，在细胞信号转导网络的探究中得到了广泛应用。
这种方法主要包括以下几个步骤：
1. 样品前处理：提取样品并对其进行前处理，如蛋白质浓缩、去盐等。
2. 蛋白质的消化：采用酵素消化技术对蛋白质进行降解，得到多肽片段。
3. 磷酸化肽样本的富集：采用抗磷酸抗体对磷酸化位点进行富集。
4. 质谱分析：将样本中的多肽片段通过质谱分离，并检测其质荷比（m/z）值和碎片谱，从而确定其氨基酸序列和磷酸化位点。
此外，还有基于针对单个蛋白质或位点的研究方法。
这种方法通常借助于分子生物学、生物化学等技术手段，对蛋白质结构和功能的研究更深入、更具体，但其操作复杂性及精
度相对较低。
总之，无论是哪种磷酸化位点鉴定方法，都需要采用合适的实验方案和实验操作流程，确保最终得到的结果具有较高的可靠性和准确性。
同时，数据的分析和解读也是至关重要
的一环，需要充分考虑基于生物学原理的推断和验证，以保证研究的结论与实际生物现象
的一致性。
磷酸化蛋白检测方法
磷酸化蛋白检测方法
常见的磷酸化蛋白检测方法包括免疫印迹（Western blot）、
免疫组织化学染色（Immunohistochemistry，IHC）、免疫荧光染色（Immunofluorescence staining）、质谱分析（Mass spectrometry）等。
这些方法各有特点，可以根据具体的实验目的
和样本类型选择合适的方法进行磷酸化蛋白的检测。
在免疫印迹中，首先需要提取蛋白质样本，然后进行电泳分离，接着转膜到膜上，随后使用特异性的抗体结合磷酸化蛋白进行检测。
而在免疫组织化学染色和免疫荧光染色中，可以通过组织切片或细
胞制片的方式，利用特异性抗体对磷酸化蛋白进行染色，从而观察
其在组织或细胞中的表达情况。
质谱分析则是通过质谱仪对蛋白质样本进行分析，可以鉴定蛋
白质中的磷酸化位点和程度，是一种比较直接和准确的方法。
除了上述方法外，近年来还出现了一些新的磷酸化蛋白检测技术，例如蛋白质芯片技术、蛋白质质谱成像技术等，这些新技术在
高通量、高灵敏度等方面具有优势。
总的来说，磷酸化蛋白检测方法的选择应该根据具体的实验需求和样本特点来确定，合理选择合适的方法可以提高实验的准确性和可靠性。
希望以上信息能够对你有所帮助。
yap磷酸化位点
标题：YAP磷酸化位点研究及其生物学意义引言：YAP（Yes-associated protein）是一种重要的信号调节蛋白，参与了多个细胞信号通路的调控。
在细胞核内，YAP的活性受到磷酸化修饰的调控。
磷酸化位点是指YAP蛋白上被磷酸化修饰的特定氨基酸残基，通过磷酸化修饰可以改变YAP的亚细胞定位、相互作用以及转录调控等功能。
本文将系统介绍YAP磷酸化位点的研究进展，并探讨其在细胞生物学中的重要意义。
一、YAP蛋白的结构与功能：YAP是一种核质分布的转录共激活蛋白，属于Hippo信号通路的关键成员。
YAP蛋白由多个结构域组成，包括TEAD结合域、WW 结构域和PDZ结构域等。
YAP通过与转录因子TEAD家族成员结合，调控靶基因的转录活性，从而影响细胞增殖、凋亡、迁移和分化等生物学过程。
二、YAP磷酸化位点的鉴定与功能：1. 磷酸化位点的鉴定方法：通过质谱技术结合生物信息学分析，可以鉴定出YAP蛋白上的磷酸化位点。
常见的磷酸化位点包括Ser127、Ser61和Ser109等。
2. 磷酸化位点的功能：YAP蛋白的磷酸化修饰可以影响其亚细胞定位和稳定性。
磷酸化位点的磷酸化状态决定了YAP的核入核出平衡，从而调控其转录活性。
此外，磷酸化位点还可以影响YAP与其他蛋白的相互作用，如TEAD和14-3-3蛋白等。
三、磷酸化位点在信号通路中的调控：1. Hippo信号通路：Hippo信号通路是一条高度保守的信号传导通路，参与了细胞增殖、器官大小控制和组织修复等过程。
在此通路中，磷酸化位点的磷酸化状态决定了YAP的核转位和转录调控活性，进而影响细胞增殖和凋亡等生物学效应。
2. Wnt信号通路：Wnt信号通路在胚胎发育和成体组织维持中起重要作用。
磷酸化位点的磷酸化状态可以调控YAP与β-catenin的相互作用，从而影响Wnt信号通路的激活。
3. mTOR信号通路：mTOR信号通路参与了细胞代谢、增殖和生长等过程。
pkm2 磷酸化位点
pkm2 磷酸化位点磷酸化位点是指蛋白质分子上的氨基酸残基在细胞内被磷酸化修饰的位置。
磷酸化是一种重要的蛋白质后修饰方式，可以调节蛋白质的活性、稳定性、互作性以及细胞内定位等功能。
PKM2（磷酸化酶激活剂2）是一种磷酸化酶，它参与调控磷酸化的过程，特别是在糖酵解途径中起着重要作用。
磷酸化位点的特点：1. 氨基酸残基，常见的磷酸化位点包括丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）等。
这些氨基酸残基在蛋白质分子中具有特定的结构和功能，其磷酸化修饰会影响蛋白质的结构和功能。
2. 蛋白激酶和磷酸酶，磷酸化位点的修饰由蛋白激酶和磷酸酶协同调节。
蛋白激酶负责在特定的氨基酸残基上添加磷酸基团，而磷酸酶则负责去除这些磷酸基团。
3. 调控功能，磷酸化位点的修饰可以调节蛋白质的结构和功能，影响其在细胞内的活性、相互作用、定位等。
这种修饰方式在细胞信号传导、代谢调节、细胞周期调控等生物学过程中起着重要作用。
PKM2磷酸化位点的研究：PKM2作为磷酸化酶，其磷酸化位点的研究对于了解糖酵解途径调控机制具有重要意义。
研究表明，PKM2的磷酸化修饰可以影响其催化活性和构象变化，进而影响糖酵解途径的代谢流程。
此外，PKM2的磷酸化位点还与肿瘤代谢重新编程、细胞增殖和转移等生物学过程密切相关，因此对其磷酸化位点的研究有助于揭示肿瘤发生发展的分子机制。
总之，磷酸化位点是蛋白质分子上重要的修饰位点，其修饰可以影响蛋白质的功能和调控。
而PKM2作为磷酸化酶在糖酵解途径和肿瘤发生发展中具有重要作用，其磷酸化位点的研究对于揭示相关生物学过程的分子机制具有重要意义。
蛋白质磷酸化位点的识别
内蒙古工业大学学报JOU RN AL O F IN N ER M ON G OL IA第30卷第2期U N IV ERSIT Y OF T ECHN O LO GY V ol.30No.22011文章编号:1001-5167(2011)03-0081-05蛋白质磷酸化位点的识别*白海艳,吕军,张颖,计美珍,秦丹丹(内蒙古工业大学理学院呼和浩特010051)摘要:磷酸化是蛋白质重要的翻译后修饰之一,磷酸化位点的理论识别是计算生物学的重要研究内容。
磷酸化位点附近存在保守残基片段,而这种保守性又与激酶类型相关。
选择注释数据相对较多的CK2,PK A和PK C三种激酶催化的磷酸化位点作为研究对象,以序列组分特征,残基位置特异性特征和残基的非近邻关联特征为参数,采用延森-香农离散量(Jensen-Shanno n Div erg ence,JSD)作为各特征差异度量,再使用二次判别分析算法组合不同特征,对磷酸化位点进行预测。
对CK2,PK A和P KC三种激酶磷酸化位点7-fold交叉检验,总精度分别达到了90%,90%和86%,这一结果要好于当前其它预测模型。
关键词:蛋白质磷酸化位点,延森-香农离散量,二次判别分析中图分类号:Q61文献标识码:A0引言蛋白质翻译后修饰在生命活动中具有十分重要的作用,它使蛋白质的结构更为复杂,功能更为完整,调节更为精细,作用更为专一。
常见的蛋白质翻译后修饰过程有六种,如泛素化,磷酸化,糖基化,酯基化,甲基化和乙酰化,其中磷酸化是蛋白质最重要的翻译后修饰之一。
蛋白质磷酸化和去磷酸化过程是生物体内普遍存在的信息传导方式,几乎涉及所有的生理及病理过程。
真核蛋白质约30%-50%要经历磷酸化过程[1],而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶,激酶的失活会导致一系列的疾病,如癌症等。
因此,了解特定蛋白质激酶的磷酸化作用机制将会影响当前分子生物学的许多领域,对疾病的相关研究以及药物设计等方面也都有很大帮助。
磷酸化测序
磷酸化测序磷酸化测序（Phosphorylation Sequencing）是一种用于研究蛋白质磷酸化修饰的高通量测序技术。
磷酸化是细胞信号传导和调控的重要方式之一，通过酶催化将磷酸基团（PO4）添加到蛋白质上，从而调节其活性、定位和相互作用。
磷酸化的异常调控与多种疾病的发生和发展密切相关，因此深入了解蛋白质磷酸化修饰的特征和机制对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
磷酸化测序的基本原理是利用高通量测序技术对蛋白质样品进行全面的磷酸化位点分析。
首先，蛋白质样品经过消化和富集等处理，得到含有磷酸化位点的肽段。
然后，这些肽段通过质谱仪进行质量测定，得到它们的质量-荷质比。
接下来，通过与已知蛋白质数据库进行比对，确定这些肽段的氨基酸序列和磷酸化位点。
磷酸化测序的核心技术是质谱仪。
质谱仪可以将蛋白质样品中的肽段分离并进行质量测定。
其中，液相色谱质谱联用技术（LC-MS/MS）是最常用的方法之一。
在液相色谱中，肽段通过柱子进行分离，然后进入质谱仪进行质量测定。
质谱仪通过对肽段进行解离和碎裂，得到肽段碎片的质谱图谱。
通过分析这些质谱图谱，可以确定肽段的氨基酸序列和磷酸化位点。
磷酸化测序的数据分析是整个研究过程中非常重要的一步。
数据分析的目标是从大量的质谱数据中筛选出与磷酸化修饰相关的肽段，并确定它们的磷酸化位点。
为了实现这一目标，研究人员需要依靠生物信息学和统计学的方法。
首先，通过与已知蛋白质数据库进行比对，确定质谱数据中的肽段的氨基酸序列和磷酸化位点。
然后，通过对质谱数据进行定量分析，比较不同条件下磷酸化位点的丰度差异，从而找出与磷酸化修饰相关的肽段。
磷酸化测序技术的应用非常广泛。
例如，在癌症研究中，研究人员可以利用磷酸化测序技术比较肿瘤细胞和正常细胞中的磷酸化位点的差异，从而发现新的癌症标志物或治疗靶点。
此外，磷酸化测序技术还可以应用于药物研发、细胞信号传导机制研究等领域。
磷酸化测序是一种用于研究蛋白质磷酸化修饰的高通量测序技术。
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磷酸化蛋白的高效富集在线酶解与快速鉴定项目申请人：袁敏婷黄懿指导教师：杨芃原摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。
生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。
本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。
关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解1.引言蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。
蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。
了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。
据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。
对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。
蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。
真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。
大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。
因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。
对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。
虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。
在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸化位点。
然而，由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，磷酸化肽的质谱信号会被非磷酸化肽的质谱信号压制,因此在磷酸化蛋白的质谱分析鉴定前，依然需要结合富集技术以便于提高信噪比。
而发展至今，传统的分析方法耗时长，成本高或是效率低，并不能给出一个快速高效的磷酸化蛋白分析策略。
另一方面，由于传统的酶解技术耗时长，序列覆盖度低，也对位点鉴定造成了一定的困难。
所以尽管已有多种方法分离与鉴定磷酸化蛋白，但由于磷酸化的多样、动态、微量等性质，使其目前仍然是生物化学中的难题。
近年研究发现，二氧化钛等一些含有金属原子的纳米颗粒可以选择性的把磷酸化蛋白从混合溶液中富集出来，特别是含铁的磁性纳米颗粒已经显示出其巨大优势。
磷酸化蛋白分析要求超小体积、灵敏度高、选择性好的分析技术，蛋白质在线酶解技术凭借其快速、高效的酶解过程为各类需要快速酶解的相关领域提供了一个崭新的技术平台。
本项目利用四氧化三铁纳米磁性球对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，实现快速，高效的磷酸化蛋白与肽段富集，并结合蛋白质在线酶解技术，以提高蛋白酶解速度与效率，建立一个从混合蛋白到位点鉴定的快速分析策略。
该方法与传统方法比，将会有集成化高，样品损失少，速度快等优点，既适合做特定磷酸化蛋白的快速鉴定，也适合用于高通量，大规模的蛋白质组学研究。
2.实验部分2.1.仪器与试剂4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystem公司)；微流泵74900 Series (Cole-Parmer Instrument Company)。
Fe3O4纳米磁性球为自制；石英毛细管空柱(75μm i.d.)购自河北永年锐沣色谱器件有限公司。
细胞色素c (Cytochrome c, from Horse Heart)、肌红蛋白(Myoglobin, from Equine Skeletal Muscle)、磷酸化蛋白β-Casein(from Bovine Milk)、测序级胰蛋白酶(Trypsin, from Bovine Pancreas)为德国Sigma公司产品；牛血清蛋白(Bovine Serum Albumir)为上海华舜生物工程有限公司产品；其它试剂均为国产分析纯。
2.2.Fe3O4纳米磁珠的合成根据文献(11)，用水热合成法自制磁珠。
具体方法是:把FeCl3·6H2O(1.35g，5mmol)溶于乙烯乙二醇(40mL)中，形成澄清溶液后加入醋酸钠(3.6g)，强烈振摇60min然后密封在具聚四氟乙烯条纹的不锈钢高压锅(容量为50mL)中，加热至200℃8-72h,再冷却至室温。
黑色产物用乙醇、去离子水洗涤数遍，在60℃下干燥6h。
图2 在线固定化酶微反应器制作流程图把纳米磁珠加入到混合蛋白质或肽段溶液中(每200μl 溶液中加入4μl 磁珠)，室温下放置10min 以使磁珠吸附上磷酸化蛋白或肽段。
然后用磁铁分离磁珠，吸去清液。
再用10%ACN1%HAc溶液(pH=2.8)洗涤两次以除去杂肽，再用200mM 氨水(pH=11)洗脱。
2.4.在线酶解2.4.1.在线固定化酶微反应器的准备首先，用0.1M NaOH 溶液预处理毛细管30min 。
然后分别用去离子水、HDB 溶液（0.1%）、去离子水分别洗5min 使毛细管壁覆盖正电荷。
除尽管中的水，注入胰蛋白酶，停留5min 使酶通过离子键固定在毛细管壁上。
用25mM NH 4HCO 3洗管3min 以除去过量的酶。
（所有溶液均通过微流泵注入毛细管）2.4.2.在线酶解37℃下把蛋白注入毛细管，在毛细管另一端收集反应后的溶液即为酶解后的肽段溶液。
2.4.3.酶微反应器的再生当固定的酶功减弱，可以用1M NaCl ，0.1M HCl ，0.1M NaOH 连续的洗毛细管以洗提固定的酶（解吸附作用），重复2.3.1的步骤重新固定上酶。
图1 磷酸化蛋白或肽段的富集过程图 Washing solution: 10% acetonitrile and 1% acetic acid (pH=2.8) Elution solution: 200 mM ammonia (pH 11)为匹配在线酶解，尝试改变磷酸化肽段富集溶液，以优化磷酸化肽段富集条件。
每200μl原液直接加入20μl ACN 和1%醋酸调整pH，其他条件不变。
然后直接使用磁性材料如步骤2.2做富集、洗脱。
2.6.质谱鉴定洗脱得到的肽段用基质辅助激光解吸电离-飞行时间-串级质谱(MALDI-TOF-MS/MS)鉴定并以基质峰、酶自动降解片段峰进行校正，测定各肽段的质谱数据。
数据通过GSP 查询软件再在相应的查询条件下搜索数据库MASCOT得到各蛋白的信息。
3.结果与讨论3.1.在线酶解效果由于硅烷醇基团的离子化，石英毛细管内表面本来就带有负电荷，使得酶无法被吸附在裸露的内表面，因此必须用一种水溶性的、有强阳离子基团的聚电解质作为离子交换剂来修改毛细管壁所带电荷。
本实验里使用聚阳离子电解质HDB来使管壁覆盖上一层阳离子，这种修改方法只要通过把HDB溶液注入毛细管这样简单的步骤就可完成，而且覆盖的这层HDB在其他流动溶液的冲洗下仍可保持足够的稳定。
更重要的是，HDB分子拥有高密度的季铵基团，可作为固定酶的强阴离子交换剂。
如图2所示，固定化酶微反应器通过简单的两步反应就可制成。
此法制在线固定化酶微反应器的优点主要有：(1)方法简单，可通过设备自动化实现；(2)酶的固定是可逆的，因而微反应器可以简单的被更新；(3)酶固定的条件温和，因而酶的活性可以最大限度地被保留。
如图3所示，为BSA与Cyt-c在线酶解后的质谱鉴定结果。
在相应的查询条件(S/N：50；Peptide tol.：±150ppm；Database：Swissport；missed cleavages allow：1)下搜索MASCOT 数据库，得到匹配肽段数分别为15和6，序列覆盖度分别为28%和44%。
3.2.材料富集条件试验为了检验酸度和盐度对材料富集结果的影响,我们进行了一系列的条件试验。
对于酸度，我们使用了不同浓度的HCl、TFA和HAc来调整不同的pH值，得出使用HAc的效果是最好的。
另一方面，我们发现酸度越高，回收率也越高，而质谱鉴定的信号强度却越低。
对于盐度，我们分别使用了NH3·H2O、100mM NH4HCO3和200mM NH4HCO3来作洗脱，结果显示分别不大，也就是说盐度对富集结果影响不大。
但是为了与在线酶解匹配，选择使用200mM NH4HCO3来作洗脱液。
图3 BSA与Cyt-c在线酶解后的质谱鉴定结果(基质为CHCA)Mascot搜库条件：S/N: 50; Peptide tol.: ±150 ppm; Database: Swissport; missed cleavages allow; 1本实验里用含有5个磷酸化丝氨酸残基的标准蛋白β-Casein来作优化富集过程和MALDI-TOF MS描述的磷酸化蛋白模型。
已知β-Casein有三个可能存在的可被Trypsin酶解的磷酸化肽段，分别在MH 2061.8 Da，MH 2556.1 Da和MH 3122.0 Da，它们具体的氨基酸序列见表1。
图4为用Fe3O4纳米磁珠富集含10ng/μlβ-Casein的25mM NH4HCO3溶液前后的质谱图。
图4a中，富集前，m/z2061的峰受到了明显的信号压制，而图4b所见，经过富集后m/z2061的峰信号得到了明显的增强。
表1 β-Casein 中磷酸化肽段的具体序列信息Phosphopeptides sequence Peptide residues [MH]+(Da)FQ p SEEQQQTEDELQDK β-Casein 33-48 2061.8 FQ p SEEQQQTEDELQDKIHPF β-Casein33-5 2556.1 RELEELNVPGEIVE p SL p S p S p SEESITR β-Casein 1-25 3122.0ab图4 Fe3O4纳米磁珠富集含10ng/μlβ-Casein的25mM NH4HCO3溶液前后质谱图比较(基质为CHCA)a)原液的MALDI-TOF MS谱图；b)材料富集后，用200mM 氨水洗脱得到富集液的MALDI-TOF MS谱图。
3.3.磷酸化肽段的富集结果为了研究此方法的效率，我们用含有一种磷酸化蛋白(50ng/μlβ-Casein)和三种非磷酸化蛋白(200ng/μl BSA, 100ng/μl Myoglobin和50ng/μl Cyt-c)的蛋白混合物作为蛋白模型。