生物质谱分析蛋白质磷酸化位点

磷酸化蛋白的高效富集

在线酶解与快速鉴定

项目申请人：袁敏婷黄懿

指导教师：杨芃原

摘要：蛋白质的可逆磷酸化具有重要的生物学意义，对蛋白质磷酸化位点进行分析有助于阐明蛋白质磷酸化的机制与功能。生物质谱是目前进行蛋白质磷酸化分析最有力的方法之一，但由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，在质谱分析前，依然需要结合富集或分离的步骤。本作品旨在利用四氧化三铁磁性纳米材料对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，结合在线酶解技术的快速，高序列覆盖度特性构建一个快速，高效鉴定分析磷酸化蛋白的新技术。

关键词：蛋白质磷酸化；Fe3O4磁性材料富集；在线酶解

1.引言

蛋白质的翻译后修饰（PTMs）是目前蛋白质组研究中的一个重要课题。蛋白质磷酸化是最普遍、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，它几乎调节着生命活动的整个过程，包括细胞的增殖、发育和分化，神经活动，肌肉收缩，新陈代谢，肿瘤发生等。了解蛋白质磷酸化对功能的影响可深入理解生命系统如何在分子水平进行调控。据统计，在哺乳动物中大约有三分之一的蛋白质被认为是磷酸化修饰的，而脊椎动物基因组中有5%的基因编码蛋白激酶或磷酸酯酶。对众多生物化学功能起开/关调控作用，是一种普遍的调控机制。

蛋白质的可逆磷酸化使得蛋白质组学研究更为复杂。真核生物细胞蛋白质中主要的磷酸化氨基酸为丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸，其比例大概为1800∶200∶1。大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，并且其磷酸化位点是可变的。因此,一种蛋白可能有多种磷酸化形式。对单一蛋白质进行研究的传统方法远不能满足分析这一层面上蛋白质的多样性和复杂性的需要，用蛋白质组技术和生物信息学高通量地研究翻译后蛋白质的修饰已成为必然趋势。虽然对磷酸化蛋白质组学分析已有很大进步，但依然存在多个难点亟待解决包括磷酸化蛋白和肽段的富集，可逆性磷酸化位点的鉴定以及磷酸化位点的定量等。

在过去几十年中已有多种分离和鉴定蛋白质磷酸化的技术发展起来，包括放射性同位素标记、免疫沉淀反应、化学修饰、固定金属离子亲合色谱法等，而生物质谱技术已经成为磷酸化蛋白鉴定的主要工具，串联质谱更是可以高通量，快速的给出详细的磷酸

化位点。然而，由于蛋白质磷酸化的丰度低以及磷酸化的肽段离子化效率低，磷酸化肽的质谱信号会被非磷酸化肽的质谱信号压制,因此在磷酸化蛋白的质谱分析鉴定前，依然需要结合富集技术以便于提高信噪比。而发展至今，传统的分析方法耗时长，成本高或是效率低，并不能给出一个快速高效的磷酸化蛋白分析策略。另一方面，由于传统的酶解技术耗时长，序列覆盖度低，也对位点鉴定造成了一定的困难。所以尽管已有多种方法分离与鉴定磷酸化蛋白，但由于磷酸化的多样、动态、微量等性质，使其目前仍然是生物化学中的难题。

近年研究发现，二氧化钛等一些含有金属原子的纳米颗粒可以选择性的把磷酸化蛋白从混合溶液中富集出来，特别是含铁的磁性纳米颗粒已经显示出其巨大优势。磷酸化蛋白分析要求超小体积、灵敏度高、选择性好的分析技术，蛋白质在线酶解技术凭借其快速、高效的酶解过程为各类需要快速酶解的相关领域提供了一个崭新的技术平台。

本项目利用四氧化三铁纳米磁性球对磷酸化肽或蛋白快速高效的特异性吸附，实现快速，高效的磷酸化蛋白与肽段富集，并结合蛋白质在线酶解技术，以提高蛋白酶解速度与效率，建立一个从混合蛋白到位点鉴定的快速分析策略。该方法与传统方法比，将会有集成化高，样品损失少，速度快等优点，既适合做特定磷酸化蛋白的快速鉴定，也适合用于高通量，大规模的蛋白质组学研究。

2.实验部分

2.1.仪器与试剂

4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystem公司)；微流泵74900 Series (Cole-Parmer Instrument Company)。Fe3O4纳米磁性球为自制；石英毛细管空柱(75μm i.d.)购自河北永年锐沣色谱器件有限公司。细胞色素c (Cytochrome c, from Horse Heart)、肌红蛋白(Myoglobin, from Equine Skeletal Muscle)、磷酸化蛋白β-Casein(from Bovine Milk)、测序级胰蛋白酶(Trypsin, from Bovine Pancreas)为德国Sigma公司产品；牛血清蛋白(Bovine Serum Albumir)为上海华舜生物工程有限公司产品；其它试剂均为国产分析纯。

2.2.Fe3O4纳米磁珠的合成

根据文献(11)，用水热合成法自制磁珠。具体方法是:把FeCl3·6H2O(1.35g，5mmol)溶于乙烯乙二醇(40mL)中，形成澄清溶液后加入醋酸钠(3.6g)，强烈振摇60min然后密封在具聚四氟乙烯条纹的不锈钢高压锅(容量为50mL)中，加热至200℃8-72h,再冷却至室温。黑色产物用乙醇、去离子水洗涤数遍，在60℃下干燥6h。

图2 在线固定化酶微反应器制作流程图

把纳米磁珠加入到混合蛋白质或肽

段溶液中(每200μl 溶液中加入4μl 磁

珠)，室温下放置10min 以使磁珠吸附上

磷酸化蛋白或肽段。然后用磁铁分离磁

珠，吸去清液。再用10%ACN1%HAc

溶液(pH=2.8)洗涤两次以除去杂肽，再

用200mM 氨水(pH=11)洗脱。

2.4.在线酶解

2.4.1.在线固定化酶微反应器的准备

首先，用0.1M NaOH 溶液预处理毛细管30min 。然后分别用去离子水、HDB 溶液（0.1%）、去离子水分别洗5min 使毛细管壁覆盖正电荷。除尽管中的水，注入胰蛋白酶，停留5min 使酶通过离子键固定在毛细管壁上。用25mM NH 4HCO 3洗管3min 以除去过量的酶。（所有溶液均通过微流泵注入毛细管）

2.4.2.在线酶解

37℃下把蛋白注入毛细管，在毛细管另一端收集反应后的溶液即为酶解后的肽段溶液。

2.4.

3.酶微反应器的再生

当固定的酶功减弱，可以用1M NaCl ，0.1M HCl ，0.1M NaOH 连续的洗毛细管以洗提固定的酶（解吸附作用），重复2.3.1的步骤重新固定上酶。

图1 磷酸化蛋白或肽段的富集过程图 Washing solution: 10% acetonitrile and 1% acetic acid (pH=2.8) Elution solution: 200 mM ammonia (pH 11)