实验12-微生物菌种常用简易保藏法

实验15 微生物菌种保藏方法

一、实验原理

为了保持微生物菌种原有的各种优良特征及活力，使其存活，和丢失，不污染，不发生变异。根据微生物自身的生物学特点，通过人为的创造条件，使微生物处于低温、干燥、缺氧的环境中，以使微生物的生长受到抑制，新陈代谢作用限制在最低范围内，生命活动基本处于休眠状态，从而达到保藏的目的。

常用简易保藏法包括常规转接斜面低温保藏法、半固体穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、含甘油培养物保藏法及沙土管保藏法等。由于这些保藏方法不需要特殊实验设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。

常规转接斜面低温保藏法和半固体穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4-5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。

液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4-5℃冰箱中保藏。液体石蜡主要起隔绝空气的作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。

含甘油培养物保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15%已灭菌的甘油，然后再置于-20或-70℃冰箱内保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且，在-20或-70℃条件下，可大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。

沙土管保藏法，将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制后孢子悬浮液，无菌操作将孢子悬浮液滴入已灭菌的沙土管中，孢子即吸附在沙土上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。

二、操作步骤

(一) 斜面传代保藏法

l．贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。

2．斜面接种将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌和酵母菌宜采用对数生长期的细胞，而放线菌和丝状真菌宜采用成熟的袍子。

3．培养细菌37℃恒温培养18～24h，酵母菌于28～30℃培养36～60h，放线菌和丝状真菌置于28℃培养4～7d。

4．保藏斜面长好后，可直接放入4℃冰箱保藏。为防止棉塞受潮长杂菌，管口棉花应用牛皮纸包扎，或换上无菌胶塞，亦可用熔化的固体石蜡熔封棉塞或胶塞。

保藏时间依微生物种类而不同，酵母菌、霉菌、放线菌及有芽抱的细菌可保存2～6个月，移种一次；而不产芽孢的细菌最好每月移种一次。此法的缺点是容易变异，污染杂菌的机会较多。

(二) 液体石蜡保藏法

l、液体石蜡灭菌在250mL三角烧瓶中装入100mL液体石蜡，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，12l℃湿热灭菌30min，于105～110℃烘箱中lh，以除去石蜡中的水分。

2、接种培养同斜面传代保藏法。

3、加液体石蜡用无菌滴管吸取液体石蜡以无菌操作加到已长好的菌种斜面上，加入量以高出斜面顶端约1cm为宜。

4、保藏棉塞外包牛皮纸，将试管直立放置于4℃冰箱中保存。

利用这种保藏方法，霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。

5、恢复培养用接种环从液体石蜡下挑取少量菌种，在试管壁上轻靠几下，尽量使油滴净，再接种于新鲜培养基中培养。由于菌体表面粘有液体石蜡，生长较慢且有粘性，故一般须转接2次才能获得良好菌种。

(三) 沙土管保藏法

l、沙土处理

(1)沙处理：取河沙经40目过筛，去除大颗粒，加10%HCl浸泡(用量以浸没沙面为宜)2～4h(或煮沸30min)，以除去有机杂质，然后倒去盐酸，用清水冲洗至中性，烘干或晒干，备用。

(2)土处理：取非耕作层瘦黄土(不含有机质)，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性，然后烘干，粉碎，用100目过筛，去除粗颗粒后备用。

2、装沙土管将沙与土按2:1，3:1或4：1(W/W)比例混合均匀装入试管中(10mm ×100mm，装置约7cm高，加棉塞，并外包牛皮纸，12l℃湿热灭菌30min，然后烘干。

3、无菌试验每10支沙土管任抽一支，取少许沙土接入牛肉膏蛋白胨或麦芽汁培养液中，在最适的温度下培养2～4d，确定无菌生长时才可使用。若发现有杂菌，经重新灭菌后，再作无菌试验，直到合格。

4、制备菌液用5mL无菌吸管分别吸取3mL无菌水至待保藏的菌种斜面上，用接种环轻轻搅动，制成悬液。

5、加样用1mL吸管吸取上述菌悬液0.1～0.5mL加入沙土管中，用接种环拌匀。加入菌液量以湿润沙土达2/3高度为宜。

6、干燥将含菌的沙土管放入干燥器中，干燥器内用培养皿盛P

2O

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作为干燥剂，

可再用真空泵连续抽气3～4h，加速干燥。将沙土管轻轻一拍，沙土呈分散状即达到充分干燥。

7、保藏沙土管可选择下列方法之一来保藏：

(1) 保存于干燥器中；

(2) 用石蜡封住棉花塞后放入冰箱保存；

(3) 将沙土管取出，管口用火焰熔封后放入冰箱保存；

等干燥剂的大试管中，塞上橡皮塞或木塞，再用蜡封

(4) 将沙土管装入有CaCl

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口，放入冰箱中或室温下保存。

8．恢复培养使用时挑取少量混有孢子的沙土，接种于斜面培养基上，或液体培养基内培养即可，原沙土管仍可继续保藏。

此法适用于保藏能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌，可保存2年左右。但不能用于保藏营养细胞。

(四) 含甘油培养物保藏法

1、首先将甘油配为80%浓度

2、将80%甘油按1ml/瓶的量分装到一甘油瓶(3ml)中，121℃灭菌20分钟。

3、将要保藏的菌种接种到新鲜的斜面(也可用液体培养基振荡培养成菌悬浮液)。

4、在培养好的斜面中注入少量无菌水，刮下斜面的培养物振荡，使细胞充分分散成均匀的悬浮液，并且细胞浓度约为108-1010/ml。

5、将菌悬液吸取1ml于上述装好的甘油的无菌甘油瓶中，充分混匀后，使甘油终浓度为40%，然后置-20℃(-80℃)保存，液体培养的菌液到对数期直接吸取1ml 于甘油瓶中。

三、实验报告

1、微生物菌种保藏的目的是什么？

2．试述上述菌种简易保藏法的优、缺点。