柑橘内生细菌分离、鉴定及分布特性

合集下载

两株柑橘采后致病真菌的分离及生物学特性研究

两株柑橘采后致病真菌的分离及生物学特性研究陶能国;王华;王长锋;倪俊;罗羽裳【摘要】从自然发病的宫川果实表面分离得到两株致病真菌(PD和PI).致病力检测结果显示,接种PD菌的柑橘果实发病到全部腐烂需7 d,而接种PI菌的柑橘果实发病到全部腐烂则需13d.形态学特征比较得知,PD和PI分别为指状青霉(Penicillium digitatum)和意大利青霉(P.italicum).基础生物学特性结果表明,PD 的致死温度为70℃,菌丝体生长最适温度为25℃,最适pH 7.0;PI的致死温度为80℃,菌丝体生长的最适温度为20℃,最适pH 10.0.【期刊名称】《湘潭大学自然科学学报》【年(卷),期】2013(035)003【总页数】4页(P75-78)【关键词】柑橘;指状青霉;意大利青霉;生物学特性【作者】陶能国;王华;王长锋;倪俊;罗羽裳【作者单位】湘潭大学化工学院,湖南湘潭 411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭 411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭411105;湘潭大学化工学院,湖南湘潭 411105【正文语种】中文【中图分类】S436.66柑橘属于芸香科(Rutaceae)柑橘属(Citrus)植物，是种植面积较广的一种农作物，遍及100多个国家[1].我国是世界上种植面积最大的国家之一.由于柑橘的产地和消费区存在一定的距离，在采后贮藏和运输过程中易发生多种侵染性病害，造成果实腐烂变质，腐烂率一般为10%～30%，严重时可达60%以上，造成严重的经济损失[2].易造成采后柑橘果实腐烂的常见病害有20多种，主要包括青霉病、绿霉病、黑腐病、蒂腐病、炭疽病和酸腐病等[3]，以青霉病和绿霉病最为严重，最高可导致40%的采后腐烂[4].环境适宜的情况下，青霉和绿霉病菌可在田间侵染果实，或采后由健康果实携带进入销售市场或贮藏库，导致果实病害大量发生，严重影响果实品质和商品价值[5].本研究拟从自然发病的宫川果实表面分离得到致病菌，并对其基础生物学特性进行研究，为下一步探讨柑橘采后致病菌的防治提供实验材料和理论基础.1 材料方法1.1 实验材料新鲜宫川(Citrus unshiu Marc. cv. Miyagawa Wase))果实，采自湘潭大学附近果园.1.2 致病真菌的分离将自然发病果实表皮用清水洗净，取约3 mm×5 mm 的病组织数块，用75%乙醇表面消毒10 s，再用0.1% HgCl2(φ)消毒4～6 min，用无菌水冲洗3次后，将染病组织置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板，25 ℃下培养3 d，分离纯化得到菌株，备用.1.3 致病力的检测选取无机械损伤、无病虫害、大小均一、成熟度相同的宫川果实，用2%NaClO(φ)溶液浸泡2 min，然后用清水清洗3次，室温环境下自然干燥.在无菌操作台内用无菌刀片在果实的腰部刺4 mm2的伤口，同时接种10 μL的菌悬液(1×107 C FU/mL).将接种果置于相对湿度95%的保鲜盒中，各处理10个果实，重复3次，每天记录发病情况[6].1.4 致病真菌的形态学观察将已经纯化好的病原菌接种于PDA培养基上培养3 d.病原菌菌落形态观察采用周德庆的载玻片培养方法[7]，将病原菌点接到滴有PDA培养基的载玻片上，放于培养皿中，每个培养皿中垫有一片湿润的滤纸片(灭菌)保湿，于25 ℃培养箱中培养5 d，在显微镜下观察其形态特征.参照真菌形态学鉴定手册[8]鉴定分离所得病原菌的种类.1.5 致病真菌基础生物学特性观察1.5.1 致病真菌最适生长温度的测定将病原菌接种于PDA培养基，取培养3 d后直径为6 mm的菌苔，接种于新的PDA平板，分别于15 ℃，20 ℃，25 ℃，28 ℃，30 ℃，35 ℃，37 ℃培养3 d，用直尺记录菌丝体的直径.1.5.2 致病真菌致死温度的测定取PDA培养基上培养3 d的病原菌孢子，制成浓度为1×104 CFU/mL的孢子悬浮液，取1 mL悬浮液分装于有9 mL无菌水的不同试管中，将试管分别放置于-20 ℃，0 ℃，20 ℃，40 ℃，60 ℃，80 ℃，100 ℃环境下处理10 min(待温度上升到预定值时开始计时).之后用移液枪移取50 μL孢子悬浮液于PDA培养基上涂布均匀，于最适温度下倒置培养，观察病原菌的菌落生长情况，初步确定致死温度的范围.在此基础上每隔5 ℃设置一个梯度，获得较为精确的致死温度.1.5.3 致病真菌最适pH的测定将PDA培养基的pH从2.0开始，以1个单位为梯度递增，直到12.0.取培养3 d、直径为6 mm菌苔，置于不同pH培养基中，最适温度下培养3 d.观察菌落生长情况.1.6 数据分析每组实验重复三次，实验结果采用平均值并标注标准偏差表示，数据分析采用SPSS16.0统计分析软件，One way ANOVA分析差异显著性(P<0.05).2 结果分析2.1 致病真菌的分离及致病力的检测从自然发病的宫川果实(图1 A和B)表面共分离得到两株具有较强致病力的真菌，分别命名为PD和PI.致病力检测结果显示，接种PD菌和PL菌的宫川果实从第2 d开始有发病迹象(表1和表2).接种PD菌柑橘果实的典型发病症状为：发病初期病果表面呈水浸状，并逐渐形成不规则的白色霉层，随着时间延长，出现绿色霉层并迅速扩展，发病到全果腐烂只需7 d(表1)，全果腐烂后有明显的香味(图1 A和C).接种PI菌柑橘果实的典型发病症状为：发病初期表皮出现水浸渍，边缘为不整齐白色霉层，表面干燥，随着发病时间延长，染病部位中间逐渐出现扩展速度较慢蓝色霉层，发病到全果腐烂需要13 d(表2)，全果腐烂有浓重霉味(图1 B和D).表1 PD致病力检测结果Tab.1 Results of the pathogencity measurement of PD时间/d1234567直径/mm41033.350809698发病率/%06.653.393.3100100100表2 PI致病力检测结果Tab.2 Results of the pathogencity measurement of PI 时间/d12345678910111213直径/mm4.011.615.632.640.349.852.154.361.266.479.783.098.0发病率/%06.67073.092.396.696.61001001001001001002.2 致病真菌形态学特征在菌落生长初期，PD边缘出现生长速度较快的白色绒毛.随着时间推移，菌丝中部逐渐出现绿色霉层，宽度为9～15 mm，菌落边缘的白色绒毛生长速率出现差别，整个菌落表面干燥，呈粉粒状，有特殊香气(图2A).显微镜下分生孢子的形态为：分生孢子梗无色、较短，帚状枝较大，小梗稍宽，顶端尖细，分生孢子串生，单孢无色，卵圆或椭圆形，大小在3.93～5.2 μm×5.24～6.55 μm之间(图2C).与PD不同的是，生长初期的PI边缘处白色绒毛较为稀疏，菌落宽度在3～15 mm之间.生长一段时间后，菌落逐渐转为蓝色，基质变暗略显灰绿色，菌落上有少量突起的气生菌丝，边缘不整齐，菌落干燥疏松，成粉粒状，有霉味(图2B).显微镜下可观察到无色的分生孢子梗，且分生孢子梗呈扫帚状，有两个分支，小梗顶端尖细，分生孢子串生，单孢无色成不规则的椭圆形，大小在3.4～5.24μm×3.93～6.5 μm之间(图2D).由致病力结合形态学特征可基本确定[5,9]：PD和PI分别为指状青霉(Penicillium digitatum)和意大利青霉(Penicillium italicum).2.3 致病菌的基础生物特性观察2.3.1 致病菌的最适生长温度由图3可知：温度较高或较低均能影响两株致病菌的生长，当温度为35 ℃时，PD和PI菌丝体生长受到明显抑制.PD菌丝体生长最适温度为25 ℃，而PI菌丝体生长的最适温度为20 ℃.2.3.2 致病菌的致死温度培养3 d后，-20 ℃，0 ℃，20 ℃，40 ℃条件下处理10 min后的PD和PI菌落数没有明显差异，60 ℃处理后菌落数明显减少.两株青霉菌在80 ℃处理后，无菌落长出.通过进一步研究表明：PD经过65 ℃处理后长出了3个菌落，经过70 ℃处理后无菌落长出；PI经75 ℃处理后长出了1个菌落，经过80 ℃处理后无菌落长出.故PD的致死温度为70 ℃左右，PI致死温度为80 ℃左右.2.3.3 致病菌的最适pH 由图5可知，pH在2.0～12.0之间PD和PI菌丝体均可以生长，PD菌丝体生长的最适pH为 7.0，PI菌丝体最适生长pH 为10.0.当pH为4.0～9.0时，PD和PI菌丝体生长直径范围分别为1.96～2.37 cm和2.08～2.35 cm之间，且变化幅度不大.强酸和强碱性的培养基对PD和PI菌丝体生长有一定的抑制作用，当pH为12.0时，PD菌丝体直径达到最小值1.13 cm.3 讨论了解和掌握各种病害病原菌的基础生物学特性，是防治果蔬采后病害的前提.指状青霉和意大利青霉是国内外大多数学者公认的柑橘采后致病菌，其专一寄主为柑橘，对其他水果无致病力[9～12].本研究从腐烂的宫川果实表面分离得到两株致病真菌，通过形态学特征比较结合致病力检测可基本确定为指状青霉(Penicillium.digitatum)PD和意大利青霉(Penicillium italicum)PI.接种指状青霉PD的柑橘果实从发病到全果腐烂只需要7 d，致病力稍强于从椪柑果实表面分离得到的指状青霉菌株[9]；而接种意大利青霉PI的柑橘果实全部腐烂需13 d.两株致病真菌的基础生物学特性表明：意大利青霉PI致死温度为80 ℃，略高于指状青霉PD致死温度(70 ℃)，这一结果与前人关于意大利青霉比指状青霉更耐高温的报道一致[13].与前人相关报道相似[9,14,15]，指状青霉的生长要略强于意大利青霉，且指状青霉PD菌丝体生长最适温度为25 ℃，最适pH 7.0；意大利青霉PI菌丝体生长的最适温度为20 ℃，最适pH 10.0.本研究分离得到的指状青霉菌株PD和意大利青霉菌株PI，可为研究柑橘采后绿霉和青霉病害的发生和防控提供研究材料.参考文献[1] SMILANICK J L, MANSOUR M F, MARGOSAN D A, et al. Influence of pH and NaHCO3 on effectiveness of imazalil to inhibit germination of Penicillium digitatum and to control postharvest green mold on citrusfruit[J]. Plant Dis, 2005, 89(6): 640-648.[2] 吕庆,徐志德,夏金初. 柑桔贮藏期病害及药剂防腐保鲜技术研究[J].湖南农业科学，2000，4：44-45.[3] 孙萍. 粘红酵母对柑橘采后病害的生物防治及其防治机理的研究[D].杭州：浙江大学，2003.[4] WURYATMO E, KLIEBER A, SCOTT E S. Inhibition of postharvest pathogens by vapor of citral and related compounds in culture [J]. J Agric Food Chem, 2003, 51(9): 2 637-2 640.[5] 陆宁海,徐瑞富,吴利民,等. 柑橘青霉菌侵染条件及致病性研究[J].福建果树, 2005, 132(1): 6-8.[6] 陈丽锋,邓伯勋,闵晓芳,等. 柑橘黑色蒂腐病菌的分离鉴定及生物学特性[J].植物保护，2007,33(6)：48-51.[7] 周德庆. 微生物实验手册[M].上海:上海科学技术出版社，1986：258-267.[8] 魏景超. 真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社，1979：501-502.[9] 闵晓芳. 柑橘采后致病青霉的分离鉴定及其生物学特性研究[D].武汉:华中农业大学，2007.[10] TRIPATHI P, DUBEY N K. Exploitation of natural products as an alternative strategy to control postharvest fungal rotting of fruit and vegetables[J]. Postharvest Biol Tec, 2004, 32(3): 235-245.[11] REUTHER W, CALAVAN E C. The Citrus Industry[M].Berkeley, USA：University of California Press, 1989：179-260.[12] STANGE R R, MIDLAND S L, SIMS J J, et al. Differential effects of citrus peel extracts on growth of Penicillium digitatum, P. italicum, and P. expansum[J]. Physiol Mol Plant P, 2002, 61(5): 303-311.[13] 闵晓芳,陈丽锋,邓伯勋. 柑桔青绿霉病病原菌的分离及其生物学特性研[J].中国南方果树,2007, 36(3):11-14.[14] 曹若彬. 果树病理学[M].3版.北京:中国农业出版社, 2001.[15] 闵晓芳,邓伯勋,陈丽锋,等. 柑橘采后致病青霉的鉴定[J].果树学报, 2007, 24(5):653-656.。

柑桔皮内生真菌的分离及其代谢产物抑菌研究

柑桔皮内生真菌的分离及其代谢产物抑菌研究实验将以桔子的皮为材料,探讨桔皮内生真菌的分离方法、菌种鉴定及其代谢产物粗提物的体外抗真菌、抗氧化活性,为进一步深入研究柑橘内生真菌及其代谢产物的活性提供依据。

标签：柑橘；内生真菌；抗菌活性柑桔是一种重要的经济作物,其世界年产量已超过葡萄和香蕉达一亿多吨而跃居水果首位。

中国的柑桔产量居世界第一,超过了一千万吨。

柑橘内生真菌的种类、数量较多,且柑橘内生真菌在柑橘器官中的分布差异比较大。

在果皮中出现的频率分别是64.35%,也算比较大了,本实验以桔子的皮为材料,探讨桔皮内生真菌的分离方法、菌种鉴定及其代谢产物的抑菌研究,对本地柑橘的内生真菌有一个初步研究,为进一步深入研究柑橘内生真菌及其代谢产物的活性提供依据。

1 实验1.1 实验准备（1）材料：长江大学西校区校园内的柑橘树的果皮。

（2）培养基：改良马铃薯蔗糖培养基（PSA），马铃薯蔗糖培养基中加入2%的柑橘树皮浸汁（树皮200g,洗净,削成小块,加水煮沸30min,过滤用自来水定容至1L）配置（0.1%链霉素）；（3）查氏培养基：NaNO3 2g,K2HPO4 1g,KCl 0.5g,MgSO40.5g,FeSO4 0.01g,蔗糖30g,琼脂15g,水1000 mL；（4）促孢培养基：KH2PO4 1g,KNO3 1g,MgSO4.7H2O 0.5g,KCl 0.5g,淀粉0.2g,葡萄糖0.2g,蔗糖0.2g,琼脂15g,水1000 mL；（5）发酵培养基：蛋白胨10g,酵母浸膏10g,葡萄糖40g,水1000mL；（6）肉汤培养基：牛肉膏3g,蛋白胨10g,氯化钠5g,蒸馏水1000mL,pH7.4～7.6（7）供试菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,黑曲霉（Aspergillus niger）。

1.2 方法（1）取样:实验前取不同大小不同成熟程度的橘子,每一种的桔子的桔皮取样若干段（片或个）。

柑橘(福橘)健康植株叶、茎、根部位内生菌脂肪酸生物

柑橘（福橘）健康植株根、茎、叶部位内生菌脂肪酸生物标记的分布特性郑雪芳、刘波*、阮传清、林营志、肖荣风、朱育菁、范国成、蔡子坚（福建省农业科学院柑橘黄龙病研究中心）摘要：对柑橘（福橘）的根、茎、叶进行磷脂脂肪酸（PLFA）测定和分布特征分析。

结果表明：从柑橘植株体内检测到大量的PLFA，其中指示细菌的16:0脂肪酸生物标记量最大，指示放线菌的10Me 17:0次之，指示真菌的18:3ω6c(6,9,12)生物标记量最小。

福橘不同部位内生菌的分布量不同，表现为叶片内生菌分布量最大，其次是根，茎部最少的规律。

福橘植株体内优势微生物种群为指示细菌的16:00、指示真菌的18:1 w5c和指示嗜热解氢杆菌18:00，其中生物标记16:00和18:1 w5c在福橘健叶分布量最大，生物标记18:00在福橘健根分布量最大。

关键词：柑橘；内生菌；PLFA；分布1 材料与方法1.1 供试材料供试柑橘品种为福橘，种植于福建福州晋安区柑橘品种改良试验场，采集福橘健康植株和黄龙病发病株的根、茎、叶（图1），贮存于4℃冰箱备用。

图1 福橘健康植株1.2柑橘内生菌脂肪酸生物标记分析方法柑桔植株内生菌PLFA的提取步骤如下：称取10g柑桔植株不同部位（根、茎、叶）于研钵中，用液氮研磨成粉状，装入50mL离心管中，加入20 mL 0.2mol·L-1的KOH甲醇溶液，充分混匀，斡旋样品5min，100℃水浴10min（此过程为避免管内液体沸出，可先不盖离心管盖子，用保鲜膜封住管口）；加入3 mL 1.0 mol·L-1的醋酸溶液中和pH值，充分摇匀；加入10 mL正已烷，充分摇匀，在2000r·min-1条件下离心15min，将上层正己烷相转入干净玻璃试管中，吹干；加入0.6mL体积比为1:1的正已烷:甲基叔丁基醚溶液，充分溶解，转入GC小瓶，用于脂肪酸测定。

PLFA成份采用美国Agilent6890N型气相色谱仪测定。

腐烂柑橘中两株细菌的分离与鉴定

腐烂柑橘中两株细菌的分离与鉴定
阎春兰;李超吉
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2010(49)4
【摘要】以腐烂的柑橘为材料,分离纯化得到两株致病的细菌.根据菌株的形态特征并结合16S rDNA序列比对分析,确定两株细菌分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus).与此同时对两株细菌的生长曲线、抗生素抗性进行测定,以期为柑橘由细菌导致的病害的防治提供理论基础.
【总页数】3页(P879-881)
【作者】阎春兰;李超吉
【作者单位】中南民族大学微生物与生物转化重点实验室,武汉,430074;中南民族大学微生物与生物转化重点实验室,武汉,430074
【正文语种】中文
【中图分类】S666;Q93-331
【相关文献】
1.半夏块茎腐烂病原细菌拮抗菌的分离与鉴定 [J], 张洁;胡琨敏;李玉权;任建国;任春丽;刘红美
2.两株啤酒生产线中易污染细菌的分离与鉴定 [J], 郭延志;提婕;艾桂花;郭道森;李荣贵
3.眶下窦炎肉鸡两株少见细菌的分离与鉴定 [J], 陈明非;李巍;杨卓
4.陇南核桃腐烂病一株伴生细菌的分离与鉴定 [J], 王瀚;卓平清;王让军;王明霞
5.龙眼采后腐烂相关细菌与真菌的分离与鉴定 [J], 唐建阳;车建美;刘波;王国芬因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

柑桔果醋酿造用菌种分离及其生产性能测定

柑桔果醋酿造用菌种分离及其生产性能测定刘青娥;钟仙龙【摘要】为筛选出适于柑桔果醋酿造的专用菌种,提高果醋品质,以自然酸发酵的柑桔醋液为菌源,利用钙平板筛选性能优异的醋酸菌,并对其进行鉴定及产酸量、产酯量、耐酒精度、耐温性能和稳定性等性能指标检测.结果共筛选出41株醋酸菌,其中ZY.C4和ZY.A5菌株产酸量较高,经鉴定分别为苹果醋杆菌(Acetobacter malorum)和恶臭醋杆菌(Acetobacter rancens),均不产生肠毒素.ZY.C4菌株的产酸产酯能力、耐温性能和耐酒精能力均优于ZY.A5菌株和对照菌株沪酿1.01,其最适发酵时间为5d,最佳发酵温度为31℃,最适初始酒度为7％;传代5次性能稳定,适合于柑桔果醋酿制.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2015(042)020【总页数】6页(P80-85)【关键词】柑桔果醋;发酵;菌种分离;生产性能【作者】刘青娥;钟仙龙【作者单位】丽水学院生物系,浙江丽水323000;丽水学院生物系,浙江丽水323000【正文语种】中文【中图分类】TS264.2柑桔果醋是以新鲜、成熟的柑桔类水果为原料，经酒精发酵和醋酸发酵工艺生产而成的一种营养丰富、风味优良的酸味饮料，内含丰富的有机酸和维生素，具有消暑解渴、消除疲劳、美容养颜、增进食欲、解酒保肝、防腐杀菌等保健功效，适用于多种疾病的食疗，尤其对高血压、冠心病、动脉硬化等心血管疾病具有良好的治疗和预防作用［1-2］。

优良的果醋菌种是影响果醋品质的重要因素之一，其性能的优劣对醋酸发酵过程中的产酸浓度以及产酸速率起着决定性的作用。

然而，当前我国果醋生产中，纯种培养的醋酸发酵菌种不多，常用的仅有食醋菌种AS1.41恶臭醋酸杆菌浑浊变种和沪酿1.01醋酸杆菌。

研究表明，醋酸菌AS1.41并不适合液体深层培养，若将其应用于果醋生产方面，不仅产酸能力不理想，耐酒精能力也都有待提高［3］。

至于沪酿1.01醋酸杆菌，虽然其产酸速度快，酒精转酸率平均可达93.84%，但其特异性不强，且发酵果醋形成的风味也不佳［4］。

一株寄生柑橘介壳虫真菌的分离与鉴定

ＩｏａｏｎｄｎｆａｉｎｏａａｉｃＦｎｕｆＣｉＪＳＳａｅＩｓｃｓｓｌｔｎａｄＩｅｆｉｔｆａＰｒｓｔｕｇｓｏｔＵｃｌｎｅｔｉｉｅＺｈｎ－ｏｇＭｉ
ＫｅｙｗｏｄｃｔｓＳａｅｉｓｃｓＮｉｒｓｏａｓｈｅｉａＳｃ）ｓｎｒｓｉ；Ｃｎｅｔ；ｇｏｐｒｐａｒ（ａｃＭａｏｕｒｌｃ
柑橘为柑橘亚科（ｒｎｉｉｅｅ柑橘属（ｉｕ）树，Ａｕａｔｄａ）ｏＣｔｓ果ｒ柑橘亚科各属原产于亚洲、洋洲及非洲的热带、热带地大亚区。已成为世界主栽果树之一，是我国南方的主要种植现也果树之一【柑橘介壳虫是近年来柑橘上曰益猖獗的害虫之Ｉ】。
果在Ｇｎａｋ数据库（ｗ．ｃｉｌｎｈｇｖ中进行ＢＡＴｅＢｎｗｗｎｂ．ｍ．．）ｎｉｏＬＳ
比对分析。１５病原菌的生物学特性研究．
，
严重威胁着柑橘生产『随着杀虫剂广泛、量及不合２卅。大
ｗｉｈｎ２３Ｃ，ｉｅ２３ＣｓｔｅｏｔｍｕｔｍｐｒｔｒｏｏｏｙｇｏｈＦｕｇｎｔｅｃｌｕｅｍｅｉｔｉ０－５ｏｗｈｌ５－０ｏｗａｈｐｉｍｅｅａｕｅｆｒｃｌｎｒｗｔ．ｎｉｉｈｕｔｒｄｕｍｔｔｒｈａｈａｂｎｓｕｃｄｗｉｈｓａｃｔｅｃｏｏｒｅｍａｅｓｒ

柑橘绿霉病拮抗菌的分离筛选及其产物特性研究

柑橘绿霉病拮抗菌的分离筛选及其产物特性研究指状青霉Penicillium digitatum)引起的柑橘绿霉病(Citrus green mold)是柑橘采后贮运过程中最严重的病害之一,病原菌能产生大量易扩散的分生孢子,使病害的传播十分迅速,在生产中造成了严重的损失。

为获得对柑橘绿霉病有防治作用的拮抗菌,以指状青霉为指示菌,采用琼脂块对峙培养法从柑橘根系土壤中分离出414株细菌和58株放线菌,其中菌株X33抑菌活性最强。

以菌株X33为研究对象进行了深入的研究,其结果如下：(1)根据培养特征观察、显微形态观察和16SrDNA序列分析等方法的鉴定,确定菌株X33为淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendulae)。

目前国内外尚未见有用淡紫灰链霉菌来防治柑橘绿霉病的报道。

(2)采用逐步筛选法和单因素试验优化淡紫灰链霉菌X33抑菌活性物质合成和菌体生长的培养基及培养条件。

筛选得到的发酵培养基为：可溶性淀粉20.0 g/L,牛肉膏3.0 g/L,蛋白胨5.0g/L,KNO31.0g/L, K2HPO40.5g/L, NaCl 5.0 g/L。

试验获得的适宜发酵条件为：30mL/250mL装液量,按9%的接种量接入48h种子液,先在32℃、200r/min培养48h,然后在28℃、180r/min培养24h。

(3)对淡紫灰链霉菌X33抑制指状青霉的的作用机理进行了初步研究,表明淡紫灰链霉菌X33产生的抑菌活性物质对指状青霉的菌丝有致畸、溶解的作用,能显著抑制分生孢子梗的生长和分生孢子的产生,延缓分生孢子的萌发。

(4)用杯碟法研究淡紫灰链霉菌X33发酵液对细菌、酵母菌抑制作用,用菌丝生长速率法研究淡紫灰链霉菌X33发酵液对植物病原真菌的抑制作用。

结果表明其发酵液对供试的3种革兰氏阳性细菌、3种革兰氏阴性细菌、4种酵母菌和7种植物病原真菌均具有显著的抑制效果,其中对白地霉的抑制效果最好,相对抑制率达到了100%。

黄龙病柑橘内生菌16SrDNA的提取及分析

１．２方法１．２．１叶片预处理
柑橘黄龙病（ＣｉｔｒｕｓＨｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ，ＣＨＬＢ）是严重影响全世界柑橘生产的一种毁灭性病害，在我国及东南亚、非
洲、阿拉伯半岛、印度、巴西和美国佛罗里达洲等地区均有严重发生，给柑橘产业造成巨大损失，有效控制该病危害是
组织中的内生细茵优势茵群存在明显差异，而伴生细茵的优势茵群与黄龙病茵的相互关系正在深入分析研究。
关键词：柑橘黄龙病；内生细茵；１６ＳｒＤＮＡ；鉴定中图分类号：￥６６６文献标识码：Ａ
我国是世界第二大的柑橘生产国，肇庆是广东省的柑橘生产第一大市，柑桔年产量达到５７—６ｏ万ｔ。肇庆砂糖桔是
段，同时在不同的菌株间也含有变异的核酸片段。其既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术快速得到核酸序
列，因此可以利用恒定区序列设计引物将１６ＳｒＲＮＡ片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定，该方法在原核生物的鉴定和分析方面具有着重要地位［４ｌ。
柑橘生产中迫切需要解决的问题。在我国，该病主要分布在南方柑橘产区… １。关于柑橘黄龙病的病原目前仍不甚清楚，有报道推测为类细菌（Ｂａｃｔｅｉｒａｌ —ｌｉｋｅＯｒｇａｎｉｓｍｓ，ＢＬＯｓ）Ｌ２ｊ，
序列如下：
３４１Ｆ：５一ＣＣｒＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ一３

柑橘内生细菌的分离与鉴定

菌体杆状，１．９４μｍ×０．５８μｍ；革兰氏阳性；周生鞭毛；无芽孢；无荚膜；菌苔白色，半透明；不产气。
菌体杆状，１．８４μｍ×０．７６μｍ；革兰氏阴性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明；产气。
菌体杆状，１．８４μｍ×０．６μｍ；革兰氏阴性；鞭毛偏单生；无芽孢，无荚膜；菌苔浅黄色，半透明；不产气。
菌体杆状，２．５４μｍ×０．７２μｍ；革兰氏阴性，周生鞭毛，无芽孢，无荚膜；菌苔白色，不透明；不产气。
菌体杆状，１．５２μｍ×０．４２μｍ，革兰氏阴性；鞭毛偏单生；无芽孢；无荚膜；菌苔浅黄色，透明；不产气。
菌体杆状，１．０６μｍ×０．５μｍ；革兰氏阴性；鞭毛偏单生；无芽孢，无荚膜，菌苔白色。
对柑橘５种器官的分离结果表明，不同器官中柑橘内生细菌出现的频次不同，根＞主干树皮＞枝条＞叶片＞果实；不同的柑橘内生细菌在不同的器官中出现的频次不同，气芽孢杆菌属（Ａｅｒｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）、芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）、乳杆菌属（Ｌａｃｔａｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）只在地上器官中出现，土壤杆菌属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）只在地下根中出现，气单胞菌属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓｓｐｐ．）、黄单胞杆菌属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓｓｐｐ．）、假单胞杆菌属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｐｐ．）在根及枝条中均分离到，但均以根中出现的频次较高。
摘要：从湖南省石门县园艺场采集到的柑橘材料中，得到柑橘内生细菌分离物７５份，经鉴定，分别属于

柑橘果实的微生物负载与微生物学研究

柑橘果实的微生物负载与微生物学研究柑橘是一种常见且广泛种植的水果，具有丰富的维生素C和矿物质，具有很高的营养价值。

然而，柑橘果实在生长和储存过程中容易受到微生物的污染和感染，导致品质下降和腐烂。

因此，研究柑橘果实的微生物负载和微生物学特性对于提高柑橘的质量和延长其保鲜期具有重要意义。

首先，柑橘果实的微生物负载是指存在于柑橘果实表面或内部的微生物群落。

这些微生物可以包括细菌、真菌和酵母等。

柑橘果实在生长过程中会与环境中的各种微生物接触，这些微生物可以通过风、水、昆虫或施肥等途径进入果实表面。

此外，柑橘果实内部也可能存在着各种微生物，例如腐败微生物和潜伏性病原体等。

为了研究柑橘果实的微生物负载，科学家们通常采用微生物学方法来分离和鉴定其中的微生物。

最常用的方法是进行微生物培养和收获菌落，然后通过形态学和生理生化特性的分析来鉴定微生物。

此外，还可以利用分子生物学技术，如16S rRNA基因测序和ITS序列分析，对柑橘果实中的微生物进行深入研究和分类。

研究表明，柑橘果实的微生物负载具有多样性和复杂性。

细菌是柑橘果实中最常见的微生物类型，主要包括芽孢杆菌、假单胞菌、肠杆菌科和乳酸杆菌等。

真菌和酵母也是柑橘果实中常见的微生物类型，主要包括镰刀菌、黑果霉和酵母菌等。

这些微生物的存在可能是由果实生长过程中的环境因素和微生物间的相互作用所致。

柑橘果实的微生物学研究不仅关注微生物的种类和数量，还研究微生物对柑橘果实品质和储存寿命的影响。

研究发现，柑橘果实表面的微生物可以通过分泌酶类和代谢产物的方式引起果实腐烂和变质。

例如，一些细菌和真菌会分泌腐败酶和淀粉酶，导致果实软化和变色。

此外，微生物还可以通过与果实细胞的互作促进果实的成熟和衰老过程。

除了对果实品质的影响，柑橘果实的微生物还对人体健康具有一定的影响。

一些微生物可能是人体致病菌的潜在来源，如沙门菌和大肠杆菌等。

因此，在柑橘果实的生产和销售中，对微生物污染和食品安全的控制非常重要。

HLB感染柑桔韧皮部内生细菌区系的研究

重庆大学硕士学位论文HLB感染柑桔韧皮部内生细菌区系的研究姓名：王爱华申请学位级别：硕士专业：生物学指导教师：王中康2010-04摘要柑橘是世界上产量最大的水果，巴西是世界上产柑橘最多的国家，其次是中国、美国、墨西哥和西班牙。

柑桔黄龙病（Citrus huanglongbing，HLB）是由难人工培养的韧皮杆菌（Cndidatus Liberibacter asiaticus）引起的柑桔毁灭性病害。

目前还没有获得该病原菌的纯培养。

新近的分子鉴定结果表明黄龙病罹病组织内除存在韧皮杆菌外，还存在其它致病微生物：植原体或伴生微生物，并认为其可能是黄龙病植株症状表现复杂多样的内在原因。

本研采用常规分离培养技术与分子鉴定以及基于16S rDNA基因的RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism）法，对柑桔黄龙病植株和健康植株的韧皮部内生菌区系进行比较分析，为研究柑橘植株韧皮部内生细菌与黄龙病菌之间的相互关系奠定基础。

利用分离培养的方法，根据菌落形态以及菌体形态共分离到21株柑桔韧皮部内生细菌，对21株内生细菌进行形态和生理生化测定。

经形态学鉴定和序列比对：菌株WJ01，WJ02，WJ03，WJ05，WJ08，WJ12，WJ13，WJ16，WJ17，WJ18，WJ21为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），WJ04和WJ14为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），WJ06为葡萄球菌属（Staphylococcus sp.），WJ10为考克氏菌（Kocuria sp.）。

其中鉴定到种的部分菌株：WJ07：约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii）、WJ09：粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）、WJ11：乳杆菌属草乳杆菌（Lysinibacillus graminis）、WJ15：微球菌属栖息微球菌（Miccrococcus sedentarius）、WJ19：产左聚糖微杆菌（Microbacterium laevaniformans）、WJ20；极小短小杆菌（Curtobacterium pusillum）的特征。

一株寄生柑橘介壳虫真菌的分离与鉴定

一株寄生柑橘介壳虫真菌的分离与鉴定董章勇;罗梅【摘要】从感病柑橘介壳虫中分离和鉴定了一株菌株,为球黑孢霉菌[Nigrospora sphaerica（Sacc）Mason]。

菌株在20~35℃范围内均能生长,25~30℃是菌落生长的最适温度区域。

病菌在以淀粉为碳源的培养基上菌丝生长量较大,且菌丝生长丰度高。

该菌对果糖、麦芽糖、乳糖、淀粉和葡萄糖为碳源的培养基的利用率均较高。

该菌在以硫酸铵为氮源的培养基上菌丝生长量较大,其次是硝酸铵、甘氨酸和赖氨酸。

%A strain of Nigrospora sphaerica（Sacc）Mason was isolated and identified from susceptible citrus scale insects.Strains could grow within 20~35 ℃,while 25~30 ℃ was the optimum temperature for colony growth.Fungi in the culture medium with starch as the carbon source made mycelial growth in large quantities,and the mycelium was thick.Fungi on fructose,maltose,lactose,starch and glucose as carbon source utilization of the medium were high.Ammonium sulfate as the nitrogen source of bacteria in the large amount of mycelial growth medium,followed by ammonium nitrate,glycine and lysine.【期刊名称】《现代农业科技》【年(卷),期】2012(000)016【总页数】2页(P163-164)【关键词】柑橘;介壳虫;球黑孢霉菌【作者】董章勇;罗梅【作者单位】仲恺农业工程学院,广东广州510225;仲恺农业工程学院,广东广州510225【正文语种】中文【中图分类】S476.9柑橘为柑橘亚科（Aurantioideae）柑橘属（Citrus）果树，柑橘亚科各属原产于亚洲、大洋洲及非洲的热带、亚热带地区。

柑桔皮内生真菌的分离及其代谢产物抑菌研究

柑桔皮内生真菌的分离及其代谢产物抑菌研究作者：熊启杰来源：《现代商贸工业》2011年第05期摘要：实验将以桔子的皮为材料,探讨桔皮内生真菌的分离方法、菌种鉴定及其代谢产物粗提物的体外抗真菌、抗氧化活性,为进一步深入研究柑橘内生真菌及其代谢产物的活性提供依据。

关键词：柑橘；内生真菌；抗菌活性中图分类号：S7 文献标识码：A文章编号：1672-3198（2011）05-0291-01柑桔是一种重要的经济作物,其世界年产量已超过葡萄和香蕉达一亿多吨而跃居水果首位。

中国的柑桔产量居世界第一,超过了一千万吨。

柑橘内生真菌的种类、数量较多,且柑橘内生真菌在柑橘器官中的分布差异比较大。

1 实验1.1 实验准备（1）材料：长江大学西校区校园内的柑橘树的果皮。

一株柑橘采后酸腐病菌的分离与鉴定

ｐＨｒａｎｇｅｂｅｔｗｅｅｎ４．０ａｎｄ５．０；ｔｈｅ１ｃｔｈａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ８５。Ｃ．ＩｎａｄｄｉｔｉｏｎＩｔｈｅｍｙｃｅｌｉｕｍｇｒｏｗｔｈｏｆＧＣｗａｓｕｎａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｌｉｇｈｔｉｎｇ．
光照对菌丝体生长作用不明显．
关键词：柑橘；酸腐病；酸腐病菌；鉴定；生物学特性
中图分类号：ＴＰ３９１．４１文献标识码：Ａ文章编号：１０００—５９００ｌ２０１３）Ｏ１— ００９２— ０５
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａＳｏｕｒＲｏｔｏｆＣｉｔｒｕｓＦｒｕｉｔｓ
ＺＨ０Ｕ１ｔａｉ — ｅｌ１．ＴＡ０Ｎｅｎｇ — ｇｕｏ ’ｌｊＩＡＬｅｉ
ａｎａｌｙｓｉｓ。ＧＣｗａｓｉｎｄｅｎｔｉｉｅｆｄａｓＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍｃｉｒｒｉ — ａｕｒａｎｔｉｉ．ＴｈｅｂａｓｉｃｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＧＣｗｅｒｅｌｆＳｆｏｌｌｏｗｓ：ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｏｒｔｈｅｍｙｃｅｌｉｕｍｇｒｏｗｔｈｗａｓ２８。Ｃ；ｔｈｅｍｙｃｅｌｉｕｍｇｒｅｗｖｉｇｏｒｏｕｓｌｙａｔａ

HLB菌影响柑橘内生细菌及柑橘木虱肠道内生细菌的转录组分析

摘要摘要亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri Kuwayama），是至今为止众所周知传播黄龙病菌（严重威胁全球柑橘产量的病害之一）的自然虫媒之一，因此防控柑橘木虱有助于阻止黄龙病蔓延。

这几年来，越来越多研究关注黄龙病菌的入侵如何引起寄主植物与宿主昆虫微生物组成的变化。

然而，由于大多数昆虫和植物内生细菌群落的分离和培养困难，阻碍了相关的研究，随着Illumina测序的发展上述问题逐步得到解决。

柑橘-黄龙病菌-木虱相互作用发生在一个复杂的微生物群落系统中。

目前大多数研究集中在HLB菌与木虱肠道微生物的相互影响或HLB菌如何影响宿主柑橘内生微生物，但少之将这两者集中统一起来比较。

因此本论文构建了柑橘-黄龙病菌-木虱肠道相互作用模型，利用Illumina Mi Seq测序研究分析HLB菌对木虱肠道细菌种群的影响和宿主柑橘不同组织（叶片、韧皮部）的细菌种群组成和数量变化。

为以后筛选柑橘黄龙病生防菌进行生物防治提供理论基础。

主要研究结果如下：1）韧皮部和叶片各组样品OTU数目分布在40-145之间，而根部样品OTU 数目在500以上。

每个组织健康组和患病组的OTU数目差别水平有限，而不同组织的OTU数量差异相对显著；2）实验室培养的木虱其肠道组样本OTU数目分布在38-62之间，柑橘野外木虱其肠道组样本OTU数目分布在60-71之间。

表明实验室培养木虱其肠道组样本与柑橘野外木虱其肠道组样本OTU数量差异相对不显著。

3）无论是Anosim组间差异分析还是MRPP组间差异分析可以看出柑橘四个不同组织样品组之间物种群落结构差异均达到极显著水平；不带HLB菌柑橘-带HLB菌柑橘的叶片、韧皮部各组间群落结构差异未达到显著水平；实验室培养的木虱其肠道与野外采集的木虱其肠道整体组间物种群落结构差异未达到显著水平。

4）叶片患病组Y3丰度显著较高的为黄龙病菌属，鞘氨醇单胞菌属，羊膜杆菌属；在健康组Y1丰度显著较高的属有弧菌属、鲁杰氏菌属；韧皮部患病组R3丰度显著较高的为黄龙病菌属、膜杆菌属、红球状菌属、嗜酸菌属、粘液杆摘要菌属。

柑橘内生真菌的分离与鉴定

柑橘内生真菌的分离与鉴定罗永兰;张志元;冉国华【期刊名称】《湖南农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2005(031)004【摘要】自2002-2004年,对广东梅州、重庆北碚、湖南石门的不同种类的柑橘(柑、橙、柚)进行了12次定点取样分离,共分离到柑橘内生真菌5 642株,其中有5 136株已鉴定,分别属于24个属.在这24个属中,出现频率在1%以上的只有Colletotrichum spp.,Fusarium spp.,Alternaria spp.,Penicillium spp..柑橘内生真菌的静息部位依种类而异,Colletrichum spp.主要分布在柑橘的叶片、枝条、果皮内;Fusarium spp.则主要分布在根中.【总页数】4页(P418-421)【作者】罗永兰;张志元;冉国华【作者单位】长沙学院,生物技术研究所,湖南,长沙,410003;长沙学院,生物技术研究所,湖南,长沙,410003;湖南农业大学,生物安全科技学院,湖南,长沙,410128;湖南农业大学,生物安全科技学院,湖南,长沙,410128【正文语种】中文【中图分类】Q939.96【相关文献】1.西藏黄花蒿内生真菌分离与鉴定 [J], 张书航;刘欣瑜;黄恩霞;张雨;朱燕丽;刘奕伶;王敬龙;孙璐;路浩2.露蕊乌头内生真菌的分离与鉴定 [J], 刘欣瑜;赵宝玉;路浩;黄恩霞;张书航;张雨;朱燕丽;刘奕伶;王敬龙;孙璐;宋润杰3.东北红豆杉一株产三尖杉宁碱内生真菌Xylaria Primorskensis Y32的分离与鉴定 [J], 张智慧;郑文艺;崔海超;罗朝辉;袁肖寒;顾成波4.柑橘内生真菌的分离鉴定及其发酵产物对柑橘溃疡病菌的抑制活性 [J], 颜桢灵;陈洁萍;农小霞;李鑫;骆海玉;韦柳柳;阮家欢;关祥媛;陆莎5.披针叶黄华内生真菌的分离与鉴定 [J], 赵文星;吴可欣;郭梓豫;张云昊;唐丽辉;刘奕伶;莫重辉;赵宝玉;路浩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

柑橘青霉菌的分离鉴定与特性分析

柑橘青霉菌的分离鉴定与特性分析张翠香;李娜;李倩;刘婧;齐婷;袁永泽;刘德立【期刊名称】《华中师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(048)001【摘要】从发病柑橘表面分离得到了42株青霉致病菌,并分别扩增得到其rDNA转录间隔区序列(ITS).通过对rDNA ITS的生物信息学和系统发育分析,并结合菌落形态特征,这些菌株分别被鉴定为指状青霉(P.digitalum)、意大利青霉(P.italicum)、皮落青霉(P.crustosum)、小刺青霉(P.spinulosum)和草酸青霉(P.oxalicum).分析发现:这些致病菌呈现出明显的区域特异性.该方法可以快速、可靠的鉴定柑橘采后真菌病害,为有效防治提供一定理论依据和指导.【总页数】5页(P86-90)【作者】张翠香;李娜;李倩;刘婧;齐婷;袁永泽;刘德立【作者单位】云南大理学院基础医学院,云南大理671000;华中师范大学生命科学学院,湖北省遗传与调控重点实验室,武汉430079;云南红河学院生命科学与技术学院,云南蒙自661100;华中师范大学生命科学学院,湖北省遗传与调控重点实验室,武汉430079;华中师范大学生命科学学院,湖北省遗传与调控重点实验室,武汉430079;华中师范大学生命科学学院,湖北省遗传与调控重点实验室,武汉430079;华中师范大学生命科学学院,湖北省遗传与调控重点实验室,武汉430079;华中师范大学生命科学学院,湖北省遗传与调控重点实验室,武汉430079【正文语种】中文【中图分类】Q938【相关文献】1.臭氧对柑橘果实青霉菌的抑菌效果 [J], 秦文;彭春华;蒲彪;李素清;王天佑2.韭菜粗提取物对柑橘青霉菌的抑菌效果研究 [J], 毕璋友;吴惠君3.纳米硅对三峡库区柑橘青霉菌的药效试验 [J], 甘丽萍;李彦杰;杨波;杨容4.柑橘内生真菌的分离鉴定及其发酵产物对柑橘溃疡病菌的抑制活性 [J], 颜桢灵;陈洁萍;农小霞;李鑫;骆海玉;韦柳柳;阮家欢;关祥媛;陆莎5.费菜黄酮对柑橘意大利青霉菌抑制作用的研究 [J], 罗洁;王鸿飞;许凤;王靖;池宗豫;谢柯沁;吴承豪;邵兴锋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

柑橘炭疽病菌的分离、鉴定及在果实上的潜伏侵染特性

柑橘炭疽病菌的分离、鉴定及在果实上的潜伏侵染特性李菲菲;龙超安【期刊名称】《果树学报》【年(卷),期】2015(0)1【摘要】【目的】明确柑橘炭疽病原菌的种类及其潜伏侵染特性,为柑橘病害防控提供理论依据。

【方法】对采自湖北省3个地区的炭疽病样品进行病原菌的分离、形态学特征观察和致病性测定并采用r DNA-ITS序列分析法对代表菌株T4进行分子鉴定。

此外,通过组织分离法,研究炭疽病菌在柑橘花器和发育期果实上的潜伏情况。

【结果】获得的19株致病菌均为胶孢炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides),但菌株间的致病力存在明显差异;T4菌株的测序结果与NCBI已登录的胶孢炭疽菌序列(FJ459917.1,FJ459916.1)比对发现,一致性达100%。

柑橘炭疽病菌在花器和果实上的潜伏侵染呈一定的规律性:花器官中,花瓣的带菌率最高;果实上,果蒂和脐部带菌率最高,其次为果柄部位。

【结论】研究区域的柑橘花和果实均携带胶孢炭疽病菌,该病菌具有潜伏侵染的特性。

生产上要重视花期的病害防控,果实采后贮藏时需重视对果蒂部、脐部及果柄部位的消毒处理。

【总页数】8页(P108-114)【关键词】柑橘;炭疽病菌;致病性;r;DNA-ITS;潜伏侵染【作者】李菲菲;龙超安【作者单位】湖南省农业科学院园艺研究所;华中农业大学园艺林学学院.园艺植物生物学教育部重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S436.66【相关文献】1.红富士苹果果实中炭疽病病菌的分离与鉴定 [J], 陈汝;翟浩;聂佩显;薛晓敏;王贵平;王金政2.红富士苹果果实炭疽病病菌的分离与鉴定 [J], 陈汝;王金政;薛晓敏;王贵平3.不同地区潜伏侵染香蕉果实的炭疽菌生物学特性研究 [J], 刘秀娟;黄圣明4.蓝莓果实潜伏侵染病原真菌的分离与鉴定 [J], 秦士维;夏秀英;安利佳5.香蕉采后果实炭疽病菌的鉴定及其生物学特性 [J], 张德涛;高艳丽;黄永辉;杨媚;周而勋因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

不同柑橘品种耐冷内生菌的分离与初步鉴定

不同柑橘品种耐冷内生菌的分离与初步鉴定刘卫今;蒋向辉;黄勇;殷妮【摘要】柑橘内生菌资源很丰富,柑橘的冻害与病害的防治及果实品质跟内生菌有很大关系.通过对8个不同柑橘品种的组织表面消毒和耐冷处理,采用稀释涂布平板法与划线分离法,从中分离出8种耐冷内生菌.运用传统的分类鉴定方法,对分离到的耐冷内生菌进行了革兰氏染色、芽孢染色、运动性检查.得到了各耐冷内生菌的相关特征.【期刊名称】《怀化学院学报》【年(卷),期】2011(030)002【总页数】6页(P37-42)【关键词】柑橘;耐冷内生菌;分离与鉴定【作者】刘卫今;蒋向辉;黄勇;殷妮【作者单位】怀化学院,生命科学系,湖南怀化418008;怀化学院,民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室,湖南怀化418008;怀化学院,湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南怀化418008;怀化学院,生命科学系,湖南怀化418008;怀化学院,民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室,湖南怀化418008;怀化学院,湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室,湖南怀化418008;怀化学院,生命科学系,湖南怀化418008;怀化学院,生命科学系,湖南怀化418008【正文语种】中文【中图分类】Q93-331近几年来,植物内生细菌应用于植物病害防治方面的研究逐渐深入,已成为植物病害生物防治的主要药源之一[1]1植物内生细菌不仅将植物作为其栖息场所,而且对寄主植物有促生、防病、内生联合固氮等广泛的生物学作用,是植物病害生物防治、内生联合固氮菌筛选、诱导抗病性及转基因载体等功能的天然菌源,具有较高的理论研究价值和实际应用价值,已成为微生物学和植物学学科的研究热点1孔庆科等[2]认为:感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势,比未感染植株更具生存竞争力1在内生菌-植物宿主-食草动物生态系统中,植物内生菌扮演着前所未知的重要生态学作用1发挥这些作用的物质基础是内生菌产生的丰富多样的次生代谢产物,它们具有多种生物活性,在农业和医药业中具有重要的应用潜力1有关研究结果表明柑橘内生细菌资源丰富,而且多数对植物病原真菌具有一定的拮抗作用,可作为生物防治的资源进一步用于防病和保鲜1郑重禄等[3]的有关试验虽然初步筛选出对柑橘炭疽病具有防治作用的内生菌,但对其定殖性和可用于防病保鲜的商品应用价值仍然有待深入研究11.1 实验材料在湖南省麻阳县园艺场的柑类、橙类、柚类中选8个代表种,即柑、脐橙、沙塘桔、金钱橘、沙田柚、血橙、葡萄柚、冰糖柑11.2 实验方法1.2.1 耐冷内生菌分离1.2.1.1 培养基制备分别制备牛肉膏蛋白胨培养基、LB液体培养基与固体培养基制备、高氏一号培养基11.2.1.2 取样在2008年冰灾中耐冷性表现较好的柑橘园中,采用5点取样法(东、南、西、北、中),每点选取供试树1株,取2个健壮、外观漂亮且果体中等以上的果实作为分离材料,每个品种取样10个样本,将所采样本分种类分别装入食品保鲜袋内带回实验室1 1.2.1.3 预处理取果实进行组织表面清毒,即用75%的酒精浸泡1 min,再用011%的升汞溶液浸泡5 min,无菌水洗3次,晾干,放入冰箱中经耐冷处理10 d之后从冰箱中取出,再进行表面消毒1实验中设立对照:吸取少量表面消毒中最后一次冲洗材料的无菌水,涂布于培养基上,经培养若无微生物长出,表明表面消毒彻底1取各品种柑橘6个经表面消毒后放入4℃冰箱中分别冷处理4、6、8、10、12、14d,取出后再次表面消毒,取中果肉分别培养在标号D4、D6、D8、D10、D12、D14的平板中,观察内生菌生长情况11.2.2 内生菌的纯化在超净工作平台上切取果实的果皮,果肉(1 cm ×1 cm),分别装入高氏一号、LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基平板上,置于28℃恒温培养箱中培养,待边缘长出细菌后,挑取不同形态的菌落,进行培养1继而通过多次平板划线得到单个菌株以后移入试管斜面保存11.2.3 菌落形态特征的观察将菌种接种于营养琼脂培养基,37℃培养48 h后,观察其在营养琼脂培养基上的生长情况,记录其菌落形态特征,再挑出菌株,进行革兰氏染色、荚膜观察、芽孢检查、运动性检查和需氧特征观察12.1 耐冷内生菌分离2.1.1 耐冷时间由表1可知不同柑橘品种冷处理的合适时间为:沙田柚和葡萄柚的冷处理14 d,其他柑橘品种的冷处理时间10 d较为合适12.1.2 不同分离方法效果比较2.1.2.1 通过稀释涂布平板法得到的内生菌分别为:从柑中分离出1号细菌;从脐橙中分离出2号细菌;从金钱橘中分离出4号细菌;从血橙中分离出6号细菌;从葡萄柚中分离出7号细菌;从冰糖柑中分离出8号细菌1 2.1.2.2 通过划线分离法得到的内生菌分别为:从脐橙中分离出2号细菌;从沙塘桔中分离出3号细菌;从沙田柚中分离出5号细菌;从血橙中分离出6号细菌;从葡萄柚中分离出7号细菌;从冰糖柑中分离出8号细菌1从表2的结果可知:稀释涂布平板法没有分离出3号和5号,平板划线分离没有分离出1号和4号,单凭一种分离方法不能达到完全分离的效果,需经两种或两种以上的方法才能分离出理想的内生菌12.1.3 分离结果由表3可知,在牛肉膏蛋白胨培养基平板上没有分离出4号和7号菌株,在LB培养基平板上没有分离出2号菌株,高氏一号培养基没有分离到任何菌株,这说明各细菌所需的营养条件不完全相同12.1.4 同种细菌在不同培养基上的生长情况比较2、5、6、8号细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上长势明显好于LB培养基,菌落较后者大,生长速度快11、3、4、7号细菌在LB培养基中长势较牛肉膏蛋白胨培养基好,菌落较大,生长速度快12.1.5 在柑橘不同部位内生菌的存在情况由表5可知在3号,4号,8号菌在果皮中没有出现,而在果肉中都有出现,原因可能是在样品表面消毒时果皮中内生菌已被杀死12.1.6 小结本试验从经耐冷处理后的果皮与果肉中分离出8种内生细菌,内生放线菌的分离培养比较困难,没有分离出真菌和放线菌12.2 耐冷内生菌的鉴定2.2.1 在营养琼脂平板上的生长情况从菌株在营养琼脂平板上的生长情况可知各菌株的菌落形态特征(见表6),1号、2号、7号、8号菌株的菌落形态基本相同,都为乳白色,表面凸起,呈奶油状,边缘整齐,粘稠,但是1号,和7号,菌落半透明,而2号和8号菌落不透明13号和5号菌株的菌落都为乳白色,表面凸起,呈奶油状,边缘不整齐,其中3号,菌株的菌落不透明,不粘,较为干燥,5号的菌落半透明,粘稠,较为湿润14号和6号菌株的菌落都呈灰白色,表面凸起,半透明,边缘不整齐,4号和6号菌株的菌落表面都不光滑,4号表面为绒毛状,相对较为湿润,粘稠,6号表面为纤毛状,干燥,不粘,且边缘呈锯齿状12.2.2 菌株的形态结构特征2.2.2.1 革兰氏染色结果据图2可知:3号和6号中的菌体被染成红色,其余图中菌体为深紫色1可见从普通甜橙和血橙中分离出来的菌株为G-菌外,从柑、脐橙、金钱橘、沙田柚、葡萄柚和冰糖橙分离出来的菌株全为G+1在观察菌体的革兰氏染色情况时,还观察到一些为空泡状构造1从1号、3号、6号、7号和8号中观察到的空泡状构造为椭圆形;从2号中观察到的空泡状构造呈柱圆形;从4号中观察到的空泡状构造为圆形;从5号中观察到的空泡状构造为卵圆形1可见1号、3号、6号、7号和8号菌株能盐成的芽孢呈椭圆形;2号和4号菌株的芽孢呈柱圆形;5号菌株的芽孢呈卵圆形1 2.2.2.2 荚膜染色结果通过荚膜染色后,可观察到1号、5号和8号菌株染色后可以观察到黑色的背景与红色的菌体之间衬托出了无色的一圈,镇1、5、8号菌株有荚膜,其他的菌株没有荚膜12.2.2.3 芽孢染色结果从革兰氏染色结果中可以观察到芽孢的存在,在芽孢染色中,可以更清楚的观察到芽孢的形态特征1通过对芽孢染色装片的观察可知:1号、3号、7号和8号菌株有膨大的孢囊,在膨大的孢囊内有椭圆形的芽孢;2号菌株芽孢为柱形;4号菌株芽孢为圆形;5号菌株的芽孢为卵圆形;6号菌株芽孢为椭圆形12.2.2.4 运动性检查通过运动性检查实验,可以观察到所有菌株的若干个菌体同时向不同方向运动,并且各运动菌体之间的距离不断发生变化,由此可见,从8中柑橘中分别分离出来的8种菌株都具有运动性12.2.2.5 需氧方式1号菌株在厌氧培养基上沿穿刺线生长良好,上部和下部生长一致,呈线状;2号菌株在厌氧培养基上沿穿刺线生长良好,上下部生长一致,呈线状;3号菌株在厌氧培养基上沿穿刺线生长良好,上下部生长一致,呈线状;4号菌株在厌氧培养基上,仅表面生长良好,下部不生长;5号菌株在厌氧培养基上沿穿刺线生长良好,上部和下部生长一致,呈线状;6号菌株在厌氧培养基上沿穿刺生长良好,上部和下部生长一致,呈毛绒状;7号菌株在厌氧培养基上,仅表面生长良好,下部不生长;8号菌株在厌氧培养基上,仅表面生长良好,下部不生长;由于1号菌株、2号菌株、3号菌株、5号菌株、6号菌株在经穿刺的半固体培养基上,上、下部生长一致,则提示这些菌株可能是兼性厌氧菌;4号菌株、7号菌株和8号菌株在经穿刺的半固体培养基上,上部生长好,下部基本不生长,则提示这些菌株可能为专性好氧菌12.2.6 小结根据以上实验结果,各耐冷内生菌形态特性总结如下表1运用传统鉴定方法鉴定(细胞形态、革兰氏染色、芽孢染色、鞭毛染色、运动性)得到了各耐冷内生菌形态特性特征,与《常见细菌系统鉴定手册》[4]所列的细菌菌株形态学和生理生化性状特征进行对比可知,从8种柑橘中分离出来的8种耐冷内生菌全都产生芽孢,为产芽孢细菌1由8种细菌在厌氧培养基中的生长情况可知此8种细菌为兼性厌氧菌或好氧菌,可知此8种细菌分别属于双芽孢杆菌属(Amphibacillus)盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、脂环酸芽孢杆菌属(Alicycobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、硫芽孢杆菌属(Sulfidobacillus)、芽孢杆菌属(Bacillus)这8个属14.1 关于内生菌分离方法目前植物内生菌分离方法大多数采用常规表面消毒法,本研究为确保所分离到的微生物为植物体内生菌,采用的表面消毒比一般组织培养消毒更为严格,并对所消毒材料冲洗后的最后一次无菌水进行涂板培养,如在2～3 d内没有菌落产生,则认为该材料消毒彻底,证明所分离到的为内生菌1但用此消毒方法也易于杀死植物体内微生物,因而所分离到的内生菌种类与数量可能比植物体内所含的要少1在进行内生菌分离的过程中,掌握适宜的材料消毒时间对最终分离到的内生菌的数量和种类都具有重要作用1耐冷时间的确定是根据各品种柑橘的果实大小,与果皮厚度不同来设的冷处理时间,冷处理的目的是从柑橘中筛选出优势的内生菌,以从一种柑橘中分离出1～2种内生菌为宜1不同分离方法达到的分离效果不完全相同,一种方法可能达不到完全分离的效果,该研究通过两种分离方法来进行分离,以达到互补的效果1在内生菌的分离过程中,所用培养基均为常规分离用的培养基,因而不能保证所有生活在柑橘果实内的微生物全被分离出来,可能有的微生物不能在人工培养基上生长1耐冷内生菌在不同培养基中的生长情况不净相同,有的在牛肉膏蛋白胨培养基上长势良好,在LB培养基上长势较差,有的则在LB培养基中长势良好,在牛肉膏蛋白胨培养基上长势较差1这是因为各种细菌所需的营养条件不相同,从而导致这种现象的产生1本研究从经耐冷处理后的果皮与果肉中分离出8种内生细菌,内生放线菌的分离培养比较困难,没有分离出真菌和放线菌,具体原因有待进一步研究1 412 关于内生菌鉴定传统的内生菌鉴定法以菌株的菌落形态(菌落颜色,表面特征……)、细菌形态、革兰氏染色、芽孢检查、荚膜染色等特征为依据来识别[5]1但由于传统鉴定方法存在项目众多、操作繁琐、需要分段进行、耗时长且存在一定的局限性等缺点,极有可能导致结果不准确,例如在培养基中不能形成孢子的真菌,必须采用其他方法进行检测和鉴定1并且内生菌长期处于共生生活中,会发生变异而失去典型特征,例如产生孢子的能力退化,只形成菌丝等,这样会导致其菌落形态等特征和典型菌株的差异存在[6],造成鉴定困难或结果不准确等1传统的分类鉴定不仅不能鉴定所有的内生菌,鉴定结果也肯可能出现一些偏差,虽然科技在不断进步,新的先进的鉴定方法也不断出现,但是传统的鉴定结果仍然是描述种属特征所必不可少的依据1植物内生菌分布广,种类多,据何美仙[7]等人的研究表明内生菌可增强宿主对病原细菌和真菌的抗性,保护宿主免受危害,对植物的生长发育具有重要的作用,感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势,比未感染植株更具生存竞争力1在内生菌——植物宿主——食草动物生态系统中,植物内生菌扮演着前所未知的重要生态学作用1植物内生菌的研究正蓬勃地开展起来,有着广阔的发展前景,但在研究和应用的过程中也显现出了如用于生物防治使周围环境及植物体的微生态环境都对内生菌的生长和作用的发挥存在影响,使防治效果不稳定;能产生有医疗作用的活性物质的内生菌往往培养成本高,活性物质产量低等一些问题1而且,目前植物内生菌的作用机理的研究也有待深化1植物内生菌相对来说开发较少、次生代谢产物丰富,合理开发利用植物内生菌资源,从内生菌中寻找新的活性代谢产物,将成为今后研究的重点1Abstract:The endogenous bacteria resources is very rich inCitrus reticulataBlanco1,Citrus reticulataBlanco1disease control is closely related to the fruit quality,and have very big concern with endogenousbacteria1By surface sterilization and cold treatment,we isolated eight cold resistant endogenous bacteria,the result display the bacterial species in diffferentCitrus reticulataBlanco1were different1Based on the main shape of colony and individual,and the physiology and biochemistry character of bacteria,the species of eight cold resistant endogenous bacterias were identified1Key words:Citrus reticulataBlanco1; Cold Endurance Endophytic; Isolation and Identification【相关文献】[1]刘云霞,张青文,周明胖,等.植物保护21世纪展望[M].北京:中国科学技术出版社,1998.[2]孔庆科,丁爱云.内生细菌作为生防因子的研究进展[J].山东农业大学学报(自然科学版),2001,32(2): 256-260.[3]郑重禄.柑橘防腐剂及其应用和发展方向[J].福建果树,1999,(2):27-29.[4]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册(第一版) [M].北京:科学出版社,2001.[5]王利娟,贺新生.植物内生真菌分离培养的研究方法[J].微生物学杂志,2006,26(4):55-60.[6]戴传超,余伯阳.驱杀菜青虫的内生菌鉴定与化合物研究[J].安徽农业科学,2006,34(4):694-697.[7]何美仙.植物内生真菌作为生防因子的研究进展[J].植物保护,2005,31(1):10-14.。