细胞工程知识点总结

《细胞工程》知识点总结

一、细胞工程（Cell Engineering）：在体外对生物的细胞进行生长与分化的调控、遗传重组与改良，使其生产出人类所需要的产品。包括：细胞培养、细胞融合、细胞器移植、核质移植、染色体移植、转基因等产品：生物的组织、器官、个体；抗体、多肽药物、蛋白质、酶；天然药物、色素、香精；等

二、生物工程包括：发酵工程、酶工程、细胞工程、基因工程、蛋白质工程。

三、1996年Dolly羊的克隆是通过核移植技术，最后在体内生长、分化、发育而成的。

四、植物组织培养：在人工培养基上无菌培养整株植物或植物的器官、组织、细胞或原生质体。又称为无菌培养（aseptic culture）、离体培养（in vitro culture）。

五、植物组织培养的类型：

1、植株培养（Plant Culture）：在容器（玻璃瓶、透明塑料瓶等）中无菌培养完整的植株。

植株来源：由种子无菌萌发而来；通过植物器官、组织、细胞再生而来。在快速繁殖中，后期的成苗和壮苗阶段属于植株培养。（一般时间较短）

2、胚培养（Embryo Culture）：无菌培养植物的成熟胚或未成熟胚，使其形成正常的植株。

目的：○1促进胚的提早萌发，缩短育苗时间；

○2克服远源杂种胚的夭折，以获得新的育种材料；

○3在科学研究中，用胚培养所得到的幼苗作为其它试验的材料。

3、器官培养（Organ Culture）：无菌培养植物的根、茎、叶、芽、花、果等器官，使其增殖或形成其它的组织或器官等。

4、组织培养（Tissue Culture）：指无菌培养植物各种组织（如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、皮层、薄壁组织、胚乳等），或由外植体分化形成的愈伤组织（callus），使其增殖或者分化。注：Callus（愈伤组织）：具有旺盛分裂能力，但没有组织和器官分化的细胞群。

5、花药与花粉培养：无菌培养植物的花药（带花粉）或花粉，形成单倍体植株。

补充：有效的育种辅助手段：单倍体植株获得以后，通过染色体加倍，即得到可以稳定遗传的纯和二倍体，缩短植物育种年限。

6、细胞培养：（Cell Culture）：无菌培养植物的单细胞或小细胞团。

细胞培养可用于：○1植物克隆；

○2细胞系的诱变和变异体的筛选；

○3生产有用化合物（useful chemicals）。

7、原生质体培养（Protoplast Culture）：将无细胞壁的原生质体培养成愈伤组织或植株。（注：由于无细胞壁的障碍，原生质体是实现远源植物间大规模遗传物质重组的良好体系。）

六、植物组织培养简史

1838年：Schwann 和Schleiden在细胞学说基础上提出了细胞全能性（totipotency）假说：一个高等生物（动物和植物）身上所有的体细胞(somatic cells)均来自一个共同的细胞——合子(受精卵）；在适当的条件下，一个体细胞应能像合子一样具有发育成一个完整个体的能力。

细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的理论基础；验证细胞全能性假说是开展植物组织培养研究的动力。

哈布兰特：植物组织培养研究第一人；1902年，德国植物学家Haberlandt根据Schwann和Schleiden 创立的细胞学说提出了细胞全能型（totipotency）理论。

1934年，美国植物生理学家White由培养番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系。

1937年，White研配了综合培养基（White培养基），并发现了B族维生素和生长素。

1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无病毒植株。

1958-1959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜素愈伤组织培养中形成了体细胞胚，该实验第一次证明了植物细胞的全能性。

1962年，Murashige和Skook发表了著名的植物组织培养基——MS培养基。

1967年，Bourgin和Nitsh等通过花粉粒培养获得烟草单倍体植株。

七、植物组织培养技术的应用

1、植物科学研究的有效手段；

2、快速繁育植物的优良品种；

3、挽救和保存植物的优良品种，挽救濒危植物资源；

4、在植物性状改良上的应用

○1胚培养可克服远源杂交不孕的困难；

○2花药（花粉）培养可大大缩短育种年限；

○3原生质体融合技术可克服有性杂交不亲和，创造远源杂种、甚至新的物种；

○4单细胞培养技术可用于突变体的筛选；

○5植物转基因技术为人们定向、快速改良植物性状、培育新品种提供了方便（但植物转基因必须依赖于植物组织培养技术<植物离体再生技术>）。

5、生产有用物质（useful chemicals）

八、植物组织培养技术的优点

1、不受气候、季节和地理位置的影响；

2、不受病虫害的影响；

3、植物生长发育过程容易调控，容易根据市场需求调节生产；

4、效率高、质量好。

九、植物组织培养的设施

1、试剂与设备

◇1化学试剂（用于配制培养基）

无机试剂：硝酸钾、硝酸铵、硝酸钙、硫酸钾、硫酸

镁、硫酸铵、硫酸铜、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、氯化钙、

硼酸、钼酸钠等。

有机试剂：维生素(B1、 B6、烟酸、生物素）、氨基

酸、糖（碳源）、植物激素、凝固剂以及其它一些物质。

◇2无菌设备

○1灭菌锅（autoclave）：最常用消毒的工具。

种类多：手提式（如常见的医用消毒锅，体积小）、

立式（体积中等）和卧式（有中型和大型）之分；有自热

式（带有加热装置）和外热式（无加热装置，需要从外部

加热，如煤气、电炉、蒸气等）之分。使用什么样的灭菌

锅，要根据植物组织培养的目的和规模而定。

○2超净工作台（laminar air-flow cabinet）：用

于对植物材料进行无菌操作。

超净工作台=空气过滤器，空气经过1-2次粗滤后，

最后通过孔径为0.2-0.4μm的滤网。是细胞工程中必不

可少的一种设备。超净工作台可以分为双人和单人、单面

和双面、水平风和垂直风等类型。

○3培养室（Culture room）

植物材料需要在一个可控温、控光、洁净的地方进

行培养。如规模小，则有1-2个培养箱即可。

培养箱体积小，不占地方，控温、控光条件好，很

适合于摸索植物材料的培养条件和科学研究。缺点是空间

小、价格昂贵（7000-10000元/台）。

2、培养室所需要的设备

○1培养架:培养架的设计既要考虑充分利用培养

室的空间，也要考虑取放材料方便；

○2加温/降温设备：空调；

○3光照和控光设备。分为光培养室和暗培养室。

光培养室常用日光灯照明，并安置控制光照时间的自动开

关。

3、培养容器

○1玻璃容器：如试管、三角瓶、果酱瓶、罐头瓶、

饮料瓶等。玻璃瓶耐高温消毒、透明（便于观察），且为

惰性物质，对植物材料的生长影响小，是组培中用得最广

的容器，但容易破碎。

○2透明塑料容器：轻巧，不易破碎，但不耐反复

高温消毒，而且有些塑料容器在高温消毒时会释放一些有

害的物质，影响材料的生长。

○3容器封口：良好的封口用品要求做到既可以防

止污染和容器内水分的过分散失，又要做到透水、透气。

棉塞、锡箔纸、耐高温的塑料纸（如培养食用菌的聚丙烯

塑料袋）。其中以棉塞是最好。现在也有专用的封口膜和

瓶塞。

4、其它仪器和设备

○1天平：需要1台万分之一的精密分析天平和百

分比之一或十分之一的普通天平。

○2冰箱：用于储藏一些不宜在常温下较长时间放

置的药品和试剂，如维生素、氨基酸、激素、微量元素等。

○3酸度计：植物的生长需要一定的pH值，因此

需要对培养基的pH值进行测定、调节。酸度计测定pH

值精度高，准确，但比较烦琐。如不是进行要求很高的培

养（如单细胞培养、原生质体培养）或进行不同pH值对

植物材料生长的影响，可以用pH试纸代替。

○4蒸馏水器或者去离子水生产装置

○5酒精灯

○6解剖刀和镊子

○7摇床

十、植物组织培养室的设计

植物组织培养工作按内容不同可以分为3个的过程：

1.培养基的准备:包括试剂的配制、容器的洗涤、培

养基的制备与消毒等;

2. 植物材料的无菌操作;

3.植物材料的培养、观察与分析。

植物组织培养要求无菌，因此，在设计植物组织培养

实验室时既要考虑各环节的衔接，又要避免不必要的交

叉，特别是商业化组培苗生产，更要特别注意防止污染。

最好是三部分工作相互独立。

十一、植物组织培养基

1、培养基的组成

培养基的重要性：

○1植物材料生长的营养来源；

○2调节植物材料生长与分化的主要途径。

培养基的种类：

共同之处：含有植物生长发育所必须的营养物质和生

物活性物质；

不同之处：营养物质的浓度不同。

培养基的组分：

○1水：要求纯净。应用蒸馏水、去离子水、而不用

自来水；

○2无机营养成分：大量元素：

大量元素：C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S；

微量元素：Fe, Cl, Cu, Mo, B, Zn, Mn；

不同培养基的无机盐（特别是大量元素）的浓度差

异很大

○3有机营养：维生素和氨基酸的总成

常用：肌醇、烟酸、维生素B6、维生素B1和甘氨

酸等；

其它的维生素：维生素M（叶酸）、维生素B2（核

黄素）、泛酸钙等；

其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬

酰胺等；

关于培养基中有机成分的复杂性，要视材料培养难

易而定。难培养的材料，则要增加有机成分的种类。

○4碳源：最常用的糖是蔗糖(sucrose)，但也有用葡

萄糖(glucose)、果糖(fructose)或其它的糖(lactose,

maltose)，有时几种糖混用。糖是营养物质，但不是越多

越好。培养基中糖的用量大多在10—60g/L，一般为20

—30 g/L。

○5植物生长物质：植物激素和植物生长调节剂的总

称

植物激素：植物合成的、微量就有显著效应的物质。

植物生长调节剂：人工合成的、具有植物激素相似作用的物

质。

根据功能不同，植物生长物质共分为五大类：

（1）生长素（Auxins）：吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、

萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸；

生长素的作用：○1促进细胞分裂、增殖，导致愈伤组

织的形成； 2,4-D>NAA>IAA,IBA

○2控制器官的分化，诱导根的

形成； IBA>NAA>IAA

（2）细胞分裂素（Cytokinins）：玉米素（ZT）、6-苄

基氨基嘌呤（6-BA,BA,BAP）、激动素（KT）;

细胞分裂素的作用：○1促进细胞分裂、增殖，导致愈

伤组织的形成；

○2控制器官的分化，诱导

芽的形成和增殖。

（3）赤霉素的生理作用：赤霉素最显著的作用是促进

细胞的伸长，也有打破种子休眠的作用。在植物组织培养中

使用赤霉素主要是促进芽或茎的伸长。赤霉素对热不稳定，

故不宜用高温法消毒。

（4）乙烯的生理作用：促进果实成熟，加速植物衰老。

植物组织培养极少使用乙烯（乙烯利），相反，而是尽量控

制乙烯的产生。

（5）脱落酸（ABA）的生理作用：促进植物衰老的激素，

植物组织培养很少用。在胚状体的诱导和培养中常常使用脱

落酸，促进胚状体的成熟。

（6）凝固剂：在植物组织培养中，琼脂（agar）是最

常用的凝固剂，用量为6-12g/L。另外还有phytagel,

Gelrite, 4g/L。

（7）有机附加物（Organic additives）

水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提

取物：用量为0.1-10g/L，一般为0.5-3 g/L。

椰子汁：100-200ml/L。这些物质的成分复杂、不明确，

统称为有机附加物。当材料生长不好时，加入这些物质往往

可以会明显改善材料的生长状况。

（8）其他物质：防止与减缓植物材料褐化的物质：

1）抗氧化剂：抗坏血酸（Vc）、L-半光氨酸、柠

檬酸、二硫苏糖醇等。

2）吸附剂：活性炭、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

活性炭吸附无选择性；改善培养效果、促进生根。

PVP专一吸附酚类物质。

2、培养基母液的配制

为了便于培养基的配制，实际操作过程中可以先将常用

的成分配成一定浓度的母液（stock solution），然后在配

各种试验培养基时取一定量的母液稀释。可以配成母液的是

无机盐、有机成分和植物激素等。

（1）无机盐母液的配制

○1大量元素母液的配制：

大量元素浓度比较高，故母液浓度(倍数)不

能过大，否则溶解不完全，容易析出(特别是冬

天)，使用很不方便，一般为20、50或100倍。

另一个要考虑的问题是高浓度时有些离子之

间发生会发生相互作用，形成沉淀，如SO42-、

PO43-和Ca2+之间。因此，在母液浓度较高时，

Ca盐要与硫酸盐、磷酸盐分开。母液浓度高时

MgSO4和CaCl2要分开。如把KNO3、NH4NO3和

CaCl2·2H2O配在一起（母液 I），MgSO4·7H2O

和KH2PO4配在一起（母液 II），这样，即使母

液浓度达到100倍也不会出现沉淀。

○2微量元素母液的配制：

除铁盐外，其它微量元素可以全部配在一起，浓

度常为100-200倍。

因为Fe2+容易变成Fe3+而形成沉淀，不利

于植物材料的吸收，所以把FeSO4同Na2EDTA配

在一起，形成络合铁。这种络合铁长期稳定，植

物利用度高。其母液浓度为100—200倍。配法

是先分别将FeSO4和Na2EDTA溶解，然后等体积

混合，边混合边搅拌，混合液为黄色。微量元素

母液和铁盐要放在冰箱中保存。

（2）有机成分母液的配制

一种培养基的有机成分(氨基酸和维生素) 可以配在一

起,100-200倍。有机成分母液应放在冰箱中保存，否则容

易生霉、变质。

（3）植物激素母液的配制

每种植物激素要单独配一种母液，浓度为

0.5-1.0mg/mL。激素不易溶于水，但易溶乙醇、二甲基亚砜，

故可以用乙醇、二甲基亚砜先溶，再用水定容。对于生长素

类激素，可以用稀碱助溶；对于细胞分裂素类激素，可以用

稀酸助溶。激素母液也应在低温下保存。

注意：无论是配哪种母液，各成分只有完全溶解后才能

混合；各种母液都要帖上标签，标明成分、浓度和配制的时

间！

3、培养基的制备

（1）根据植物材料、培养目的设计好试验培养基的配

方（如选用何种基本培养基，糖、植物激素、琼脂和其它成

分的浓度），并且要准确无误的写在实验记录本上；

（2）根据培养基的体积和母液浓度，求出各种成分的

用量；

（3）根据计算出来的结果，配成各种培养基。

4、培养基的消毒

培养基做好以后，要及时消毒，否则细菌和真菌极易在

培养基滋生。这不仅会改变培养基的成分，而且菌物还会产

生有毒的物质。培养基的消毒方法有如下几种：

1）高温灭菌法：简单、易行；一次可以灭菌大量的培

养基，最常用。所用的温度是121℃，压力是1.1—1.2大

气压。

高温消毒时应注意的问题：

○1一定要先排气10 min，否则不能消毒不彻底；

○2高温消毒后，培养基的pH值会下降0.2—0.5个pH

单位；

○3高温消毒过程中，培养基中有些物质会被破坏或发

生沉淀。如蔗糖会水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖变成葡萄糖

酸等；有些物质甚至几乎完全被破坏，如赤霉素、玉米素等。

物质破坏程度与消毒时间和压力有关。

2) 过滤灭菌法

除了高温消毒外，过滤消毒也是常用的消毒方法。由于

过滤消毒不会破坏培养基的成分和改变培养基的pH值，所以

在原生质体培养、单细胞培养时常用过滤消毒法对培养基进

行灭菌。如果培养基中要使用一些热不稳定的物质，如ZT、

GA3、核黄素等，则这些物质也要用过滤消毒法灭菌，其它成

分可用高温消毒法灭菌。

过滤灭菌的操作：

先将微孔滤膜（孔径0.2-0.45 m，用前最好在蒸馏水

中浸泡数小时）装入滤头中，用纸或布将其包好，再高温灭

菌；在超净工作台上取出滤头，用注射器吸取培养基或溶液，

将注射器接在滤头入口端，推动注射器使培养基或溶液从滤

头出口处流出，并用无菌容器收集滤液。

过滤灭菌时要注意：

○1溶液中的成分必须完全溶解，不能有悬浮物或沉淀

物，否则会堵塞微孔滤膜。如确有悬浮物或沉淀物，应先离

心。

○2要注意滤膜是否破裂（使用时可根据经验判断；使用

完后可检查滤膜）。

○3过滤时不要用力过大，否则会导致滤膜破裂。

过滤消毒法的缺点是操作比较烦琐，只适合少量培养基的灭

菌，而且不能灭菌固体培养基。

十二、外植体的表面消毒

1、污染是植物组织培养的大敌！

污染来源：

1）植物材料自身污染；

2）操作污染；

3）培养基消毒不彻底；

4）培养室不洁净而污染；

2、外植体表面消毒的必要性

外植体（Explant）：用于建立无菌培养的起始植物材料。

表面消毒（Surface Sterilization）：（用消毒剂）杀死

外植体表面其它生物（主要是细菌和真菌）的过程。

必要性：植物材料表面都带有细菌和真菌，如消毒不彻

底，细菌和真菌会在培养基中迅速生长，占据空间、消耗营

养、分泌毒素，使植物材料死亡。因此，接种前对外植体进

行有效的表面消毒是建立无菌培养的关键。

表面消毒的要求：

（1）最大限度地杀死细菌和真菌；

（2）对外植体的毒害要尽可能的小。

常用消毒剂：用于植物材料表面消毒的消毒剂有乙醇、

氯化汞、次氯酸钠、双氧水等。

3、消毒步骤：

1）用自来水将材料冲洗干净。

2）将材料上的水擦干，并剪成适当大小（长短）的

小块（段）。

3）在70%-75%的乙醇中10-60 S，然后迅速转入到其

它消毒剂（氯化汞、次氯酸钠）中，消毒剂中可加入少量表

面活性剂（Tween 20或80、家用洗涤剂等），以增加消毒效

果。

4）消毒时间结束后，将材料转入无菌水中漂洗2-8

次；

5）将材料的伤口部分切去后，再将其切成适当大小，

及时接入到培养基中。

注意：表面消毒是复杂而又灵活的过程。一次效果不好，

可以进行两次、三次，还可以进行分步消毒。

4、材料内部污染的控制

无性繁殖的植物往往内部带菌（多为细菌），有些材料在

培养较长时间后（几个月、甚至1年），特别是衰老、生长不

旺后，容易出现污染。

表面消毒不能杀死内部的细菌，可尝试下列方法：

1）用分生组织作为外植体。因为分生组织内无维管

组织，所以不带菌。

2）在培养基中加抗菌素（青霉素、卡那霉素、四环

素等），但高浓度的抗生素往往对植物材料生长发育也有抑制

作用，而且抗菌效果有时不一定理想。

3）是尽量将材料切小些，并且每接一个外植体就将

接种工具消毒一次，避免交叉感染。材料越小，污染的机会

也就越小，但成活率越低。

十三、高等植物离体再生和无性繁殖

1、高等植物的繁殖途径：

根据植株形成的途径，植物的繁殖方法有性繁殖和无性

繁殖两种：

1）有性繁殖（Sexual propagation）：通过两性细

胞结合形成的种子进行繁衍后代的方法叫有性繁殖。因

为繁殖体是种子，所以又称种子繁殖。

补充：种子发芽的条件:充足的水分；适宜的温度；合适

的光照。

种子繁殖的优缺点：

优点：有性繁殖具有种苗生产操作比较简单、种苗根系

完整、生长健壮等优点。

缺点：有些植物是不能或不宜用种子繁殖的，如无种

子或种子无活力的植物、杂种植物；虽然有些植物可以

用种子繁殖，但生育期长、或者繁殖系数低。对于这些

植物，可以用无性方法进行繁殖。

2）无性繁殖（Asexual propagation）：无性繁殖

是通过植物体一部分（常常是营养器官，如芽、根、茎、

叶等）繁殖自身的方法，所以又称营养繁殖（vegetative

propagation）。一株植物通过无性繁殖所形成的后代称

为一个无性系（clone,克隆），所以无性繁殖植物就是

克隆植物，无性繁殖又称为clonal propagation。

植物的无性繁殖有分株、扦插、压条和嫁接4种方法。

○1分株繁殖：通过植物本身的组织或器官生长出来的器

官或植株进行繁殖。（优点：成活率高）

○2扦插繁殖：扦插也称插条，是一种培育植物的常用繁

殖方法。剪取某些植物的茎、叶、根、芽等（在园艺上称插

穗），或插入土中、沙中，或浸泡在水中，等到生根后就可栽

种，使之成为独立的新植株。（生根是关键！优点：繁殖材料