限制性内切酶的应用课件
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限制性内切酶ppt
限制性内切酶
细菌可以抵御病毒的入侵，而这种 “限制”病毒生存的办法则可归功于细 胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。
一、限制-修饰现象的发现
表1
从表1可看出，从三种不同的E.coli菌株中 繁殖出来的λ噬菌体的后代(分别用λK、λ B 、 λC表示)，再接种到同样菌株，接种效率都是 1。
但如果接种到不同的菌株中，如λK在B株 上接种效率只有10-4，而不管λK还是λB在C株 上的接种效率都为1。
Answer: 幸存者的后代因为有 新寄主的修饰标记而缺少祖代 寄主的修饰标记，只能感染新 的寄主类型，而不再能感染祖 代寄主。
这里所谓自我DNA和外源DNA是对于它的 限制—修饰模式而言, 凡限制—修饰模式相 同的DNA均为自我DNA，这包括同株系不 同个体的DNA，及寄生于这些菌株中的质 粒和噬菌体。
host restriciton enzymes.
Once methylated however, all subsequent phage genomes are efficiently methylated at hemimethylated sites on replication. This explains the high efficiency infection with the individual plaques that escaped restriction.
在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两 种不同的蛋白，各自独立行使自己的功能；而在 另一些系统中，两种功能由同一种酶的不同亚基， 或是同一亚基的不同结构域来执行。
对表1的解释：
不同的菌株可能有不同的限制修饰系统。 当不同来源的噬菌体λ进入另一种大肠 杆菌时，绝大部分被限制酶所降解，但 有极少数的入噬菌体先被大肠杆菌的甲 基化 酶所修饰，因而幸存下来.
细菌可以抵御病毒的入侵，而这种 “限制”病毒生存的办法则可归功于细 胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。
一、限制-修饰现象的发现
表1
从表1可看出，从三种不同的E.coli菌株中 繁殖出来的λ噬菌体的后代(分别用λK、λ B 、 λC表示)，再接种到同样菌株，接种效率都是 1。
但如果接种到不同的菌株中，如λK在B株 上接种效率只有10-4，而不管λK还是λB在C株 上的接种效率都为1。
Answer: 幸存者的后代因为有 新寄主的修饰标记而缺少祖代 寄主的修饰标记，只能感染新 的寄主类型，而不再能感染祖 代寄主。
这里所谓自我DNA和外源DNA是对于它的 限制—修饰模式而言, 凡限制—修饰模式相 同的DNA均为自我DNA，这包括同株系不 同个体的DNA，及寄生于这些菌株中的质 粒和噬菌体。
host restriciton enzymes.
Once methylated however, all subsequent phage genomes are efficiently methylated at hemimethylated sites on replication. This explains the high efficiency infection with the individual plaques that escaped restriction.
在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两 种不同的蛋白，各自独立行使自己的功能；而在 另一些系统中，两种功能由同一种酶的不同亚基， 或是同一亚基的不同结构域来执行。
对表1的解释：
不同的菌株可能有不同的限制修饰系统。 当不同来源的噬菌体λ进入另一种大肠 杆菌时，绝大部分被限制酶所降解，但 有极少数的入噬菌体先被大肠杆菌的甲 基化 酶所修饰，因而幸存下来.
DNA限制性内切酶酶切与电泳pptppt
的侵袭。
Ⅱ型酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序（回文序列），
并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段；
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助
因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复
顺序；
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－ －５’端突出；３’端突出和平末端。
EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）
5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘
3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘
5’NNNNNGTT 3‘NCAAp
pAACNNNNN3’ TTGNNNNN5’
HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）
酶切反应中应注意以下几个问题
１．内切酶： 2. DNA ３．反应缓冲液 ４．酶解温度与时间
光复合物，在紫外线254 ～365nm照射下呈桔
红色荧光。电泳时所需DNA样品量仅0.5～
1μg.
线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝 胶浓度的关系
琼脂糖凝胶的百分浓度 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 分离线性DNA片段分离的有效 范围(kb) 60 ～5 20 ～1 10 ～0.8 7 ～0.5 6 ～0.4 4 ～0.2 3 ～0.1
二、电泳
⒈琼脂糖溶液的制备 溴化乙锭浓度0.5μg/mL ⒉凝胶板的制备 ⒊上样 ⒋电泳 电压10v/cm,溴酚蓝移出2/3的距离时，取 出凝胶紫外灯下观察结果
电泳检测示例
电泳时所需dna样品量仅05线性dna片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系琼脂糖凝胶的百分浓度分离线性dna片段分离的有效范围kb0360062007100809051204150220按下表分别加入各试剂注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作于eppendorf管中
工具酶(限制性内切酶)优秀PPT
7
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
• 这类酶很少能达到完全切割。
11
某些识别和切割独特的酶
12
BsmBⅠ
13
Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
14
15
• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
16
某些识别和切割独特的酶
17
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是：
Ⅱ型限制性内切酶
1. 能在其识别序列内部或附近特异地切开 DNA 链。它们产 生确定的限制性片段和凝胶电泳条带，因此是唯一一类用 于 DNA分析和克隆的限制性内切酶。
2. Ⅱ型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组 成，因而它们的氨基酸序列可能截然不同。
3. 它们一般以同源二聚体的形式结合到 DNA 上，识别对称 序列；
嗜血流感细菌还具有另一个Ⅱ型的限制酶 Hind Ⅲ，而且含量很大。幸 运的是，Hind Ⅲ不切割T7 DNA，因此 Hind Ⅱ制剂中可能混有的 Hind Ⅲ将不产生任何问题（Old 等，1975）。
在发现 HindⅡ后不久，又分离到其他几个Ⅱ型的限制性内切酶，并分 析了它们的性质，EcoRⅠ是其中最重要的一个（Hedgepeth 等， 1972）。它们随即迅速用于最初的重组 DNA 实验中。
• 这类酶很少能达到完全切割。
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某些识别和切割独特的酶
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BsmBⅠ
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Ⅳ 型限制性内切酶
• 识别经典甲基化的和修饰的 DNA。以 E. coli 的 McrBC 和 Mrr 系统为代表。
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• 限制性内切酶切割后产生一个 3' -羟基和一 个 5' -磷酸基。只有当镁离子存在时，它们 才有切割活性，相应的修饰酶则需要 S- 腺 苷甲硫氨酸的存在。这些酶一般都比较小， 亚基约 200-350 个氨基酸。
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某些识别和切割独特的酶
17
限制性内切酶命名
• 由于发现了大量的限制和修饰酶，所以需要一个统 一的命名体系。Smith 和 Nathans（1973）提出 了一个合适的体系，人们今天使用的就是这个体系 的一个简化版。其主要特征是：
限制性内切酶.正式版PPT文档
回文序列 • 5'......GAA TTC......3' • 3'......CTT AAG......5'
• 从两侧读都是核苷酸的序列都是5'-GAATTC-3'
限制性内切酶的命名
• 限制性核酸内切酶的命名最早由 ห้องสมุดไป่ตู้mith 等1973 年提出,。
• 1980 年 Robert s 进行系统化和 分类。
同尾酶
许多不同的限制酶切割 DNA 产生的末端是相同的，且是对称的。 它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶切割 DNA 得到的产物可进行末
端连接。 以下几种酶产生的末端是相同的· EcoRⅠ G↓AATCC MfeⅠ C↓AATTC ApoⅠ R↓AATTY
限制性内切酶的切割方式
影响限制性内切酶活性的因素
Ⅱ型酶对DNA序列的识别一般具有以下几个特征
①大多数酶的识别序列很严格，少有变动的余地
②识别序列的碱基数一般为4~8对，一般都富含C和G. ③大多数识别位点具有180度旋转对称的回文序列，即有一个 中心对称轴，从这个轴朝两个方向读都完全相同。
④识别序列中的碱基被甲基化修饰后会影响部分酶的切割 效果
限制性内切酶
主要内容 • 限制性内切酶的概念 • 限制性内切酶图谱 • 限制性内切酶的图谱分析法
限制性内切酶
是一类能识别双链DNA特定序列，并使磷酸二酯键断开的内切脱氧 核糖核酸酶， 限制性内切酶根据酶的组成，裂解方式和所需因子的不同分为三种 类型，分别是Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。 Ⅰ型酶主要指的是：一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多 亚基蛋白复合体。它们可在远离识别位点处任意切割 DNA 链。 能识别特异性的DNA 序列, 但没有固定的切割位点
DNA的限制性酶谱分析ppt课件
实验5 限制性酶切分析
.
1
一. 实验目的
通过本实验了解限制性内切酶的作用原 理，限制性酶切技术及限制性酶切图谱的 分析方法。
.
2
二. 实验原理
限制性内切酶是一类能识别并切割双链 DNA分子中特定核苷酸序列的核酸内切 酶。
.
3
限制性酶切反应体系的组成
1，DNA 2，缓冲液 提供限制性酶作用所需的离子浓度及种 类；提供限制性酶作用所需的 pH值 3，限制性内切酶
.
4
限制性酶切图谱的分析
DNA在限制性酶切后往往会形成多条片段， 从片段的数量和大小大致可以推断DNA限 制性酶切位点的多少及相对位置。
我们往往利用DNA分子量Marker读出酶 切片段的大小。
.
5
DNA分子量Marker
100 bp Marker
.
6
三. 实验方法
1．在0.5 ml 离心管中混和如下试剂()：
.
8
3．取10µl反应液，1％琼脂糖凝胶电泳检测， 同时以 DNA（EcoRI/HindIII）作为分子量 Marker
4.记录实验结果：对照分子量Marker，记录所 得片段的数量和大小，并分析 DNA有几个 HindIII酶切位点
.
9
.
10
.
11
.
12
.
13
.
14
后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用
DNA：
2 µl
10×酶切缓冲液：
2 µl
无菌水：
14 µl
HindIII：
1 µl
EcoRI
1 µl
2．37℃水浴 45 min
.
.
1
一. 实验目的
通过本实验了解限制性内切酶的作用原 理，限制性酶切技术及限制性酶切图谱的 分析方法。
.
2
二. 实验原理
限制性内切酶是一类能识别并切割双链 DNA分子中特定核苷酸序列的核酸内切 酶。
.
3
限制性酶切反应体系的组成
1，DNA 2，缓冲液 提供限制性酶作用所需的离子浓度及种 类；提供限制性酶作用所需的 pH值 3，限制性内切酶
.
4
限制性酶切图谱的分析
DNA在限制性酶切后往往会形成多条片段， 从片段的数量和大小大致可以推断DNA限 制性酶切位点的多少及相对位置。
我们往往利用DNA分子量Marker读出酶 切片段的大小。
.
5
DNA分子量Marker
100 bp Marker
.
6
三. 实验方法
1．在0.5 ml 离心管中混和如下试剂()：
.
8
3．取10µl反应液，1％琼脂糖凝胶电泳检测， 同时以 DNA（EcoRI/HindIII）作为分子量 Marker
4.记录实验结果：对照分子量Marker，记录所 得片段的数量和大小，并分析 DNA有几个 HindIII酶切位点
.
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10
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后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用
DNA：
2 µl
10×酶切缓冲液：
2 µl
无菌水：
14 µl
HindIII：
1 µl
EcoRI
1 µl
2．37℃水浴 45 min
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限制性酶切与连接PPT课件
• 质粒pUC18 DNA • PCR产物 • HindⅢ内切酶 • Hind Ⅲ 10 X buffer • ddH2O
实验步骤与试剂
反应体系 • 质粒pUC18 DNA
2μ l
• PCR产物
2μ l
• HindⅢ内切酶
2μ l
• Hind Ⅲ 10 X buffer 2μ l
• ddH2O
12μ l
保存
DNA电泳常见问题分析 问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
原 因
• DNA上结合有蛋白质
• 内切酶中含有DNA外 对
切酶
策
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
DNA电泳常见问题分析
问题七：酶切后的DNA片段连接效率低
原 因
• 含磷酸盐的浓度高
成都医学院-生化与分子生物实验
注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常
1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－ ３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
实验步骤与试剂
反应体系 • 质粒pUC18 DNA
2μ l
• PCR产物
2μ l
• HindⅢ内切酶
2μ l
• Hind Ⅲ 10 X buffer 2μ l
• ddH2O
12μ l
保存
DNA电泳常见问题分析 问题六：电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
原 因
• DNA上结合有蛋白质
• 内切酶中含有DNA外 对
切酶
策
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
• 减少酶用量或消化时间，换 用新包装的酶
DNA电泳常见问题分析
问题七：酶切后的DNA片段连接效率低
原 因
• 含磷酸盐的浓度高
成都医学院-生化与分子生物实验
注意事项——限制性内切酶酶切
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常
1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－ ３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
限制性核酸内切酶切割原理方法结果分析及应用 ppt课件
ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
2、Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割 某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别
序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重 组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则： 第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细胞的种名 第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
ppt课件
3
限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶： 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
解决方法
1.标准底物检测酶活性
2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3.检查反应系统是否最佳
4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重 新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌 株
5. 换 用 不 同 切 割 非 甲 基 化 位 点 的 同 类 酶 消 化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增
10chenli?结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向orientationl在选择限制性内切酶时应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要
2、Ⅱ类由两种酶组成： 一种为限制性内切核酸酶（限制酶），它切割 某一特异的核苷酸序列； 另一种为独立的甲基化酶，它修饰同一识别
序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重 组DNA的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文 对称特异核苷酸序列，产生5'或3'黏性末端（也有一些产生平端或钝端）
Ⅲ型酶：与Ⅰ型酶一样，具有限制3、与命修名饰活：性，其切割位点很难预测。
规则： 第一个字母（大写）：取自该酶的细胞属名 第二、三个字母（小写）：该细胞的种名 第四个字母（罗马数字）：代表同一菌株中 不同限制性内切酶的编号
例如：EcoRⅠ、HindⅢ 等等
ppt课件
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限制性核酸内切酶切割原理
1、Ⅰ类和Ⅲ类酶： 在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于
解决方法
1.标准底物检测酶活性
2.将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3.检查反应系统是否最佳
4.换用对DNA甲基化不敏感的同类酶酶解，重 新将质粒DNA转化至dcm-,dam-基因型的细菌菌 株
5. 换 用 不 同 切 割 非 甲 基 化 位 点 的 同 类 酶 消 化 DNA，重新将质粒转至dcm+,dam+菌株中扩增
10chenli?结果分析限制性内切酶酶谱分析往往用于对构建的重组质粒进行初分析所获得的信息将有助于确定构建是否成功及其插入片段的方向orientationl在选择限制性内切酶时应选择在插入片段中单独存在和在插入片段与质粒序列中均含有的限制性内切酶酶切位点这样可保证酶切片段大小能满足进一步分析的需要
基因工程中工具酶 限制酶的应用 PPT课件
徐师大-屈艾老师制作
20
B. 切割类型：
检验大量的实验事例之后发现，由核酸内切限 制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型，通常是 属于下述两种排列方式之一：
（1）两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称 地围绕着一个对称轴排列，这种形式的断裂结果形
成具有粘性末端的DNA片段（ 3’- 和 5’- ）；
以其功能可分为三大类：核酸降解酶类、核酸合 成酶类、核酸修饰酶类
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3
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4
第一节
限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）
一、限制性内切酶的发现 二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 三．核酸内切限制酶的命名原则 四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 六. 限制性内切酶反应的终止 七、限制酶消化反应的步骤 八. 使用限制酶的注意点（4点） 九、DNA的片段化
第二章 基因克隆的工具酶
第一节 限制性核酸内切酶和DNA片段化 第二节 DNA连接酶 第三节 DNA聚合酶 第四节 逆转录酶及其它酶
徐师大-屈艾老师制作
1
基因工程工具酶
“工若善其事，必先利其器”。
基因工程的操作，是分子水平的操作， 它涉及到一系列相互关连的酶促反应， 要靠一些重要酶类作工具，对基因进行 人工切割和拼接，故称为“工具酶”。 已知有许多酶在基因克隆实验中有着广 泛的用途。
徐师大-屈艾老师制作
13
三．核酸内切限制酶的命名原则
由于发现了大量的限制酶，所以需要
有一个统一的命名法。H．O．Smith和D
．Nathans(1973)提议的命名系统，已被广
大学者所接受。他们建议的命名原则包括
限制性内切酶的应用课件
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
II型限制性内切酶的分类（二）
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别
位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为
400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称
序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切
割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体
同尾酶：
有时两种酶切割序列不完全相同，但却能 产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶， 可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但 原来的酶切位点将被破坏，有时可能会产生
一个新的酶切位点。如Xba Ⅰ(T`CTAGA)、 Nhe Ⅰ(G`CTAGC） 、Spe Ⅰ(A`CTAGT)切割
的DNA序列不同，但均给出相同的“CTAG”粘 性末端。这些粘性末端连接后，以上的酶将 不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
限制性内切酶的分类
❖
II型酶在其识别位点之中或临近的确定位
点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片
段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯
一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内
切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
限制性内切酶的命名
限制性内切酶命名的次序如下： ❖ A） 用3个字母代表来源的生物（如Bam代
表 Bacillus amyloliquefaciens） ❖ B） 1个字母或阿拉伯数字代表菌株
（BamH） ❖ C） 1个罗马字母代表发现或鉴定的次序
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系本人改正。
限制性内切酶原理PPT.
AACNNN3’ TTGNNN5’
HaeⅠ的识别序列
5’NNNGC
GGCCGC NNN3‘
3’NNNCGCCGG
CGNNN5 ‘
NotⅠ 的识别序列
5’粘性末端和3’粘性末端
5’粘性末端
小提示24：申请表为每个应聘者提供了同等的竞赛场地。
如45．’你同N意，N我G们应C将聘把者G你工G的作C资变料动C存是G档否，合C以情N备合来理N日。3之‘需。（询问应聘者5是’否同N意N将N其G资料C存-O档。H）
限制性内切酶原理
限制酶
II型限制酶
1
限制酶的定义
限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序 列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类
内切酶，简称限制酶。限制酶在基因工程中广为 使用。
限制性核酸内切酶
分布极广，几乎在所有 细菌的属、种中都发现 至少一种限制性内切酶。 细菌通过自身的限制酶， 破坏入侵的外源DNA， 从而保护自身。
II型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识
别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种
类。例如：EcoRI、HindIII。
III型限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确
定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。
什么是回文序列？
GAATTAAG C TTAATTC
命名
Escherichia Coli Ry13
EcoR I
属名 种名 株系 编号
切割频率
切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA 分子中预期的切割概率。可以估算该限制性 核酸内切酶在某种DNA分子中的切点数。
前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、 碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每 个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4 。
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II型限制性内切酶的分类（二）
❖
IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别
位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为
400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称
序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切
割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体
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限制性内切酶的命名
限制性内切酶命名的次序如下： ❖ A） 用3个字母代表来源的生物（如Bam代
表 Bacillus amyloliquefaciens） ❖ B） 1个字母或阿拉伯数字代表菌株
（BamH） ❖ C） 1个罗马字母代表发现或鉴定的次序
的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二
聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶
在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可
能更高。
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II型限制性内切酶的分类（三）
❖ 第三种II型限制性内切酶（有时也被称为IV型限制 性内切酶）是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的 酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同 时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在 识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的 序列（如Bcg I：CGANNNNNNTGC），并在识别位点 的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。这 些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。 他们在N端有一个负责切开DNA的功能域，这个域又与 DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序 列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这 些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切 开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
❖ 当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代 流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司寻 找更多的限制性内切酶
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限制性内切酶的特点
❖ 限制性内切酶的形式多样，从大小上来说， 它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可 以比1250个氨基酸的Cje I更大
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II型限制性内切酶的分类（一）
❖ 内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I 这样在识别序列中进行切割的酶。这一类酶是构成 商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体 的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列； 但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非 对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别 GAATTC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I 识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶的切割后 产生一个3‘羟基端和一个5’磷酸基团。它们的活性 要求镁离子的存在，而相应的修饰酶则需要S-甲硫 氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般 都在200-300个氨基酸左右。
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❖ 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异 性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限 制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而 这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细胞 内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。这些酶 可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基 因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组 成、功能及表达非常有用的工具。
因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能
与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。
实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是
在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同
一个祖先。
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限制性内切酶的分类
❖ III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种 功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链， 并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少 能产生确定的切割片段，因而不具备实用价值， 也没有人将其商业化。
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❖ 限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶 （甲基化酶）出现。后者的作用是保护细胞自 身的DNA不被限制性内切酶破坏
❖ 限制性内切酶和它的"搭档"--甲基化酶一 起就构成了限制-修饰（R-M）系统。在一些RM系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同 的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；而在 另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶 的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执 行
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限制性内切酶的分类
❖
II型酶在其识别位点之中或临近的确定位
点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片
段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯
一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内
切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，
❖ 除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原 核生物中被发现
❖ 在已纯化分类的3000种限制性内切酶中， 已发现了超过250种的特异识别序列。
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限制性内切酶的主要功能
❖ 保护细菌不受噬菌体的感染，这一观点已 被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的 一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶 的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成 功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同 种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多 的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一 个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使 细胞坚不可摧。
（BamHI）
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限制性内切酶的分类
❖
按照亚基组成、酶切位置、识别位点、
辅助因子等因素划分为三大类
❖ I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶 和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们 在识别位点很远的地方任意切割DNA链。尽管 I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确 定的限制片段和明确的电泳条带，因而不具备 实用性。