微生物遗传学

乙醇脱氢酶乙醇氧化体系是在肝脏中代谢酒精的一条主 要途径。乙醇脱氢酶氧化体系包括醇脱氢酶 (ADH) 和醛脱氢 酶(ALDH)。参与体内乙醇代谢，是重要的代谢酶。 乙醇在人体内的代谢主要靠体内的两种酶 , 一种是乙醇 脱氢酶,另一种是乙醛脱氢酶。前者使乙醇转化为乙醛 ,后者
使乙醛进一步转化为乙酸 ,最终分解为二氧化碳和水,由此可
B
亲合层析柱分离纯化
20世纪80年代末出现了亲和色谱技术。以亲和力为基础
的生物分离技术是将可逆结合的配基与不溶性的载体偶联 ,
形成具有特异亲和性的分离介质 , 并用其来选择性地吸附生 物活性物质，再通过洗脱来分离所需要的物质。
a 金属亲和层析
固定化金属亲和离子介质的合成主要是要在介质中引入
能够和金属离子产生螯和作用的基团，以实现金属离子的固
a
硫酸铵沉淀
当硫酸铵加入酶溶液时，由于硫酸铵对水分子的亲和力 大于酶，于是酶分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时， 硫酸铵加入后，由于离子强度发生改变，酶表面电荷大量被 中和，更加导致溶解度降低，使酶分子之间聚集而沉淀。
以不同饱和度的硫酸铵分段盐析沉淀经热处理步骤后的 酶液，测定盐析上清液及沉淀的蛋白质浓度及酶活性，得到 最佳盐析范围 40%~60% 硫酸铵饱和度，表明分段盐析对乙醇 脱氢酶的纯化效果非常显著。
SO3H Cl N O NH NH N SO3H NH SO3H N
从结构上看，Cibacron Blue 的结构和NAD的结构相似，它 和蛋白质的亲和性类似于蛋白质对核苷酸或蛋白质对辅酶 NAD基 团的识别性。
作者名
Chuanul hidayat
配体选择
亚氨基二酸做配体
回收效果
其动力学结合能力为569 U/ml，ADH的纯化因子和回 收率分别为8.8、93.5% 回收率为57%
从表2中可以看到，氧气对于产酶是必需的。通气量越大，菌体生长越好， 总产酶量相应的也高，但通气量过大时，产ADH酶的比活反而有所下降。
培养温度对 ADH 形成的影响
20mL的产酶培养基，按前述方法接种，在不同温度下 培养16h，其它条件不变，测定生物量后，收集菌体，破菌 测定ADH的酶活，结果见表3。
培养条件为A1B2C3D3，即温度为25℃、pH为5、通气量为250mL、接种量为7%。
菌种生长条件优化
初始pH 通气量 培养温度 接种量
4～6
通气量越大，菌体生长越好
酵母菌是一个中温菌，30℃ 当接种量为5%
温度为25℃、pH为5、通气量为250mL、接种量为 正交结论 7%
乙醇脱氢酶的初步分离及酶学性质
由表1的结果可知，初始pH在4～6之间时菌体的生长最佳，初始pH对菌体 生长和总产ADH酶量的影响较大，但对比活的影响不是很大。
通气量对ADH形成的影响
在总容量为100、150、200、250、300mL的锥型摇瓶中分 别装入20mL的产酶培养基，按前述方法接种，培养16h后，测 定生物量，收集菌体，破菌测定ADH的酶活，结果见表2。
后得出使用锌离子时可得最高的 ADH回收率且洗脱时使用的 EDTA
量最少的结果。
b 染料亲和层析
染料亲和层析是 1968 年英国科学家 Haeckel 和德国科学家 Kopperschlager 分别偶然发现的。他们发现蓝染料和磷酸化激 酶有专一性作用，并成功地应用于纯化酵母中磷酸激酶。之后 许多研究者研究了用活性染料纯化蛋白质，常见的活性染料有 O NH2 ：活性蓝染料。
从图3可以看出,ADH在pH值为7.0时较为稳定。
酶的最适作用温度
将酶液与底物分别在20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、 40 ℃、 45 ℃、50℃、 55℃下反应一段时间 , 测定 ADH 酶活力 , 结果见图4。
从图4可以看出,温度为37℃时ADH酶活力最高。
酶的热稳定性
将酶液分别经30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、 60℃热处理30 min,测定剩余酶活力,结果见图5。
M. NEGORO 和 游离的对羟基苯乙酮做配体 I.WAKABAY ASHI
陈翔
采用三嗪活性染料制备的亲和层 析柱分离纯化ADH。在琼脂糖凝胶 上，分别偶联三嗪活性染料, 制 成染料亲和层析柱。将面包酵母 经超声破碎、高速离心、硫酸铵 分级沉淀、透析、冰冻干燥等步 骤得到脱氢酶粗品, 再经染料亲 和层析柱进一步纯化。
产酶单因素实验

初始pH对ADH酶形成的影响


通气量对ADH形成的影响
培养温度对ADH形成的影响

接种量对ADH酶形成的影响
初始pH对ADH酶形成的影响
将20mL产酶培养基的初始pH分别调至3、4、5、6、7、8、9、10，按 前述方法接种，培养16h后，测定生物量及ADH 的酶活，结果见表 1。
b
双水相沉淀
双水相系统是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间
在水中以适当的浓度溶解会形成互不相溶的两水相或多水相 系统。
双水相萃取法近年来已用于对生化物质的分离，其利用
生化物质在互不相溶的两相中的分配系数不同，而使目标分 子浓缩在一相中从而达到纯化的效果。
M.C.Madhusudhan 等采用硫酸铵及双水相法共同沉淀蛋白 质来纯化ADH。他们通过建立两个体系来比较酶活回收效率。 第一个体系 第二个体系
酶的最适作用p百度文库值
在pH值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 的缓冲溶液中进行酶活力的测定,结果见图2。
从图 2 可以看出 ,ADH 的最适作用 pH值在 7.0～ 10.0,pH值 约为8.0时酶活力最大。
酶的pH值稳定性
将 ADH置于pH值分别为4.0、5.0 、6.0 、7.0、 8.0、9.0、 10.0、 11.0 的缓冲溶液中 ,30℃保温 2h,测定剩余酶活力 ,结 果见图3。
液体培养基
种子的培养
于石英比色皿中加入3mL0.05mol/L Tris－HCl 缓冲液，40μ L0.05mol/L NAD溶液， 40μ L17mol/L C2H5OH溶液后混匀，再加入一定 ADH活性的测定 量的酶液，快速混匀后立即在340nm处测定吸 光度变化值，计算酶活力。定义每分钟A340nm增 加0.001为1活力单位(U)
定化。欲分离的物质与金属离子形成共配位复合物而结合， 再通过降低pH、加入竞争物(如咪唑、组氨基酸等)、使用螯 合剂(如乙二胺四乙酸)等方法洗脱。常用于蛋白质的纯化分 离，如用镍离子螯合柱亲和层析纯化带有 6 个组氨酸短肽的
重组蛋白质。
N.A.Willoughby采用膨胀床金属亲和层析来纯化ADH。其原
以看出ADH是乙醇在人体内代谢的必需酶。
实验准备
菌种 固体培养基 酿酒酵母AY92022 蛋白胨2%，酵母膏1%，葡萄糖2%，琼脂2%， pH6.0，121℃，灭菌20min 蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%，麦芽汁0.3%， pH5.5，121℃，灭菌20min 挑取活化好的菌落接种于5mL的液体培养基中， 28℃摇床培养16h，摇床转速200r/min
从图5可以看出,ADH在温度为30～40℃时较稳定,温度超
过40℃后酶活力急剧下降。
ADH的初步分离及酶学性质
初步分离 作用pH值 作用温度
热稳定性
沉淀分离操作应选择的硫酸铵饱和度范围 在45%～60%,二次沉淀采用50%的硫酸铵盐 析。
pH值约为8.0时酶活力最大。
pH值稳定性 ADH在pH值为7.0时较为稳定。
首先用（NH4）2SO4沉淀之后， 先用聚乙二醇（PEG） 操作过程 将沉淀置于缓冲液中，最后采 沉淀之后，再将上 用双水相萃取。 清液用双水相萃取。 各个过程的参数如聚合物的分子量、浓度以及中性 盐的影响都作了相应的考察，以便提高ADH的回收率。 酶活回收 ADH回收率为90%， ADH回收率为85%，纯化因子4.2 效率 纯化因子6.6倍 考虑参数
从表3可以看出，酵母菌是一个中温菌，30℃左右是其生长和产ADH 酶的最适温度。
接种量对ADH酶形成的影响
选用不同的接种量，加在20mL的产酶培养基中，在30℃、 200r/min 的摇床上培养 16h ，测定生物量后，收集菌体，破 菌测定ADH的酶活，结果见表4。
从表4可以看出，接种量越大，细胞生物量越大，当接种量为5%时， 乙醇脱氢酶的总活性和比活力最高。这可能是因为接种量越大，生长快 的菌体较早进入产酶的下降期所致。
温度为37℃时ADH酶活力最高。
ADH在温度为30～40℃时较稳定。
乙醇脱氢酶的分离纯化
A、沉淀法分离纯化ADH
a、硫酸铵沉淀 b、双水相沉淀
B、亲合层析柱分离纯化
a、金属亲和层析
b、染料亲和层析
A
沉淀法分离纯化ADH
沉淀法是通过改变酶的溶解性，从而使不同的酶从溶液
中析出。常用的沉淀方法有无机盐沉淀、有机溶剂沉淀、 PEG 沉淀、双水相沉淀等，其中最常用的就是无机盐沉淀中 的硫酸铵沉淀。
乙醇脱氢酶的研究进展
乙醇脱氢酶
乙醇脱氢酶（简称ADH），大量存在 于人和动物肝脏、植物及微生物细胞之中， 是一种含锌金属酶，具有广泛的底物特异 性。 在人和哺乳动物体内，乙醇脱氢酶与 乙醛脱氢酶(ALDH)构成了乙醇脱氢酶系, 乙醇脱氢酶与体内乙醇代谢，是人和动物 体内重要的代谢酶。作为生物体内主要短 链醇代谢的关键酶，它在很多生理过程中 起着重要作用。它是一种广泛专一性的含 锌金属酶。
产酶正交实验
根据以上各产酶单因素实验结果，以培养温度、接种量、初始pH、 通气量为影响菌体产酶的主要因素，选用4因素3水平L9(34)正交表进行 正交实验。
从正交实验表6中得到的较组合为A1B2C3D3，验证实验组合A1B2C3D3得到的
ADH活性为2.523U/mL，比正交实验中的每一组都高，所以ADH活性的最优发酵
固定有Cibacron Blue F3GA 的亲和层析柱，乙醇脱氢酶 的纯化倍数为2.0,酶活性回 收率为 30.8％，经过固定 的KE-3B艳红的亲和层析柱, 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的纯 化倍数为23.2, 酶活性回收 率为66.0％
理为：固定化金属离子亲和层析通过螯合作用，将金属粒子结合 在固定相（琼脂糖衍生物）表面，常用的金属粒子为镍锌铜等。 金属粒子能够与氧、氮配体形成复合物。在 ADH 中含有若干组氨 酸，所以能很好地与金属粒子结合。结合之后的洗脱分为三步： 首先降低体系的pH值，其次添加如咪唑或组氨酸等竞争剂，最后 加入强螯合剂如EDTA。通过对锌、镍、铜分别进行实验比较，最

乙醇脱氢酶的初步分离


酶的最适作用pH值
酶的最适作用pH值


酶的最适作用温度
酶的热稳定性
乙醇脱氢酶的初步分离
将离心后的上清液用饱和度分别为10%、20%、30%、40%、 45%、 50%、55%、60%、 65%、 70%、80%的硫酸铵溶液分段盐 析,离心收集沉淀物,结果见图1、表1。
从图 1 可以看出 ,ADH 不出现沉淀的最大硫酸铵饱和度约为 45%,ADH完全沉淀的最小硫酸铵饱和度约为60%。因此,沉淀分离 操作应选择的硫酸铵饱和度范围在45%～60%,二次沉淀采用50% 的硫酸铵盐析。二次沉淀后,ADH比活力从粗酶液的0. 464U·mg-1提高到1.198U·mg-1,纯化倍数为2.582。