基因引物设计PPT课件
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B=G/C/T N=A/G/C/T 简并度：
14
兼并引物设计步骤
利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或 cDNA编码的氨基酸序列
对所找到的序列进行多序列比对 确定合适的保守区域 设计兼并引物（软件或者人工）
15
选择合适的序列进行多重比对； 选择高度保守的序列作为引物； 人工设计时要注意引物序列是和原序列相同还
的测定及DNA-蛋白相互作用等），制定计 划； 了解相近物种该基因的信息，以利于扩增 过程中预测PCR的延伸时间；
4
同源片段的克隆
本实验室的EST数据库； NCBI数据库； RT-PCR用兼并引物扩增同源片段； ✓ 设计兼并引物是重点！！！！！
5
注意事项：
高质量的mRNA和高效率的逆转录； 加大引物浓度； 选择mRNA表达量高的组织做模板； 梯度PCR或者降落PCR； 巢氏PCR; 序列分析；
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5′端可以修饰。
⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
13
兼并碱基：
兼并引物
M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/G/T D=A/G/T
21
染色体步移克隆启动子
22
Tail-PCR
23
荧光素酶活性检测 试剂盒
24
学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
信号肽分析： SignalP( http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )；
磷酸化位点分析：NetPhos 2.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )；
糖基化位点：NetNGlyc 1.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ )；
序列拼接： DNAStar中的Seqman、BL2；
序列在线比对：NCBI-BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ )；
序列多重比对：Bioedit、ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)；
5’末端）；
17
荧光定量引物
纯化方式：PAGE； 产物长度：80-150bp； TM值:58-62; 在编码区内靠近3’末端处设计； 高的特异性：测序及熔解曲线分析；
18
染色体步移引物
以DNA为模板设计引物； 3条重叠引物； 高的退火温度：高于60度；
19
原核表达用引物
会读表达载体图谱；
是反向互补的； 简并度不能太高，可用次黄嘌呤代替N； 引物的3‘端残基尽可能使用确定残基 ； 降落PCR; 巢氏PCR;
16
RACE引物
各3条重叠的引物，引物之间最好距离100-200bp； 若同源片段长度太短，可先做3’RACE，再做
5’RACE； 尽量靠近cDNA末端（3’RACE-3’末端； 5’RACE-
6
3’RACE:
原理：
7
5’RACE
原理：
8பைடு நூலகம்
注意事项：
RNA的完整性； 高效的逆转录酶； 多次5’RACE相结合； 应用丰度高的组织做模板； 长片段扩增应用LA-Taq酶； 同源克隆方法； 用随机引物或者OligoT引导逆转录；
9
序列分析
引物设计：Primer 5.0；
一般的序列处理：DNAStar中的Editseq；
去除信号肽序列；
根据目的表达序列直接取相应序列作为引物，注 意要不要加终止密码子；
在引物的5’末端加酶切位点和相应的保护碱基， 注意方向；
选酶切位点：选择常用的内切酶，并看这两种酶
是否可以在统一体系中进行双酶切；
20
PCR-SSCP引物
PCR产物长度：150-400bp； 高的特异性；
寻找ORF: Editseq、ORF Finder ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html )；
序列作图：Bioedit、EMBOSS ( http://emboss.bioinformatics.nl/ )；
构建进化树:MEGA 4.1；
10
11
引物设计
兼并引物 RACE引物 荧光定量引物 染色体步移引物 原核表达用引物 PCR-SSCP引物
12
总原则
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特 异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
25
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
常用实验技术简介
2011-8-4
1
目录
全长cDNA克隆 引物设计 染色体步移技术
2
全长cDNA克隆
是许多后续更深入实验的基础；
真核生物mRNA的特征及转录过程的了解；
全长cDNA克隆方法：灵活掌握； ➢ 同源克隆技术 ➢ RACE-PCR技术
3
基因克隆前的准备工作
看有没有被别人克隆出来； 查看文献了解基因的功能及表达特征； 了解该基因可能涉及的工作（如激酶活性
蛋白结构域分析：SMART( http://smart.emblheidelberg.de/ )；
蛋白理化性质分析及二、三级结构分析： EXPASY( http://www.expasy.ch/tools/ )、Psipred ( http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ )；
14
兼并引物设计步骤
利用ncbi搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或 cDNA编码的氨基酸序列
对所找到的序列进行多序列比对 确定合适的保守区域 设计兼并引物（软件或者人工）
15
选择合适的序列进行多重比对； 选择高度保守的序列作为引物； 人工设计时要注意引物序列是和原序列相同还
的测定及DNA-蛋白相互作用等），制定计 划； 了解相近物种该基因的信息，以利于扩增 过程中预测PCR的延伸时间；
4
同源片段的克隆
本实验室的EST数据库； NCBI数据库； RT-PCR用兼并引物扩增同源片段； ✓ 设计兼并引物是重点！！！！！
5
注意事项：
高质量的mRNA和高效率的逆转录； 加大引物浓度； 选择mRNA表达量高的组织做模板； 梯度PCR或者降落PCR； 巢氏PCR; 序列分析；
⑥ 引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦ 引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧ 引物5′端可以修饰。
⑨ 引物3′端不可修饰。
⑩ 引物3′端要避开密码子的第3位。
13
兼并碱基：
兼并引物
M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/G/T D=A/G/T
21
染色体步移克隆启动子
22
Tail-PCR
23
荧光素酶活性检测 试剂盒
24
学习总结
经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量 Study Constantly, And You Will Know Everything. The More
You Know, The More Powerful You Will Be
信号肽分析： SignalP( http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ )；
磷酸化位点分析：NetPhos 2.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/ )；
糖基化位点：NetNGlyc 1.0 Server ( http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ )；
序列拼接： DNAStar中的Seqman、BL2；
序列在线比对：NCBI-BLAST ( http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ )；
序列多重比对：Bioedit、ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)；
5’末端）；
17
荧光定量引物
纯化方式：PAGE； 产物长度：80-150bp； TM值:58-62; 在编码区内靠近3’末端处设计； 高的特异性：测序及熔解曲线分析；
18
染色体步移引物
以DNA为模板设计引物； 3条重叠引物； 高的退火温度：高于60度；
19
原核表达用引物
会读表达载体图谱；
是反向互补的； 简并度不能太高，可用次黄嘌呤代替N； 引物的3‘端残基尽可能使用确定残基 ； 降落PCR; 巢氏PCR;
16
RACE引物
各3条重叠的引物，引物之间最好距离100-200bp； 若同源片段长度太短，可先做3’RACE，再做
5’RACE； 尽量靠近cDNA末端（3’RACE-3’末端； 5’RACE-
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3’RACE:
原理：
7
5’RACE
原理：
8பைடு நூலகம்
注意事项：
RNA的完整性； 高效的逆转录酶； 多次5’RACE相结合； 应用丰度高的组织做模板； 长片段扩增应用LA-Taq酶； 同源克隆方法； 用随机引物或者OligoT引导逆转录；
9
序列分析
引物设计：Primer 5.0；
一般的序列处理：DNAStar中的Editseq；
去除信号肽序列；
根据目的表达序列直接取相应序列作为引物，注 意要不要加终止密码子；
在引物的5’末端加酶切位点和相应的保护碱基， 注意方向；
选酶切位点：选择常用的内切酶，并看这两种酶
是否可以在统一体系中进行双酶切；
20
PCR-SSCP引物
PCR产物长度：150-400bp； 高的特异性；
寻找ORF: Editseq、ORF Finder ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html )；
序列作图：Bioedit、EMBOSS ( http://emboss.bioinformatics.nl/ )；
构建进化树:MEGA 4.1；
10
11
引物设计
兼并引物 RACE引物 荧光定量引物 染色体步移引物 原核表达用引物 PCR-SSCP引物
12
总原则
① 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特 异性。
② 产物不能形成二级结构。
③ 引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤ 碱基要随机分布。
25
结束语
当你尽了自己的最大努力时，失败也是伟大的， 所以不要放弃，坚持就是正确的。
When You Do Your Best, Failure Is Great, So Don'T Give Up, Stick To The End 演讲人：XXXXXX 时 间：XX年XX月XX日
常用实验技术简介
2011-8-4
1
目录
全长cDNA克隆 引物设计 染色体步移技术
2
全长cDNA克隆
是许多后续更深入实验的基础；
真核生物mRNA的特征及转录过程的了解；
全长cDNA克隆方法：灵活掌握； ➢ 同源克隆技术 ➢ RACE-PCR技术
3
基因克隆前的准备工作
看有没有被别人克隆出来； 查看文献了解基因的功能及表达特征； 了解该基因可能涉及的工作（如激酶活性
蛋白结构域分析：SMART( http://smart.emblheidelberg.de/ )；
蛋白理化性质分析及二、三级结构分析： EXPASY( http://www.expasy.ch/tools/ )、Psipred ( http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/ )；