植物过氧化物酶检测试剂盒(愈创木酚比色法)
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制过氧化物酶(POD)活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H0存在条件下，过氧化物酶能使愈创木22酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)、反应混合液[100mmol/L磷酸缓冲液(Ph6.0)50mL，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL，混合均匀保存在冰箱中]方法步骤】【(1)、粗酶液的提取称取小麦叶片0.25g，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL，于研钵中研成匀浆，以4000r/min离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
(2)、酶活性的测定取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL，KH2PO41mL，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL，稀释后的酶液1mL(如表1)，立即开启秒表，于分光光度计470nm波长下测量OD值，每隔1min读数一次(4min)。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD酶活性配置表管号 S0(对照) S1(实验) S2(实验)反应混合液(ml) 3.0 3.0 3.0KH2PO4 (ml) 1.0 0.0 0.0酶液 (ml) 0.0 1.0 1.04.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以ΔA 470 /[min ? g (鲜重) ]表示之。
也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位( u )表示。
, ， A V 470 T，，， 0 .0 1 V t FW 1POD总活性[u/g(FW)]=式中:POD总活性以酶单位每克鲜重表示。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL 。
植物过氧化物酶实验报告
一、实验目的1. 了解过氧化物酶在植物生理过程中的作用。
2. 掌握愈创木酚法测定过氧化物酶活性的原理和方法。
3. 通过实验，提高学生运用实验方法分析植物生理问题的能力。
二、实验原理过氧化物酶（POD）是一种广泛存在于植物体内的酶，催化H2O2分解产生O2和H2O。
愈创木酚法是一种测定POD活性的常用方法，其原理是POD催化H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物，该产物在470 nm处有最大光吸收值。
通过测定该波长下的吸光度变化，可以计算出POD的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：马铃薯块茎2. 仪器：分光光度计、离心机、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管3. 试剂：100 mmol/L的磷酸缓冲液（pH 6.0）、愈创木酚溶液、30% H2O2、20 mmol/L KH2PO4四、实验步骤1. 制备酶提取液：取马铃薯块茎约0.5 g，加入5 mL磷酸缓冲液（pH 6.0），研磨均匀，过滤，收集滤液，4℃下保存备用。
2. 测定酶活性：a. 设置酶活性测定体系：取2 mL酶提取液，加入1 mL 30% H2O2和1 mL愈创木酚溶液，混匀，立即放入分光光度计中，于470 nm处测定吸光度。
b. 设置对照体系：取2 mL酶提取液，加入1 mL磷酸缓冲液（pH 6.0）和1 mL愈创木酚溶液，混匀，立即放入分光光度计中，于470 nm处测定吸光度。
3. 计算酶活性：a. 酶活性 = [(A1 - A2) / (t2 - t1)] × 0.01 × (1.977 - 0.874) / 10 × 0.01 × 250.027575b. 其中，A1为酶活性测定体系的吸光度，A2为对照体系的吸光度，t1为酶活性测定体系测定时间，t2为对照体系测定时间。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过实验，得到马铃薯块茎中POD的活性为0.027575 U/g。
2. 结果分析：a. 从实验结果可以看出，马铃薯块茎中含有一定量的POD，且活性较高。
过氧化物酶(POD)试剂盒说明书
过氧化物酶(POD)试剂盒说明书一、测定原理：利用过氧化物酶(POD)催化过氧化氢反应的原理，通过测定420nm 处吸光度的变化得出其酶活性。
二、实际的组成和配置试剂一：液体60ml×4瓶，4℃保存6个月试剂二：粉剂×3瓶，4℃保存6个月试剂二应用液的配置：临用每瓶粉剂加入10ml 的双蒸水溶解，4℃避光保存试剂三：液体5ml×1瓶，4℃保存6个月试剂三应用液的配制：临用前用双蒸水15倍稀释，使得1cm 光径，双蒸水调零时A240保持在0.4左右，现用现配。
若A 值太高，则加双蒸水稀释，若A 值太低，则加入适量试剂三。
（一般在25倍左右稀释）试剂四：液体50ml×2瓶，4℃保存6个月。
三、操作步骤：1、前处理：植物组织匀浆的制备：准确称取组织重量，按照重量(g):体积(ml)=1:9的比列加入9倍体积的匀浆介质(推荐使用生理盐水或磷酸盐缓冲液:0.1 mol/L pH 7-7.4)，冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆液，3500r/min 离心10min ，取上清液进行测定。
混匀后，3500r/min 离心10min ，取上清于波长420nm 处，1cm 光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。
四、计算及举例1、定义：在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1ug 底物的酶量定义为一个酶活力单位。
2、植物组织中过氧化物酶(POD)活力计算公式：10)/()min 30()()()1(12-)/(⨯÷÷⨯⨯=ml mgprot ml ml cm OD OD mgprot U POD 匀浆蛋白浓度反应时间样本量反应液总体积比色光经值对照值测定活力 3.计算举例取新鲜桑叶，制备成10%匀浆，取100ul 匀浆上清，按照操作表进行操作，测得数据如下：对照OD 0.237；测定OD 0.665；同时测得10%桑叶匀浆蛋白浓度是1.80mgprot/ml 根据公式计算如下:mgprotU ml mgprot ml ml cm OD OD mgprot U POD / 26.42010001.80300.14.01120.237-0.6651000)/()min 30()()()1(12-)/(=⨯÷÷⨯⨯=⨯÷÷⨯⨯=匀浆蛋白浓度反应时间样本量反应液总体积比色光经值对照值测定活力。
酶活性的测定
式中
A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7mg
1.7—1ml H2O2。
0.1mol/L旳KMnO4相当于
紫外分光光度法:
H化测2O氢量2在，吸2使光40反率nm应旳波溶变长液化下吸速有光度强度即烈可(吸A测2收40出)，随过过反氧氧应化化时氢氢间酶酶而旳能降活分低性解。。过根氧据 以1min内A240降低0.1旳酶量为1个酶活单位（u）。
硫酸盐缓冲液，盐酸羟胺，黄嘌呤，黄嘌 呤氧化酶，醋酸等。
试验环节：
计算措施：
每毫升反应液中SOD 抑止率达50％时相应 旳SOD 量为一种SOD 活力单位（U），待测 样品中旳SOD 活力由下式计算：
SOD克制率（％）＝（A2-A1）/A2×100% SOD 活力（U/ml）＝（A2-A1）
据此，可根据H2O2旳消耗量或O2旳生成量测定该酶活力大小。 在反应系统中加入一定量（反应过量）旳H2O2溶液，经酶促反 应后，用原则高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多出旳H2O2
。
即可求出消耗旳H2O2旳量。
酶表活达性 ：用每克鲜重样品1min内分解H2O2旳毫克数
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
测定茶树鲜叶APX活性旳最佳条件
PVPP旳加入量为鲜叶重旳1.5倍，提取液pH 为7.8，反应液pH为7.0，底物AsA浓度为 0.5mmol/L。
注意事项：
（1）因为测定反应是经过加液量控制在60s内，使产生旳A290光值下 降呈良好旳线性关系。
1.试剂： 0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液
(pH8.2
植物过氧化物酶(POD)ELISA试剂盒使用说明书
植物过氧化物酶（POD）ELISA试剂盒使用说明书药品名称：通用名：过氧化物酶（POD）酶联免疫诊断试剂盒使用目的：本试剂盒用于测定组织，细胞及其它相关样本中过氧化物酶（POD）含量。
实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中过氧化物酶（POD）水平。
用纯化的过氧化物酶（POD）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入过氧化物酶（POD）抗原，再与HRP标记的过氧化物酶（POD）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的过氧化物酶（POD）呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中过氧化物酶（POD）抗原浓度。
1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
（稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为240 U/L，160 U/L ，80 U/L，40U/L，20 U/L）。
过氧化物酶活性的测定
园艺学院设施201402李密实验三（一）过氧化物酶活性的测定（愈创木酚法）一、实验目的通过实验掌握提取POD和测定其活性的方法和原理。
二、实验原理以愈创木酚为底物，在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。
此产物在470nm波长处有最大光吸收值，故可通过测470nm波长下的吸亮度变化测定过氧化物酶的活性。
三、材料、设备和原理1.材料马铃薯块茎2.设备光亮度计、离心机、天平、研钵、容量瓶、量筒、试管、吸管3.试剂已配置好的反应混合液、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸缓冲液四、操作方法1.酶液制备2．比色测定计算：酶活力（0.01A 470/min ）=A2−A1(t2−t1)×0.01×D=0.875−0.385(7−2)×0.01×25 =245.0酶的比活力（μ/g ）=酶活力（μ）样品重(g )或样品中蛋白质的含量（mg ）=245.00.9956=246.08 六、讨论1、由于仪器较少,等待测POD 值的时间较长,且没有放在低温下保持。
导致酶活性的测定结果出现一定的偏差。
2、理论上POD 值与时间的关系曲线应为抛物线，但实际测出来的曲线大体为线性关系。
可能原因有①把酶液加入到3ml 反应混合液时，反应太快，待到1min 读取POD 值时，反应已经过了指数增长期，处于缓慢增长状态。
②离心出来的酶液在室温下放置时间过长。
（二）可溶性蛋白质含量的测定（考马斯蓝G -250法）一、实验目的掌握测量可溶性蛋白的方法及其原理。
二、实验原理可溶性蛋白质与考马斯蓝G -250反应生成青色产物，在595nm 波长有最大吸收峰，其颜色深浅与可溶性蛋白含量成正相关，可用分光亮度法测定可溶性蛋白的含量。
三、材料、设备和原理 1.材料马铃薯提取液2.设备分光亮度计、10ml 刻度试管、移液管3.试剂考马斯蓝G -250、100μg/ml 标准蛋白液 四、操作方法 1. 标准曲线制作2. 样品液测定试剂 0号 1号 2号 3号 4号 5号 标准蛋白体积/ml 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 蒸馏水体积/ml 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 考马斯蓝G -250/ml 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量/ g20406080100取10ml 刻度试管6只以100μg 标准蛋白液为母液配制成0、20、40、60、80、100的系列浓度蛋白液 即：在6支试管中分别加蛋白液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml,并加蒸馏水 在各试管中加考马斯蓝G -250，摇匀 在595nm 下，测定各管吸亮度 以蛋白含量为横轴，A595为纵轴，绘制标准曲线595计算：实验测得马铃薯提取液的吸亮度值为0.106由Y=0.0059x得x=0.106/0.0059 =17.97μg/ml蛋白含量=m w ▪1000×V 总V1=17.970.9956×1000×250.5=0.902 六、讨论1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min 内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
过氧化物酶(Peroxidase,POD)试剂盒使用说明
3、细菌或细胞 POD 活性
（1）按样本蛋 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活 力单位。
POD（U/mg prot）＝245μL（反应体系）÷1000μL×提取酶液总体积（1000μL）÷样 本体积（5μL）÷0.01×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）=4900×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）
2、组织 POD 活性
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白在每 ml 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个酶 活力单位。
POD（U/mg prot）＝245μL（反应体系）÷1000μL×提取酶液总体积（1000μL）÷样 本体积（5μL）÷0.005×ΔA 测定÷蛋白质浓度（mg/mL）=9800×ΔA÷蛋白质浓度（mg/mL）
用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清（浆）POD 活性
单位的定义：每 mL 血清（浆）在每 ml 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个 酶活力单位。
POD（U/mL）＝245μL（反应体系）÷1000μL×血清（浆）总体积（1000μL）÷样本 体积（5μL）÷0.005×ΔA =9800×ΔA
（2）按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在每 ml 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一 个酶活力单位。
POD（U/104 cell）＝245μL（反应体系）÷1000μL×提取酶液总体积（1000μL）÷样 本体积（5μL）÷0.01×ΔA÷细菌或细胞密度（104 cell /mL）=4900×ΔA÷细菌或细胞密 度（104 cell /mL）
（2）按样本鲜重计算
单位的定义：每 g 组织在每 ml 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单 位。
过氧化物酶
植物体内过氧化物酶活性测定及同工酶电泳
过氧化物酶活性测定
一、原理
1. 过氧化物酶[perox idase, POD] ： 广泛存在于各种动物、植物和微生物 体内。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应: RH2+ H2O2→2H2O + R 2. POD 分子结构特点：POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白, 脱 辅基蛋白分子须与血红素结合才构成全酶。
3. POD的主要生理功能： ◆ 参与活性氧代谢过程； ◆ 参与木质素和木栓质的合成； ◆ 参与生长素的降解。
二、实验材料与试剂 1.材料：玉米幼苗
2.试剂： 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）；0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 愈创木酚； H2O2
三、实验步骤
1. 提取酶液：取样品1.0g，加入2ml的0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液，冰浴研 磨，10000rpm，4℃离心后取上清，即为粗酶液。 2. 酶活性测定：采用愈创木酚比色法测定，对照为煮沸5分钟的粗酶液，反应 体系包括：0.05mol/L pH5.5的磷酸缓冲液2.9ml；0.05 mol/L愈创木酚1ml; 2%H202 1ml；粗酶液0.1 ml，反应1分钟后，立刻在470nm下，测定OD值。 以每分钟在470nm处吸光度的变化0.01为一个酶活单位。 3. 计算酶活性：选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式计算； 以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活力单位（U）。
二、材料、仪器设备及试剂
1.材料：玉米幼苗
2.仪器设备：稳流稳压电泳仪；冷冻离心机及离心管； pH试纸； 3.试剂： （1)分离胶缓冲液（pH8.9）：1mol/L HCl 48ml，Tris36.6g， TEMED0.23ml，加水定容 至100ml。 (2)分离胶贮液：30g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml，过滤 后使用。 (3)过硫酸铵溶液：过硫酸铵0.2g，加水定容至100ml制胶时现配现用）。 (4)浓缩胶缓冲液：1mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml，调pH6.7，并定容至 100ml。 (5)浓缩胶贮备液：丙烯酰胺10g，甲叉双丙烯酰胺2.5g,加水定容到100ml，使用前过滤。 (6)电极缓冲液：Tris 6.0g，Gly 28.8g， 用水定容至1000ml（pH8.3），用前稀释10倍。 (7)四甲基乙二胺（TEMED）。 (8)0.1％的溴酚蓝水溶液。 (9)联苯胺染色母液：联苯胺1g＋冰醋酸18ml＋H2O2ml溶解贮于棕色瓶中。
过氧化物酶活性的测定-愈创木酚法
过氧化物酶活性的测定 愈创木酚法目的意义 过氧化物酶是植物体内重要的呼吸酶类，其活性高低与酚类物质代谢、物 抗性密切相关。
通过实验掌握提取POD 和测定其活性的方法及其原理。
过氧化物酶催化H 202氧化酚类，生成醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子 缩合，产生颜色较深的产物。
本实验以愈创木酚为底物，过氧化物酶催化H 202将愈创木酚 氧化生成茶褐色产物，此产物在470nm 波长处有最大吸收峰，故可通过测定470nm 波长下 的吸光度变化得知过氧化物酶的活性。
三、材料、设备和试剂1．材料 植物叶片。
2．设备 UVI1240型分光光度计、离心机、秒表(或手表)、天平、研钵、磁力搅拌器。
3．试剂 愈创木酚、30％过氧化氢、20mmol/L KH 2PO 4、100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6．0)。
反应混合液配制 取100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0)50ml 于烧杯中，加入愈创木酚28µl， 于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚完全溶解，待溶液冷却后，加入30％过氧化氢19µl 以，混合均匀，保存于冰箱中。
三、操作方法1．酶液制备称取植物材料0.5g ，加入20mmol/L KH 2PO 4溶液5m1，于研钵中研磨成匀浆，在5000r/min 下离心10min ，上清液备用。
2．比色测定取光径1cm 比色杯2只，于1只中加入已混匀的反应混合液3m1，KH 2PO 4溶液1ml ，作 为参比液；另一只中加入反应混合液3ml ，酶液1m1(如酶活性过高可稀释之)，立即记时并 置于分光光度计中。
在470nm 下测定光密度，每隔30s 读数一次，连续测1min 。
四、实验结果1．以时间为横坐标，光密度为纵坐标作图。
反应前期过氧化氢酶活性随反应时间直线上升，升到最大值后，其相关曲线出现转折点，转折出现的早晚取决于温度。
在曲线的前期部分找到一段近似直线的部分，和直线起点时间t 1和光密度A 1、直线终点时间t 2和光密度A 2。
过氧化物酶
过氧化物酶（POD）活性测定：
粗酶液制备同SOD。
1、过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）
（1）试剂配制：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)：分别取A母液(Na2HPO4 ) 61.5ml和B母液(NaH2PO4 ) 438.5ml混匀即为1000ml PBS(0.2M，pH6.0)；
（2）反应混合液配制：取50ml PBS(100mmM，pH6.0)，加入28ul愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入19ul 30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。
（3）样品测定：称取1g，放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000r/min离心15min，上清液转入100ml容量瓶,用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。
取试管3支，一支取3ml反应液并加入磷酸缓冲液1ml作调零，两支取3ml反应液并加入1ml酶液，立即计时，在470nm测定，酶隔30s 读书一次。
测一个样加一个，不要全部加上。
（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。
POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）(u/g min)
ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时取用酶液体积。
实验十一 植物体内过氧化物酶活性的测定
活力单位(U) w(g FW)
W=W总（g FW)* V(mL)/V总
实验十一 植物体内过氧化物酶 活性的测定
——愈创木酚比色法
一、原理
过氧化物酶 过氧化物酶[perox idase, POD] 广泛 存在于各种动物、植物和微生物体内。 催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧 化反应: RH2+ H2O2→2H2O + R
•2 POD 分子结构特点
POD 是一种由单一肽链与卟啉构成的血 红素蛋白, 脱辅基蛋白分子须与血红素结 合才构成全酶。
3mL反应液+0.2mL粗酶液，震荡混匀后 立刻记时，以3mL反应液+ 0.2mL磷酸缓 冲液调零，测OD470，30’’内读第一次数， 之后每10S读数一次，至OD值>1.000。
3、计算酶活性
选取OD值变化较均匀的一段数据，代入公式 计算； 以每分钟OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活 力单位（U）。
3、POD的主要生理功能
参与活性氧代谢过程； 参与木质素和木栓质的合成； 参与生长素的降解。
注：除了与植物正常代谢和生长发育相关 的结构型POD 外, 很大部分POD的合成属于诱 导表达型。
二、实验材料与试剂
实验材料： 不同浓度Cd处理7d的菱叶片； 试剂 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0） 愈创木酚； H2O2。
三、实验步骤
1. 提取酶液：
叶片2片（w gFW）+pH7.0磷酸缓冲液5mL 研磨，离心（4000rpm*10min），上清液 即为粗酶液。
2、配制反应液
1mol/L 磷酸缓冲液（pH6.0） 50ml +28uL愈创木酚+19uLH2O2(30%)
过氧化物酶(POD)试剂盒说明书
过氧化物酶(POD)试剂盒说明书一、测定原理：利用过氧化物酶(POD)催化过氧化氢反应的原理，通过测定420nm 处吸光度的变化得出其酶活性。
二、实际的组成和配置试剂一：液体60ml×4瓶，4℃保存6个月试剂二：粉剂×3瓶，4℃保存6个月试剂二应用液的配置：临用每瓶粉剂加入10ml 的双蒸水溶解，4℃避光保存试剂三：液体5ml×1瓶，4℃保存6个月试剂三应用液的配制：临用前用双蒸水15倍稀释，使得1cm 光径，双蒸水调零时A240保持在0.4左右，现用现配。
若A 值太高，则加双蒸水稀释，若A 值太低，则加入适量试剂三。
（一般在25倍左右稀释）试剂四：液体50ml×2瓶，4℃保存6个月。
三、操作步骤：1、前处理：植物组织匀浆的制备：准确称取组织重量，按照重量(g):体积(ml)=1:9的比列加入9倍体积的匀浆介质(推荐使用生理盐水或磷酸盐缓冲液:0.1 mol/L pH 7-7.4)，冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆液，3500r/min 离心10min ，取上清液进行测定。
混匀后，3500r/min 离心10min ，取上清于波长420nm 处，1cm 光径，双蒸水调零，测定各管吸光度值。
四、计算及举例1、定义：在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化1ug 底物的酶量定义为一个酶活力单位。
2、植物组织中过氧化物酶(POD)活力计算公式：10)/()min 30()()()1(12-)/(⨯÷÷⨯⨯=ml mgprot ml ml cm OD OD mgprot U POD 匀浆蛋白浓度反应时间样本量反应液总体积比色光经值对照值测定活力 3.计算举例取新鲜桑叶，制备成10%匀浆，取100ul 匀浆上清，按照操作表进行操作，测得数据如下：对照OD 0.237；测定OD 0.665；同时测得10%桑叶匀浆蛋白浓度是1.80mgprot/ml 根据公式计算如下:mgprotU ml mgprot ml ml cm OD OD mgprot U POD / 26.42010001.80300.14.01120.237-0.6651000)/()min 30()()()1(12-)/(=⨯÷÷⨯⨯=⨯÷÷⨯⨯=匀浆蛋白浓度反应时间样本量反应液总体积比色光经值对照值测定活力。
植物体内过氧化物酶活性的测定
植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控 IAA 水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的 H2O2的毒害作用。
故在科研上常加以测定。
二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色 4 －邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（ A ）值，即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。
3. 试剂及配制：0.1mol·L－1磷酸缓冲液（ pH7 ）。
反应液（100ml 0.1mol · L－1磷酸缓冲液（ pH6 ）中加入 0.5ml 愈创木酚、 1ml 30 ﹪ H 2 O 2，充分摇匀）。
四、实验步骤1. 酶液提取称取植物叶片 1g ，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为 10mlpH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在 8000 r / min 离心 15min ，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。
2. 酶活性测定吸取反应液 3ml 于试管中，加入酶提取液 0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径 1cm 的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在 470nm 波长处，以时间扫描方式，测定 3min 内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△ A 470 ）。
五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性△ A 470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1） = ————————————————————样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）。
植物抗坏血酸过氧化物酶(APX)ELISA试剂盒说明书
植物抗坏血酸过氧化物酶(APX)ELISA试剂盒说明书抗坏血酸过氧化物酶试剂盒用于测定植物组织，细胞及其它相关样本中抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性。
ELISA原理：本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中植物抗坏血酸过氧化物酶(APX)水平。
用纯化的植物抗坏血酸过氧化物酶(APX)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入植物抗坏血酸过氧化物酶(APX)，再与HRP标记的抗坏血酸过氧化物酶(APX)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜色的深浅和样品中的抗坏血酸过氧化物酶(APX)呈正相关。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中植物抗坏血酸过氧化物酶(APX)浓度。
标本要求：1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。
若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤：1. 标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10孔，在第一、第二孔中分别加标准品100μl，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉，再各取50μl分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六孔中各取50μl分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl，混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。
(稀释后各孔加样量都为50μl，浓度分别为150 IU/ml，100 IU/ml，50 IU/ml，25 IU/ml ，12.5IU/ml)。
酶活性的测定
计算公式
每克鲜叶APX的酶活性U= （X×7.5×1000×60×1000）/ （m×2.8×20×10） 上式中，X：OD值的变化；7.5：每克材料 提取7.5mL粗酶液；1000：将ml转化成µL； 60：将1min转化成60s；1000：将mmol转化 成µmol；m：鲜叶的重量，单位为g；2.8： 吸光系数mmol/L cm；20：用20µL酶液进行 活性测定；10：每10s记录吸光值的变化。
过氧化氢酶的应用：
被用于食品包装，防止食物被氧化。 在纺织工业中，被用于除去纺织物上的过氧化氢，以保证成品是不含 过氧化物的。 它还被用在隐形眼镜的清洁上：眼镜在含有过氧化氢的清洁剂中浸泡 后，使用前再用过氧化氢酶除去残留的过氧化氢。 近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该 酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。 植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸（利用氧气并生成二氧化碳） 和共生性氮固定（将氮气(N2）解离为活性氮原子）。细胞被病原体 感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂。 其活性也与粮食品质之间有一定的相关性，是一项衡量谷物品质的 重要指标。
方法比较：
研究认为，化学滴定法重复性差、紧密度 低、操作繁琐、检测线低，不适于大批量 的样品测定。其优点是不需要任何特殊的 仪器，适用性比较广泛。 紫外分光光度法具有重现性好，操作简单、 快速、检测线相对较低得到优点。但是对 于测定底物或产物改变量方面不太准确。
总结：
综上所述，过氧化氢酶活性测定的方法大都基于 过氧化氢酶催化过氧化氢的分解反应：根据反应 生成的氧气的量、反应剩余的过氧化氢的量或根 据反应时的电子的转移及电流的变化等。同时， 影响测定结果的因素很多，如过氧化氢的浓度、 酸度、温度及重金属的含量等；并且各种方法的 准确性和灵敏度也有一定差异。因此，在测定CAT 活性时，应该根据具体组织种类及测量要求选择 适合的测定的方法。
愈创木酚法测定过氧化物酶活性
愈创木酚法测定过氧化物酶活性一、实验目的过氧化物酶是植物体内普遍存在的､活性较高的一种酶，它与呼吸作用､光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断变化，可以反映某一时期植物体内代谢的变化｡二、实验原理在过氧化物酶(peroxidase POD)催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物｡此产物在470nm处有最大光吸收值，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性｡三、实验材料海滨锦葵叶片四、实验设备与试剂1、实验设备①可见光分光光度计；②离心机；③研钵；④容量瓶；⑤量筒；⑥试管；⑦吸管｡2、实验试剂0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH5.5)；0.05mol/L愈创木酚溶液；2%H2O2；20%三氯乙酸五、实验步骤(一)酶液的制备取1.0~5.0g洗净的海滨锦葵叶片，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。
将匀浆液全部转入离心管中，于3000rmp离心10min，上清液转入25mL容量瓶中。
沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。
(二)过氧化物酶活性测定酶活性测定的反应体系包括: 2.9mL0.05mol/L磷酸缓冲液；1.0mL2%H2O2；1.0mL0.05mol/L愈创木酚和0.1mL酶液。
用加热煮沸5min的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保温15min，然后迅速转入冰浴中，并加入20%三氯乙酸2.0mL终止反应，然后过滤（或5000r/min离心10min），适当稀释，470nm波长下测定吸光度。
六、实验结果以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位(U)｡过氧化物酶活性[Ug·min]=△A470×V TW×V S×0.01×t式中:△A470——反应时间内吸光度的变化；W——马铃薯鲜重(g)；t——反应时间(min)；V T——提取酶液总体积(mL)；V S——测定时取用酶液体积(mL)｡七、注意事项酶液的的提取过程要尽量在低温温条件下进行｡H2O2要在反应开始前加，不能直接加入｡。
植物组织中过氧化物酶活性的测定
实验四植物组织中过氧化物酶活性的测定一、实验目的：1、学习测定植物组织中过氧化物酶活性的方法。
二、实验原理：过氧化物酶（POD）广泛存在于植物体中，该酶催化H2O2氧化，以清除H2O2对细胞生物功能分子的破坏作用。
在有H2O2存在的条件下，过氧化物酶使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测定470nm处茶褐色物质的生成量以检测POD活性。
三、实验仪器及材料：1、仪器：研钵、剪刀、天平、量筒、试管、分光光度计、移液管、比色皿、离心机、秒表2、材料与试剂：苹果、经逆境处理的绿豆幼苗、反应混合液、20mmol/LKH2PO4四、实验步骤：1、POD的提取分别称取绿豆幼苗、苹果果肉各2g,分别加入预冷的10ml 20mmol/LKH2PO4，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min离心10min，收集上清液，待用。
2、POD活性的测定取分光光度计比色杯2只，在其中一只加入3ml反应混合液和1ml KH2PO4作为对照；另一只加入3ml反应混合液，1ml苹果上清液，立即开启秒表计时，测定470nm处OD值，每隔30s读数一次。
取1ml绿豆幼苗上清液重复上述操作。
五、实验结果：1、在酶液中加入3ml反应混合液后，苹果酶液立即呈茶褐色，而绿豆幼苗酶液的茶褐色深至黑褐色。
2、苹果酶液以及绿豆幼苗酶液在470nm处OD值如下：苹果酶液OD值与时间的关系曲线图以每分钟光密度（OD470nm）变化0.01为一个过氧化物酶活力单位，即：苹果POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D=[（0.28－0.249）/（0.01×3×2）] ×D=0.52D（此值忽略稀释倍数）其中w为样品鲜重，t为反应时间，D为稀释倍数绿豆幼苗酶液OD值与时间的关系曲线图绿豆幼苗POD活性=[ΔOD470/(0.01×wt)] ×D=[（0.940－1.56）/（0.01×3·2）] ×D =6.3 D（此值忽略与苹果酶液相同的稀释倍数）由于绿豆幼苗酶液浓度较大，测OD值前稀释了两倍，所以绿豆幼苗酶液POD 活性为12.67D六、结果分析：1、由苹果酶液OD值与时间的关系曲线图中，OD值与时间的关系基本呈线性关系，故任取变化较均匀的一段数据均可计算出POD活性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚比色法)
简介：
过氧化物酶(peroxisome ，POD)是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢，氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
该酶属于细胞木质素合成途径中间的关键酶，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。
Leagene 植物过氧化物酶(POD)检测试剂盒(愈创木酚比色法)检测原理是以愈创木酚(又称2-甲氧基酚)作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于分光光度计检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算。
该试剂盒主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的过氧化物酶活性，尤其适用于检测水果中过氧化物酶活性。
该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：
自备材料：
1、 蒸馏水
2、 研钵或匀浆器
3、 离心管或试管
4、 低温离心机
5、 水浴锅或恒温箱
6、 比色杯
7、 分光光度计
操作步骤(仅供参考)：
1、 准备样品：
①植物样品：取2g 植物组织或水果中层果肉加入4ml 预冷的POD Lysis buffer 研磨或匀
编号 名称
TE0425 50T Storage
试剂(A): POD Lysis buffer 250ml 4℃ 试剂(B): POD Assay buffer 100ml 4℃ 避光 试剂(C): POD 氧化剂 4ml
RT 使用说明书
1份
浆离心，留取上清液，冻存，用于过氧化物酶的检测。
②血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，冻存，用于过氧化物酶的检测。
③细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如有必要用POD Lysis buffer进行适当匀浆，离心，取上清液，冻存，用于过氧化物酶的检测。
④高活性样品：如果样品中含有较高活性的过氧化物酶，可以使用POD Lysis buffer进行恰当的稀释。
2、配制POD Assay buffer工作液：取适量POD氧化剂和POD Assay buffer，POD氧
化剂：POD Assay buffer按一定比例混合，即为POD Assay buffer工作液，即配即用，不宜久置。
3、加样：按照下表设置对照管、测定管，注意：对照管、测定管中为同一待测样品，但对
照管中为提前加热煮沸的样品。
溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。
如果样品中的POD活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。
样品的检测最好能设置平行管，求平均值。
加入物(ml) 对照管测定管
待测样品0.05 0.05
POD Lysis buffer 1.45 1.45
POD Assay buffer工作液 1 1
4、POD检测：立即以分光光度计，比色杯光径1.0cm，以对照管为对照，测定测定管的
吸光度(A测定0)。
准确孵育后，立即加入POD终止液终止反应(备选方案)，以分光光度计，比色杯光径1.0cm，以对照管为对照，测定测定管的吸光度(A测定1)。
注意：加入POD终止液终止反应不是必须步骤，可准确孵育后直接以分光光度计，比色杯光径
1.0cm，以对照管为对照，测定测定管的吸光度(A测定1)。
计算：
POD活性单位的定义：在该实验条件下，每1min吸光度变化0.01所需酶量为一个活性单位。
组织样本POD(U)={(A测定1-A测定0)×V T}/(W×V S×0.01×t)
式中：A测定1=孵育3min后测定管的吸光度值
A测定0=加入POD Assay buffer工作液后立即测定的测定管吸光度值
W=组织样本的重量(g)
V T=提取酶液的总体积(ml)
V S=测定时所用酶液体积(ml)
液体样本POD(U)=(A测定1-A测定0)/(0.01×t)
式中：A测定1=孵育3min后测定管的吸光度值
A测定0=加入POD Assay buffer工作液后立即测定的测定管吸光度值
t=反应时间
注意事项：
1、待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。
2、POD酶液提取时，注意低温操作，防止酶活性，亦可-20℃保存。
3、以煮沸的酶液为对照时，酶要充分失活。
4、POD氧化剂和POD终止液具有一定腐蚀性，请小心操作。
5、POD氧化剂易挥发，请密闭保存，否则检测效率下降。
6、如果没有分光光度计，也可以使用普通的酶标仪测定。
每次检测指标不宜过多，否则
操作时间不一，有可能导致样本间的差异。
7、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：6个月有效。
相关：
编号名称
CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)
CM0004 LB培养基
DC0032 Masson三色染色液
DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)
NR0001 DEPC处理水(0.1%)
PS0013 RIPA裂解液(强)
TC1167 尿素(Urea)检测试剂盒(脲酶波氏比色法)。