第9章 核酸分子杂交技术与应用
[说明]核酸分子杂交及PCR技术
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核酸的分子杂交技术一、核酸分子杂交用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
二、核酸分子杂交的分类液相杂交核算分子杂交印记杂交固相杂交原位杂交1.固相杂交：将需要杂交的一条核酸链先固定在固体支持物上，另一条核酸链游离在液体中。
2.液相杂交：参与反应的两条核酸链都游离在液体中。
常用固相杂交类型：Southern印迹杂交、Northern印迹杂、菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、组织原位杂交、夹心杂交等。
三、核酸分子杂交的基本原理1、变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性。
﹡引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
﹡加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
﹡变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
增色效应：DNA变性后对260nm紫外光收增加的现象。
DNA热变性现象双螺旋结构即发生解体，两条链分开形成无规则线团。
同时，一系列物化性质发生改变：260nm处紫外吸收值升高，粘度降低，浮力密度升高。
由于二级结构的丧失，也失去了部分或全部生物活性。
增色效应和减色效应当DNA分子加热变性后，其260nm的紫外吸收会急剧增加的现象称为增色效应。
变性DNA复性后，在260nm处的吸收值减少的现象称为减色效应。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
【管理资料】核酸分子杂交与应用描述汇编
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核酸酶S1保护分析法可用于基因转录 起始位点分析及内含子剪切位点分析。
液相杂交的优点： 设备简单、操作方便。 液相杂交的缺点： 过量未杂交探针难以除去，产生高背 景；同源与异源核酸均可形成双螺旋 结构使得杂交结果难以分析。
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固相杂交：将欲分析的样品先结合在 固相支持物上，再与探针进行杂交反 应。杂交结果可用仪器或放射自显影 技术分析杂交结果。 固相支持物的选择：可用于固相支持 物的种类很多。一种良好的固相支持 物应具备以下几个特性：1、具有较强
C 。 o 2020/7/1
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复性：变性核酸分子在合适的条件下 重新形成双螺旋结构的过程称复性。 热变性的DNA溶液在低于Tm值25 oC 的温度下维持相当长的一段时间，则 可使之恢复到天然的双链结构状态。 复性的速度受以下因素影响： 1、DNA浓度 DNA浓度越大复性速 度越快；
2、DNA的分子质量 大分子质量的
核酸分子杂交与应用描述
2020/7/1
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核酸分子杂交的基本原理与分类
核酸分子杂交的基本原理：DNA分子 由两条互补的单链形成的双螺旋结构。
维持结构稳定的力有三：1、两条链
间互补碱基的氢键；2、碱基间的堆 积力(范德华力)；3、中和链内的负
电荷。
变性：在理化因素作用下，双螺旋结
构间的氢键断裂，两条链解开形成单
链的过程。
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变性温度(Tm)：核酸分子热变性时， 从开始变性到变性结束，是在一个很 窄的温度范围内进行的，当变性进行 到核酸分子解链一半时的温度，称变 性温度，也称融解温度。
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核酸分子杂交与应用
(2)加入所需的限制酶，并在适当条件下温育
(3)加入适量T4DNA聚合酶。
(4)当切除了所需数量的核苷酸后，加入 1μl2mmol/L四种核苷酸(其中一种为标记核苷酸)，37oC保温一小时。
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标记步骤
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加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)，20mmol/L溶液各1μl。
以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作 加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。
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随机引物标记法特点
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STEP3
STEP2
STEP1
除能进行双链DNA标记外，也可用于单链DNA或RNA探针的标记。当用RNA为模板是，操作方法同上，但必须采用反转录酶。
标记活性高，只需25ng样品DNA，可在3小时内使40％～60％以上甚至90％的标记dNTP掺入到探针DNA链上
操作方便
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3’末端标记
探针的标记
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随机引物法 标记原理：随机引物是含有各种可能排列的寡聚核苷酸片段的混合物，可以与任何核酸序列杂交，起到聚合酶促反应的引物作用。将待标记的探针模板与随机引物一起退火，合成标记探针。
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标记步骤
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标记步骤
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取200ng双链DNA溶于1μl蒸馏水中，在蜡膜上与1μl随机引物充分混匀，吸入一毛细玻璃管中，用火封严两端。置沸水浴中30分钟并迅速置冰水浴中1分钟。将DNA转入上述离心管中
STEP4
STEP3
STEP2
STEP1
影响变性的因素：
影响变性的因素：
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核酸分子杂交与应用
• cDNA探针：以mRNA为模板经过逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。
2020年10月29日星期
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四
探针的种类
• DNA探针优点： • 1、一般克隆在质粒载体中，可以无限繁殖； • 2、DNA探针不易降解 • 3、DNA的标记方法比较成熟。
牛血清白蛋白
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标记步骤
• 3、加入除标记核苷酸外的其他三种脱氧核糖核苷酸溶液(也可以是多种标记核苷酸)， 20mmol/L溶液各1μl。 以下操作要在同位素工作室中有防护措施的情况下进行操作
• 4、加入100μCi(10μl)标记的核苷酸溶液。注：应贮存在－20oC冰箱中，使用前在室 温下放置15～30分钟融化。要尽量减少冻融次数。
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法
T4DNA聚合酶标记法
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四
大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2mmol/L3种dNTP(无dATP)
[α-32P]dATP
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四
标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl，混匀 • 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀 注：以上操作均在冰浴中进行 • 8、置14～16oC水浴中保温1～2小时 • 9、加入2μl 0.5mol/L EDTA终止反应 • 10、纯化标记的DNA探针
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
核酸的分子杂交技术及其应用
核酸的分子杂交技术及其应用1概述核酸的分子杂交(molecular hybridization)技术是目前生物化学和分子生物学研究中应用最广泛的技术之一，是定性或定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
它是利用核酸分子的碱基互补原则而发展起来的。
在碱性环境中加热或加入变性剂等条件下，双链DNA之间的氢键被破坏(变性)，双链解开成两条单链。
这时加入异源的DNA或RNA(单链)并在一定离子强度和温度下保温(复性)，若异源DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列，则在复性时可形成杂交的核酸分子。
在进行分子杂交技术时，要用一种预先分离纯化的已知RNA或DNA序列片段去检测未知的核酸样品。
作为检测工具用的已知RNA 或DNA序列片段称为杂交探针(probe)。
它常常用放射性同位素来标记。
虽然核酸分子杂交技术的应用仅有二十多年的历史，但它在核酸的结构和功能的研究中作出了重要贡献，在基因的表达调控和物种的亲缘关系研究中也发挥重要作用。
而且，随着核酸探针制备及标记技术的丰富和完善以及以不同材料为支持物的固相杂交技术的发展，使核酸分子杂交技术在分子生物学领域中的应用更加广泛。
这里我们将就分子杂交技术的几个主要过程及其应用进行介绍。
2核酸探针的制备核酸分子杂交的灵敏性主要依赖杂交探针的放射性比活度。
比活度高就可提高反应的灵敏性，减少待测样品的用量。
目前一般所用的是体外标记，这里介绍几种最常用的方法：2.1DNA的切口平移双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ可把核苷酸残基加到切口处的3’端，同时由于此酶具有5’→3’外切核酸酶活性，它还可从5’端除去核苷酸。
这样5’端核苷酸的去除与3’端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动，称切口平移(nicktranslation)。
常用于在双链DNA上打开切口的酶为胰DNA酶Ⅰ。
由于高放射性比活度的核苷酸置换了原有核苷酸，就有可能制备比活度大于108计数/(分.μg)的32P标记的DNA探针。
医学分子生物学第九章印迹杂交技术
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
核酸分子杂交的种类及应用
核酸分子杂交摘要:核酸分子杂交技术就是基因工程中重要的研究手段,就是目前生物化学、分子生物学、与细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。
也就是现阶段定性、定量与定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。
本文主要介绍了核酸分子的原理,分类以及它的相关应用。
关键词:核酸分子;分类;应用;1、核酸杂交技术的原理核酸分子(DNA、RNA)就是由许多单核苷酸分子通过3,5磷酸二酯键相互连接所形成的生物大分子。
DNA分子双链的形成,DNA的复制,以及RNA的转录等都遵循碱基互补配对原则。
DNA就是由两条互补配对的单核苷酸链通过氢键连接的双链分子。
双链结构的核酸分子在加热、偏碱环境或受尿素、甲酰胺等氢键解离剂的作用,则形成单链分子,称为核酸“变性”。
两条单链核甘酸若有同源顺序,则在一定条件下,她们的碱基互补配对,从而形成双链分子,称为核酸“复性”或核酸“杂交”[1]。
核酸分子杂交就是用核酸分子的变性,复性等理化性质而设计的一种常用技术。
通常利用一种顺序已知,并被放射性同位素标记的核酸片段瞧作为探针,与未知样品的核酸进行分子杂交,如果样品中的核酸与探针有碱基互补顺序就能形成杂交分子。
此时标有同位素或生物素的探针则固定在标本上,用放射性自显影法或免疫组化法可显示出探针[2]。
核酸分子杂交可分为液相杂交、固相杂交与原位杂交[3]。
2、固相分子杂交:将待测的靶核甘酸链预先固定在固体支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,而标记的探针则游离在溶液中,进行杂交反应后,使杂交分子留在支持物上,然后再进行检测与计算。
固相分子杂交又可分为:Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交、斑点杂交、菌落原位杂交等。
2、1 Southern印迹杂交1975年建立的一种DNA转移方法。
该法利用硝酸纤维素膜(或经特殊处理的滤纸或尼龙膜)具有吸附DNA的功能。
首先用酚提法从待检测组织中提取DNA,然后以限制性内切酶消化待测的DNA片段,接着进行琼脂糖凝胶电泳使DNA按分子量大小分离,电泳完毕后,将凝胶放入碱性溶液中使DNA变性,解离为两条单链。
分子杂交技术
分子杂交技术引言分子杂交技术是一种重要的实验手段，在生物学和生物化学领域被广泛应用。
它通过将两个不同源的核酸序列（DNA或RNA）进行杂交，从而得到具有特定性质和功能的新分子。
在本文中，我们将介绍分子杂交技术的原理、应用和未来发展方向。
原理分子杂交技术主要基于核酸的互补配对原理。
DNA和RNA 分子中的碱基有互补配对性质，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）或尿嘧啶（U）互补配对，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）互补配对。
在杂交过程中，两个互补的核酸序列会通过碱基间的氢键相互结合，形成一个稳定的双链结构。
应用分子克隆分子杂交技术在分子克隆中起到至关重要的作用。
通过将目标基因的DNA序列与载体DNA进行杂交，可以实现基因的定向克隆。
例如，使用限制性内切酶将目标基因和载体DNA切割开后，通过杂交技术将两者粘合在一起，形成重组DNA，然后可以通过转化、转染等手段将重组DNA导入到宿主细胞中，实现基因的表达。
基因探针分子杂交技术也被广泛应用于基因探针的设计和制备。
基因探针是一种用于检测目标基因在细胞或组织中表达情况的分子工具。
通过将特异性的探针与目标基因进行杂交，可以实现对目标基因的检测和定位。
分子杂交技术可以用于制备放射性或非放射性的探针，例如荧光探针或生物素标记的探针，从而实现对目标基因的高灵敏度和高特异性的检测。
基因组分析分子杂交技术还可以用于基因组分析。
例如，通过杂交技术可以将特异性的探针与目标基因组中的特定区域进行杂交，从而实现对基因组的定位和映射。
此外，分子杂交技术还可以用于研究基因组中的DNA重复序列、非编码RNA等。
DNA鉴定分子杂交技术在DNA鉴定领域也有广泛的应用。
例如，通过杂交技术可以将可疑犯罪嫌疑人的DNA样本与现场留下的DNA样本进行比对，以确定是否属于同一人。
此外，分子杂交技术还可以用于亲子鉴定、物种鉴定等。
未来发展方向随着科技的不断发展，分子杂交技术也在不断更新和发展。
未来，我们可以预见以下几个方面的发展：1.高通量分子杂交技术的发展：随着高通量测序技术的发展，分子杂交技术可以与测序技术结合，实现对大规模样本的高效分析，从而推动基因组学、转录组学等领域的研究进展。
核酸分子杂交技术简介及其应用
班级生物硕01 姓名牛浩学号 20172120470核酸分子杂交技术简介及其应用摘要：本文简要介绍了核酸分子杂交技术的基本概念及其原理，它的杂交类型，包括斑点杂交、细菌的原位杂交技术、Southern吸印杂交和Northern吸印杂交。
探讨了核酸分子杂交技术的研究应用，最后对核酸分子杂交技术做出了相应的研究展望。
关键词：核酸分子杂交技术；概念；原理；杂交类型；研究应用；展望1 基本概念及原理核酸分子杂交技术是基因工程中重要的研究手段，是目前生物化学、分子生物学和细胞生物学研究中应用最广泛的技术之一。
也是现阶段定性、定量和定位检测DNA与RNA序列片段必须掌握的基本技术与方法。
由于其特异性强，灵敏度高、定位准确等优点，目前已被广泛应用于分子生物学、生理学、遗传学、病毒学等基础学科的研究。
DNA分子是由两条单链形成的双股螺旋结构，维系这一结构的力是两条单链碱基氢键和同一单链上相邻碱基间的范德华力。
在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，DNA分子成为单链，这一过程称作变性或融解。
加热、改变DNA融解的pH值，或有机溶剂等理化因素，均可使DNA变性。
变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外光吸收增加。
在温度升高引起的DNA变性过程中，DNA的变性会在一个很狭窄的温度范围内发生，这一温度范围的重点被称作融解温度T m。
T m值得大小取决于核酸分子的G-C含量，核酸分子的G-C含量越高，其T m值越高。
因为G-C碱基之间有三个氢键，而A-T碱基之间只有两个氢键[1]。
变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补的单链又可以重新结合形成双链，这一过程称作复性。
根据这一原理，将一种核酸单链标记成为探针，再与另一种核酸单链进行碱基互补配对，可以形成异源核酸分子的双链结构，这一过程称作杂交（hybridization）。
杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补序列就可以形成杂交体。
最新核酸分子杂交与应用
15.01.2021
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T4DNA聚合酶， 无dNTP 加入dNTP,其中一种为标记核苷酸
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标记反应步骤：
端标记法：
标记反应步骤： (1)在反应管中依次加入下列试剂并混匀
DNA
1μg
10xKlenow片段缓冲液
2μl
2mmol/L3种dNTP(无dATP) 1μl
[α-32P]dATP
30μCi
加水至
25μl
10xKlenow片段缓冲液
2μl
0.5mol/L 0.1mmol/L 1mmol/L
Tris.Cl(pH7.2) DMTgTS(O二4硫苏糖醇)
15.01.2021
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探针的标记
• 切口平移法 • 标记原理：是目前实验室是最常用的一种
脱氧核糖核酸探针标记法。利用大肠杆菌 DNA聚合酶1的多种酶促活性将标记的 dNTP掺入新合成DNA链中使探针被标记。
带缺口(nick)的线状、超螺旋及环状双链 DNA均可作为切口平移法的模板。
15.01.2021
500μg
牛血清白蛋白
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大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段末 端标记法：
(2)加入1单位Klenow聚合酶片段，室 温反应30min。 (3)加入12μl0.5mol/LEDTA以终止反 应。酚/氯仿抽提1次。 (4)Sephadex G－50柱层析或乙醇沉 淀法分离标记的DNA片段。
15.01.2021
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标记步骤
• 5、加入无菌蒸馏水，至终体积为46.5μl， 混匀
• 6、加入0.5μl稀释的DNase I溶液，混匀 • 7、加入1μl(5U)DNA聚合酶I溶液，混匀
核酸分子杂交
核酸分子杂交特点：灵敏度高（<1pg互补序列）速度快（<24h）简单易行应用：基因克隆的筛选; 酶切图谱制作;基因组中特定基因序列的定量和定性检测;基因突变分析;疾病的诊断;微生物病原体检测利用两条不同来源的多核苷酸链之间的互补性而使它们形成杂交体双链叫核酸杂交。
与核酸杂交技术相对应的另一项技术被称为探针技术，它是指利用标记分子对其它分子的识别性而实现对后者进行检测的一种技术，我们把标记的分子叫探针（Probe）。
核酸分子杂交:用标记的已知DNA或RNA片段（探针）来检测样品中未知核酸序列，通过核苷酸间碱基互补的原则发生异源性结合，再经显影或显色的方法，将结合核酸序列的位置或大小显示出来。
待测的核酸序列，可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因组DNA和组织细胞的RNA。
核酸分子杂交的基本原理:1变性：在某些理化因素的作用下，核酸双链分子碱基对的氢键断裂，疏水作用被破坏，双链螺旋或发夹结构被拆开，有规则的空间结构被破坏，形成单链分子，称为核酸的变性引起核酸变性的因素：热、酸、碱、化学试剂（如：尿素、甲酰胺、甲醛等）。
加热变性是最常用的方法，一般加热80-100℃数分钟即可使核酸分子氢键断裂，双链分开。
变性的核酸分子失去了生物活性，同时理化性质也随之改变，其紫外吸收值（A260）也随之升高。
可用紫外吸收的变化来跟踪DNA的变性过程。
以A260吸收值对应温度作图，得到DNA的变性曲线或熔解曲线。
A260值达到最大值1/2时的温度称为解链温度或熔解温度（melting temperature,Tm)，此时50%的DNA分子发生了变性。
Tm与核酸的G、C含量有关。
Tm=（G+C）%×0.41+69.3 Tm也受介质中离子强度的影响，离子强度低，熔解温度也低。
2复性: 在适当条件下，变性DNA的两条互补单链重新结合，形成双链的过程称为复性。
在热变性后，当温度缓慢冷却至比Tm值低20-30℃时，变性的单链DNA即可恢复双链螺旋结构，这样的复性又称为退火。
核酸分子杂交与应用描述81页PPT
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
《核酸分子杂交》课件
核酸分子杂交的历史背景
01
1952年，S.E.Luria和 M.Delbrück在研究噬菌体的变 异性时，首次提出了分子杂交 的概念。
02
1961年，R.W.Powell和 E.M.Maxam将分子杂交技术应 用于DNA的化学分析。
03
1973年，J.K.Hershey和 M.Chase用分子杂交技术成功 地检测到了噬菌体PSU-13的基 因组DNA。
利用纳米材料如金纳米颗粒、碳纳米 管等，可以实现核酸分子的高效富集 和信号放大，提高杂交信号的强度和 特异性。
在核酸分子杂交中，纳米技术可以用 于构建高灵敏度的传感器和检测器， 实现对基因组中特定序列的快速、准 确检测。
生物信息学在核酸分子杂交中的应用
生物信息学是利用计算机科学和统计学 的方法，对生物学数据进行分析和解读
洗脱
去除未结合的核酸分子，留下 与目标序列结合的核酸分子。
检测
对杂交产物进行检测，确定目 标序列的存在。
核酸分子杂交的原理
互补性
通过碱基互补配对原则，使单链核酸分子与目标 序列结合形成双链结构。
特异性
由于碱基互补配对原则，使得核酸分子杂交具有 高度的特异性。
温度依赖性
通过调节温度，可以控制核酸分子的变性和复性 ，从而控制杂交过程。
比较转录组
利用核酸分子杂交技术，可以对不同 条件下的转录组进行比较，揭示基因 表达的差异和变化规律。
基因突变检测
突变筛查
通过核酸分子杂交技术，可以对基因进行突变筛查，为遗传性疾病的诊断和治 疗提供依据。
突变定位
利用核酸分子杂交技术，可以快速、准确地定位突变位点，为突变机制和功能 研究提供帮助。
基因组测序与比较基因组学
核酸分子杂交课件
变性时间
控制变性时间，确保DNA完全解 离为单链。
温度控制
保持变性温度稳定，避免对DNA造 成损伤。
杂交
杂交液选择
根据实验需求选择合适的 杂交液，以保证杂交反应 的进行。
杂交温度
控制杂交温度，使DNA与 探针进行结合。
杂交时间
确定杂交时间，使探针与 DNA充分结合。
洗脱与检测
洗脱条件
选择合适的洗脱条件，使未结合 的探针被洗去，留下结合的探针。
探针标记
采用高效、稳定的探针标记方法，如荧光染料、 同位素等，确保信号的准确性和可重复性。
样品处理技术的改进
样品纯化
采用高效、快速的样品纯化方法，去除杂质和干扰物质，提高杂 交反应的准确性。
样品预处理
根据杂交目标对样品进行预处理，如变性处理、修复等，以暴露出 目标序列并提高其可及性。
生物素标记
将生物素等标签引入样品中，以便于后续的信号放大和检测。
VS
详细描述
通过核酸分子杂交，可以检测出基因中的 点突变、插入、缺失等变异，用于诊断单 基因遗传病或多基因遗传病，如癌症、糖 尿病等。
生物信息学分析与应用
总结词
核酸分子杂交技术结合生物信息学分析，有 助于揭示基因组学、转录组学和蛋白质组学 的复杂关系。
详细描述
通过核酸分子杂交和生物信息学分析，可以 研究基因组学中的基因重复、转录组学中的 RNA表达模式、蛋白质组学中的蛋白质相 互作用等复杂问题。
基因组测序与注释
总结词
核酸分子杂交技术为基因组测序和注释提供了重要的手段，有助于确定基因的位置和结构。
详细描述
通过核酸分子杂交，可以识别基因组中的重复序列、转座子等复杂结构，为基因组的精细测序和注释提供有力支 持。
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（二）酶联对探针及杂交的影响： （三）杂交反应体积: （四）杂交的时间:
二、短小寡核苷酸探针杂交
（一）影响杂交稳定性的因素：
1、融解温度(Tm): 50%杂化核酸分子解链温度。 （胺盐、碱基错配比例） 2、盐浓度 （二）杂交时间: 依复杂性，一种或多种探针
（三）杂交加速剂: 一般不用 （四）洗脱条件 （五）杂交条件的优化:杂交或洗脱温度盐浓度
三、Northern杂交方法的评价及应用
四、原位杂交方法的评价及应用
本章总结
1、核酸分子杂交：
单链探针与靶DNA单链之间形成杂合体DNA(异源核酸 分子)，即为核酸杂交。
2、基本原理： 变性（融解）、复性 3、核酸分子杂交分类
●按分子: ●按标记: ●按介质:
DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交 同位素与非同位素杂交 液相杂交、固相杂交、原位杂交
原位杂交:
切片组织细 胞中基因定位.
第二节 杂交反应的影响因素
一、长探针杂交
（一）影响杂交速率及杂化分子稳定性：
◆核酸分子浓度: 浓度↗,杂交速率↗,本底和非特异杂交↗. ◆碱基组成: G+C含量↗,杂交速率↗,影响杂化分子Tm。 ◆盐溶液的浓度： 浓度↗,杂交速率↗,稳定性↗. ◆温度: 低于Tm20Co-30Co时,温度↗,杂交速率↗. ◆其他: 甲醛、碱基错配比例、加速剂等.
DNA(异源核酸分子)，即为核酸杂交。
二、核酸分子杂交分类
(一)按分子: DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交
(二)按标记: 同位素与非同位素杂交
(三)按介质: 液相杂交、固相杂交、原位杂交
(四)基因芯片技术
固相杂交
1、菌落杂交：筛选重组菌落 2、Southern杂交:（靶核酸是DNA） 3、Northern杂交:（靶核酸是RNA） 4、点杂交和狭缝杂交
第三节 探针的设计(1)
一、探针的种类：
DNA、RNA、寡核苷酸探针 （一）DNA探针：单链、双链 不易被降解 （二）RNA探针：效率高、易被降解 （三）寡核苷酸（ASO）探针：可大量合成
第三节 探针的设计(2)
二、探针标记方法的选择：
●放射性标记：32P
● 非放射性标记：生物素、地高辛、荧光
素
第九章
核酸分子杂交技术与应分类
定义:单链核酸分子在合适的温度和离子强度下,
通过碱基互补形成双链杂交体 (hybrid) 的一类技 术,称作核酸分子杂交。
一、核酸分子杂交的基本原理
变性:融解，双螺旋氢键断裂,形成单链； 复性 : 单链探针与靶 DNA 单链之间形成杂合体
4、探针的设计
●探针的种类： DNA、RNA、寡核苷酸探针 ●探针标记方法： 放射性标记、非放射性标记
5、杂交： 预杂交、杂交、洗脱。 6、Southern、Northern杂交方法的应用
作业
1、试述核酸分子杂交技术的原理及过程
2、简述探针的种类和标记方法
第六节
杂交与杂交后检测(2)
二、杂交标记物信号的检测：
(一)放射自显影 (二)非放射性标记的检测
1、直接检测：显色反应、化学发光 2、间接检测： ELISA 、多探针检测、化学发光物检测。
三、滤膜和探针的重复使用
第七节 核酸分子杂交方法评价及应用 一、斑点/狭缝杂交方法的评价及应用
二、Southern杂交方法的评价及应用
第五节 探针的标记
一、全程标记： ◎随机引物法； ◎DNA切口平移标记法； ◎全程RNA标记； ◎化学法全程核酸标记。 二、末端标记： ◎5′末端标记； ◎3′末端标记。
第六节
杂交与杂交后检测(1)
一、杂交
◆预杂交：
目的是封闭可能发生非特异性杂交 的部位----降低本底。
◆杂交：探针与靶序列孵育。 ◆洗脱： 目的是洗脱未特异性杂交的探针。
三、探针的长度：
●DNA、RNA探针：400-500bp ●寡核苷酸探针长度：F=(1/4)L×2N 。
第四节 核酸分子与固相介质的结合
一、支持介质的类型： 硝酸纤维素薄膜(NC)、尼龙膜等。 二、靶核酸分子的转移： 1、从克隆菌落转移DNA 2、从凝胶胶上转移DNA ●毛细转移: 毛细管虹吸（Southern印迹） ●真空转移： 三、核酸的固定： 烘烤、紫外光固定、碱固定。