HRM甲基化位点检测的灵敏性
DNA甲基化检测技术
谢谢！
MGMT P15
增强增殖、侵袭与转移 激素抵抗 失去对致癌物活性代谢产物的解毒作用 缺损DNA错配修复,基因点突变
p53-相关基因，与DNA 修复及耐药性有关 细胞的过度激活与增殖
乳腺癌 、甲状腺癌、胃癌 乳腺癌、前列腺癌 前列腺癌、乳腺癌、肾癌 结肠癌、胃癌、子宫内膜瘤、卵巢癌
肺癌、脑瘤 非白血性白血病、淋巴瘤、鳞状细胞癌、肺癌
DNA甲基化检测之 甲基化特异性HRM检测技术
（ Methylation-sensitive high resolution melting）
内容提示
DNA甲基化的定义及生物学意义 MS-HRM检测的原理 MS-HRM检测的方法及步骤 MS-HRM检测结果分析
DNA甲基化的定义
在甲基转移酶的催化下，DNA的CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地添 加甲基基团的化学修饰现象。
DNA甲基化与肿瘤的关系
肿瘤细胞的特征： 癌基因低甲基化 ——被激活； 抑癌基因高甲基化 ——被沉默 甲基化水平与肿瘤生物学特性密切相关，DNA甲基化
水平越低，染色体越容易发生功能异常，肿瘤的浸润能力 就越高，临床分期也愈晚
常见易被甲基化的抑癌基因与修复基因及其作用
基因
APC
BRCA1 CDKN2A/p16 DAPK1
基因沉默对肿瘤的意义
肿瘤类型
对细胞增殖、迁移、粘附、骨重组及染色质稳定性 乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌、胃癌、胰、 肝
失去调节作用
癌
与DNA 修复与转录激活有关 周期素依赖性蛋白激酶抑制剂
乳腺癌、卵巢癌 GIT 、头与颈部瘤、NHL、肺癌
钙/钙调素-依赖的丝氨酸/苏氨酸磷酸化酶; 凋亡抑制 肺癌
E-cadherin ER GSTP1 hMLH1
高分辨率熔解曲线分析(HRM)及其在植物种质资源鉴定中的应用
摘要 ： 饱和 荧光染料 、 未标记探 针 与 实时荧光 Ｐ Ｃ Ｒ结合产 生 的
关键词 ： 高分辨率 熔解 曲线分析 ； 种 质鉴定 ； Ｓ Ｓ Ｒ；Ｓ Ｎ Ｐ
中图分类号 ： Ｓ３ ３ ０ 文献标志码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０ １ — ４ ７ ０ ５ （ ２ ０ １ ３ ） １ ０ － ０ ０ ５ ７ － ０ ４
高分 辨 率 熔 解 曲线 分 析 （ Ｈｉ ｇ ｈ Ｒ ｅ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｍｅ ｌ ｔ ｉ ｎ ｇ Ｃ ｕ ｒ ｖ ｅ Ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ， Ｈ Ｒ Ｍ） 是在实时荧光定量 Ｐ Ｃ Ｒ基 础 上 发展起 来 的一 项新 技术 。 目前 ， Ｈ Ｒ Ｍ 分 析 的应 用 领域
因型 。
多态 ） 分析 、 突变扫 描 、 甲基 化 分析 、 基 因分 型 、 序列 匹
配等研究 ， 近年来 已成 为生命科 学研究 中的热点技 术 … 。在植 物种 质 资源 研 究 中 ， 高 分 辨 率熔 解 曲 线分
析 的应 用 已经 逐步 开展 ， 主要 用 于植 物遗 传 图谱 构建 、 基 因定 位 与标 记辅 助 选 择 、 突 变 检 测 及 种 质 鉴 定 等研
究 Ｊ 。本文对高分辨率熔解 曲线 分析的原理 、 特点及 其在植物种质资源鉴定 中的应用进行综述 ， 并 对该技 术在种质资源鉴定 中的应用前景进行展望。
高分辨率熔解 曲线分析 （ Ｈ Ｒ Ｍ） 技术 的成 功主要 取决 于 ２个方 面 的 因素 ： 饱 和 荧 光染 料 和 高 分 辨率 的 检测 仪器 ２ ’ 。荧 光染 料包 括 非 饱 和荧 光 染 料 和饱 和
甲基化的检测方法
甲基化的检测方法
甲基化是DNA分子上的一种化学修饰，可以影响基因的表达和细胞功能。
目前常用的甲基化检测方法主要包括以下几种：
1. 甲基化特异性PCR（MSP）：该方法利用DNA甲基化与未甲基化DNA的不同性质，设计特异性引物进行PCR扩增，从而区分甲基化和未甲基化DNA序列。
2. 甲基化特异性限制性内切酶消化（MSRE）：该方法利用某些限制性内切酶能够识别和切割甲基化的DNA序列，未甲基化的DNA序列则不会被切割。
通过PCR扩增和酶切消化后的DNA片段的比较，可以确定DNA的甲基化状态。
3. 甲基化敏感性扩增片段长度多态性（MS-AFLP）：该方法结合了甲基化敏感性消化和扩增片段长度多态性技术，通过比较不同条件下DNA的电泳图谱，可以检测DNA上的甲基化差异。
4. 甲基化敏感性DNA芯片：基于微阵列技术，利用甲基化敏感的酶或甲基结合蛋白与样品中的甲基化DNA发生特异性结合，然后利用荧光标记的方法检测结合程度，从而实现快速和高通量的甲基化检测。
5. 甲基化测序：基于高通量测序技术，通过甲基化特异性捕获、测序和数据分析，可以获得全基因组的甲基化谱图，从而全面了解基因组中的甲基化变化。
这些方法各有优缺点，选择合适的方法取决于研究目的、样本特点和实验条件等因素。
HRM技术
最新SNP检测方法！无与伦比！！SNP, 无与伦比, 检测高通量、低成本SNP、突变或甲基化检测方法——HRM技术应用HRM介绍高分辨熔解曲线分析（high-resolution melting analysis，HR）技术是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。
基于高效稳健的PCR 技术，HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、HLA配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM 技术受到普遍关注。
HRM原理HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。
随着高精度PCR仪（LightCycler® 480和Rotor-Gene 6000）和饱和染料（LC Green、Eva Green等）的出现，HRM技术的普及使用成为可能。
HRM应用1.SNP（单核苷酸多态性）的筛查。
2.基因突变扫描，包括缺失、重复、点突变。
3.新突变的筛查。
4.甲基化的筛查。
5.遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。
6.HLA基因组配型、等位基因频率分析、物种鉴定、品种鉴定、甲基化研究。
7.法医学鉴定、亲子鉴定。
8.动植物品质相关多态性位点的研究等。
植物抗逆性，突变与性状关联性研究。
HRM特点高通量：1次可同时检测10-384样本，适合大样本、多SNP、多突变位点及多位点甲基化的扫描。
高敏度：肿瘤研究中低突变率样品基因突变检测，最低检测到0.1%的突变样品基因突变，即检测到1000个正常细胞中1个突变细胞，适用于手术和其它微量组织中突变检测。
检测灵敏性远高于“PCR+测序”的25%，即100个正常细胞中至少有25个突变细胞，测序仅适用手术组织。
dna甲基化检测方法
DNA甲基化检测方法引言DNA甲基化是一种常见的基因表达调控方式，可以影响基因的转录和表达，以及细胞分化和发育等生物学过程。
因此，对DNA甲基化状态的准确检测和分析对于理解疾病发生发展机制以及预防和治疗疾病具有重要意义。
本文将介绍几种常用的DNA甲基化检测方法，并对它们的原理和应用进行详细描述。
1. 甲基化特异性PCR（MSP）甲基化特异性PCR（Methylation Specific PCR，MSP）是一种经典的DNA甲基化检测方法。
该方法通过特殊的PCR反应体系和引物设计，可以区分甲基化和非甲基化的DNA序列。
具体步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•甲基化处理：对DNA进行化学甲基化处理，使甲基化的嵌合基对应DNA序列得以保留，非甲基化的嵌合基对应DNA序列则被转化为不同的碱基。
•PCR反应：使用特异性引物对甲基化和非甲基化的DNA片段进行扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据PCR产物的大小和形态进行甲基化状态的判断。
MSP方法具有操作简便、快速、经济等优点，已广泛应用于DNA甲基化的研究和临床诊断中。
2. 甲基化敏感限制性内切酶PCR（MSRE-PCR）甲基化敏感限制性内切酶PCR（Methylation Sensitive Restriction Enzyme-PCR，MSRE-PCR）是一种基于限制性内切酶的DNA甲基化检测方法。
该方法利用甲基化敏感的限制性内切酶和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，然后通过PCR扩增来检测DNA甲基化状态。
步骤如下：•DNA提取：从待测样品中提取DNA。
•限制性内切酶切割：使用甲基化敏感和非甲基化敏感的限制性内切酶对DNA进行切割，甲基化酶切割后产生线性DNA片段，非甲基化酶切割后产生环状DNA片段。
•PCR反应：对内切酶切割后的DNA片段进行PCR扩增。
•电泳分析：将PCR产物进行凝胶电泳分析，根据不同大小的PCR产物来判断DNA的甲基化状态。
二代测序检测甲基化的方法
二代测序检测甲基化的方法二代测序是一种高通量测序技术，可以快速、准确地获得大量的DNA或RNA序列信息。
甲基化是一种常见的DNA修饰形式，对于基因表达、细胞分化、发育和疾病等方面起着重要的调控作用。
因此，准确检测甲基化状态对于深入研究基因组学和表观遗传学具有重要意义。
本文将介绍二代测序检测甲基化的方法及其应用。
常用的二代测序检测甲基化的方法主要有甲基化敏感限制性内切酶测序（MRRBS）、甲基化敏感PCR测序（MSP、Methyl-Seq）和甲基化特异性抗体免疫沉淀测序（MeDIP-Seq）等。
甲基化敏感限制性内切酶测序是一种经典的二代测序方法，其原理是利用甲基化敏感的限制性内切酶将未甲基化的DNA片段切割成短序列，再进行测序。
通过比较未甲基化和甲基化的DNA片段，可以推测出DNA的甲基化状态。
该方法具有高准确性和较低的成本，被广泛应用于甲基化研究领域。
甲基化敏感PCR测序是一种基于PCR扩增的方法，主要用于检测少量样品或特定位点的甲基化状态。
该方法通常包括甲基化特异性PCR和测序两个步骤。
首先，通过甲基化特异性PCR扩增甲基化和未甲基化的DNA片段，并在PCR过程中引入特定的标记。
然后，将扩增产物进行测序，通过分析序列数据来确定甲基化状态。
该方法具有高灵敏度和高特异性，适用于甲基化位点的快速检测。
甲基化特异性抗体免疫沉淀测序是一种利用甲基化特异性抗体与甲基化DNA结合的方法。
首先，将甲基化的DNA片段与甲基化特异性抗体进行免疫沉淀，然后通过测序来获得甲基化DNA的序列信息。
该方法可以直接检测全基因组的甲基化状态，具有高通量和高分辨率的特点。
然而，由于抗体的特异性和亲和力等因素的限制，该方法可能存在一定的假阳性和假阴性结果。
除了上述方法，还有一些新兴的二代测序方法被用于甲基化检测，如全基因组甲基化测序（WGBS）、甲基化基因组测序（MethylC-Seq）和环状化学修饰测序（EM-Seq）等。
这些方法在测序技术和生物化学方法上有所改进，能够更加准确地检测甲基化状态。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。
大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。
下面大家介绍一些常用的方法。
特异位点的甲基化检测甲基化特异性PCR(MS-PCR)这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。
在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。
在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。
若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。
这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。
不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。
另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。
亚硫酸氢盐处理+测序这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。
它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。
这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。
扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。
若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。
这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。
这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。
高分辨率熔解HRM简介
高分辨率熔解HRM简介早在上世纪六十年代，双链DNA的熔解靠吸光度监测，数微克的DNA样品以每分钟0.1-1.0℃的速度缓缓加热，待直至数小时后完成熔解。
随后出现的利用荧光检测互补双链DNA是一个更灵敏的方法，这种方法需要先进行PCR富集DNA产物，它的流行得益于1997年问世的实时定量PCR仪Light- Cycler®。
毛细管进样和小样品体积保证了良好的温控效果，使得熔解速率大大加速到每秒钟0.1-1.0℃。
高分辨率熔解分析High Resolution Melting (HRM)于2003年发明，是一项近年来备受关注的创新的技术，实现了通过研究PCR产物依赖于序列的熔解温度而对PCR产物进行鉴定。
可用于检测样品中存在的双链DNA的单核苷酸多态性（SNPs）基因变异（Mutation）、多态性（Polymorphisms）和表观遗传学（Epigenetic）差异。
HRM分析技术的神奇之处在于它是基于对核酸双链高温熔解行为的实时监测，仅仅是在普通荧光PCR之后加一步闭管的熔解步骤，操作简便，样品可随着其本身的序列、长度、GC 含量及双链互补程度不同而被区分开。
因此，甚至是单个碱基如SNPs也可轻易被鉴定出。
原则上来说，HRM分析技术的发展得益于三项技术上的进步：1. 1. 发现了新一代的对DNA无抑制作用的饱和染料（如LC Green Plus，Resolight等）；2. 2. 高度精密的荧光监控光学系统的问世；3. 3. 发明了能够对熔解状况进行细致分析的新算法。
高分辨率熔解分析最重要的应用是基因扫描，相比传统基因分型技术，HRM具有许多优势：1. 1. 省钱—相比较测序和Taqman® SNP分型技术，HRM更适合于大规模基因分型项目；2. 2. 快速—能够在更短时间内精确分型；3. 3. 简单—易上手操作，可在高分辨率的荧光PCR仪上方便实现。
由于突变导致的突变样本熔解曲线相对于参考样本的变化是可以明显识别出来的。
高分辨熔解曲线(HRM)
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM) 分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。
它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。
因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。
HRM 原理HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。
同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。
如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。
随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。
HRM 特点由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。
基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规PCR 基础上增加一个饱和染料。
所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。
甲基化检测方式
甲基化检测方式概述：甲基化是指DNA分子上甲基基团的添加，它是一种重要的表观遗传修饰方式。
甲基化修饰可以影响DNA的结构和功能，对基因的表达起到关键的调控作用。
因此，研究甲基化的检测方式对于理解基因表达调控机制、生物学过程以及疾病的发生发展具有重要意义。
本文将介绍几种常用的甲基化检测方式。
1. 甲基化特异性限制酶消化：甲基化特异性限制酶是一类能够识别DNA甲基化位点并在非甲基化位点切割的酶。
通过对DNA样品进行甲基化特异性限制酶消化，可以将甲基化和非甲基化位点区分开来。
消化后的DNA片段可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离和检测。
这种方法简单、快速，适用于大规模样品的筛查。
2. 甲基化特异性PCR：甲基化特异性PCR是一种通过PCR技术检测DNA甲基化状态的方法。
它利用特异性引物，只能在非甲基化位点附近的区域扩增目标序列，而在甲基化位点附近的区域无法扩增。
通过PCR产物的降解、凝胶电泳或者测序等方法，可以判断目标序列是否被甲基化。
这种方法对样品的纯度要求较高，但是可以检测单个CpG位点的甲基化状态。
3. 甲基化敏感的高通量测序：甲基化敏感的高通量测序是一种通过测序技术检测DNA甲基化状态的方法。
它利用特殊的酶或化学处理方法，可以将甲基化和非甲基化的DNA片段区分开来，然后通过高通量测序技术对甲基化位点进行测序。
这种方法可以同时检测全基因组的甲基化状态，具有高通量、高分辨率的特点，对于大规模甲基化调控的研究非常有价值。
4. 甲基化芯片：甲基化芯片是一种基于DNA杂交原理检测DNA甲基化状态的方法。
它利用DNA芯片上固定的甲基化和非甲基化的DNA探针与待测样品中的DNA进行杂交反应，然后通过检测芯片上的荧光信号来判断甲基化位点的状态。
甲基化芯片具有高通量、高灵敏度的特点，可以同时检测大量的甲基化位点。
总结：甲基化检测是研究DNA表观遗传修饰的重要手段。
通过甲基化特异性限制酶消化、甲基化特异性PCR、甲基化敏感的高通量测序和甲基化芯片等方式，可以检测DNA的甲基化状态。
HRM的应用
高分辨率熔解曲线（HRM ）的应用1.引言高分辨率熔解曲线分析技术（High Resolution Melting ，HRM ），是由美国犹他大学病理学部Carl Wittwer 实验室与美国Idaho 公司于2003年共同合作开发出来的一项新技术，并于2006成功生产出世界上第一台商品化的HRM 仪器HR-1[1,2] ，美国Idaho 公司独家拥有该HRM 专利，专利号： 2005-02333335 (Nucleic and Melting Analysis with Saturation Dyes) 和 2006-0019253, (Amplicon Melting Analysis with Saturation dyes)。
HRM 技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性、特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。
2.HRM 的原理及操作流程2.1 HRM 的原理HRM 技术的基本原理主要是基于核酸分子物理性质的不同开发出来的。
不同核酸分子GC 含量，GC 分布等是不同的，因此双链 DNA 分子在加热变性时会有自己熔解曲线的形状和位置。
HRM 技术的原理就是根据核酸分子熔解温度和熔解形状的不同来区分样品。
在PCR 反应时引入饱和的荧光染料LC Green ，荧光染料在PCR 扩增的过程中被嵌入到DNA 双链中。
当嵌有染料的DNA 分子解链的时候，仪器对荧光信号进行采集，绘制出DNA 分子的熔解曲线。
DNA 分子的熔解曲线与DNA 分子的GC 含量，GC 分布，片段长度等性质有关，不同的样品由于碱基作用力的不同呈现出不同的熔解曲线形状及熔解温度(Tm 值)[3]。
图1 LightScanner 突变检测原理Tube 1Tube 2Tube 3Wild type Homozygote Heterozygote以二倍体细胞为例，当纯合子样品通过PCR扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图1（Tube1和Tube2）。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略DNA甲基化是指DNA分子中的碱基Cytosine（胞嘧啶）在其C5位点上与甲基基团结合形成5-甲基胞嘧啶的化学反应。
DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，被认为在基因组的稳定性和调控中起着关键的作用。
DNA甲基化异常与多种疾病的发生和发展密切相关，包括癌症、心血管疾病、神经系统疾病等。
因此，开发DNA甲基化检测技术，对于深入研究疾病的发生机制、早期诊断、疾病分型和治疗方案的制定具有重要意义。
一、DNA甲基化检测方法1.甲基特异性PCR(MSP)甲基特异性PCR是一种将DNA甲基化水平转化为PCR信号的方法。
该方法针对DNA甲基化位点进行甲基化特异性的酶切反应，然后利用PCR扩增技术对甲基化和非甲基化的DNA片段进行分离和测定。
2.甲基化特异性限制酶切(MSRE)甲基化特异性限制酶切方法依赖于特定甲基化位点上的酶切敏感性。
该方法先通过限制酶切鉴定DNA甲基化位点的状态，然后通过聚合酶链反应(PCR)或更高通量的测序技术进行测定。
3.甲基化特异性测序甲基特异性测序技术是一种通过测序方法直接确定DNA甲基化位点的状态。
这种方法依赖于高通量测序技术，可以同时测定数百万个甲基化位点。
4.甲基化敏感扩增多态性(MS-AFLP)甲基化敏感扩增多态性方法是一种将甲基化位点转化为特定扩增片段的方法。
该方法利用比较性PCR和限制酶切结合的方法，挑选与DNA甲基化状态相关的扩增产物，从而实现对DNA甲基化状态的测定。
二、DNA甲基化检测技术的应用1.疾病早期诊断2.疾病分型不同疾病的DNA甲基化模式存在差异，通过检测DNA甲基化状态可以将疾病进行分型，从而有针对性地制定治疗方案。
3.肿瘤治疗效果评估针对肿瘤治疗过程中的DNA甲基化变化，可以通过检测DNA甲基化状态来评估治疗效果。
如果治疗有效，DNA甲基化状态会发生改变。
4.基因组稳定性分析三、DNA甲基化检测技术的优势和挑战优势：1.高灵敏度和特异性：DNA甲基化检测技术具有高灵敏度和特异性，可以测量DNA甲基化的水平和位点。
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南
高分辨率熔解曲线（HRM）分析指南HRM(High Resolution Melting analysis，高分辨熔解曲线)同许多荧光PCR技术一样，是利用特定dsDNA染料可以插入DNA双链小沟中（PCR产物）的特性，通过实时监测升温过程中dsDNA解链，荧光染料脱落，荧光信号减弱或消失的过程，高分辨记录熔解曲线，从而对样品进行检测。
HRM技术利用dsDNA的物理性质，准确反映DNA序列碱基配对特异性与解链温度变化的情况，无需使用特异性标记探针，不受突变种类和突变位点的限制，具有高灵敏度和特异性、高通量、操作简单灵活、成本低等优点。
实验室检测证明，在PCR反应前或反应后加入饱和dsDNA染料，对HRM分析，效果相同。
在PCR后加入，可闭管进行HRM分析，无需凝胶电泳。
HRM分析，不损伤PCR产物，用于HRM分析的PCR产物仍可用于电泳、胶回收、测序等一系列后续操作。
HRM可应用于核酸突变扫描、基因分型、甲基化检测、短串联重复序列分析、序列匹配和RNA编辑等多方面研究，已越来越受到国内外核酸分子实验室的欢迎和重视。
对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。
在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。
HRM技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR反应体系中加入双链DNA饱和荧光染料，在PCR反应之后再花15 分钟，就可以完成96或384个样品的DNA变异扫描。
采用这种方法，当片段的大小在400bp或者更小时，灵敏性最高。
一、HRM分析条件1. 设备PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序列，序列中如有一个碱基发生突变，都会改变dsDNA的解链温度。
但是这种变化差异极小，只有零点几摄氏度，HRM技术需要区分Tm值差异极小的样品，以鉴别单个碱基的差异，因此，对温度分辨率的要求相当高，如果仪器的分辨率不高，是无法检测的。
甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析筛查大肠癌的性能评价
甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析筛查大肠癌的性能评价肖著军;萧著玲;陈金敏;邓飞鸿;许岸高【摘要】目的：评价通过甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS‐HRM）检测粪便中人DNA甲基化筛查大肠癌（CRC）的性能。
方法收集合格的新鲜粪便标本82例，其中CRC患者27例（CRC组）、进展期腺瘤（AA）患者25例（AA组）和结肠镜阴性的正常人30例（对照组），在LightCycler480设备上应用MS‐HRM技术检测上述粪便中vimentin基因的甲基化状态，并与粪便潜血试验（FOBT）的诊断性能相比较。
结果MS‐HRM在CRC组、AA组和对照组中检测vimentin基因甲基化的阳性率分别为81．5％（22／27），80．0％（20／25）和6．7％（2／30）。
FOBT在CRC组、AA组和对照组中的阳性率分别为37．0％（10／27），12．0％（3／25）和3．3％（1／30）。
在病例组中，MS‐HRM和FOBT的诊断敏感性分别为80．8％（42／52）和25．0％（13／52），前者显著高于后者（P＜0．05）；在对照组中两者的诊断特异性分别为93．3％（28／30）和96．7％（29／30），两者差异无统计学意义（P＞0．05）。
结论在CRC筛查中，MS‐HRM技术检测粪便中vimentin基因甲基化状态的诊断性能明显优于FOBT，具有潜在的应用价值。
%Objective To assess the performance of the methylation‐sensitive high‐resolution melting curve analysis (MS‐HRM analysis) on the detection of the methylation in stool DNA for colorectal cancer screening .Methods Eighty‐two qualif ied stool samples were collected from 27 patients with colorectal cancer patients (CRC group) ,25 patients with advanced adenomas (AAgroup) ,and 30 healthy people (control group) .The methylation status of vimentin gene in all of the stool samples was det ected by the MS‐HRManalysis on the LightCycler 480 platform .The fecal occult blood test (FOBT) was also used for the same samples . Results The positive rates of the MS‐HRM assay in the CRC group ,AA group ,and control group were 81 .5% (22/27) ,80 .0%(20/25) ,and 6 .7% (2/30) respectively .The positive rates of FOBT in the three groups were 37 .0% (10/27) ,12 .0% (3/25) and 3 .3% (1/30) respectively .The diagnostic sensitivity of the MS‐HRM assay for colorectal cancer and advanced adenomas (80 .8% , 42/52) was significantly higher than that of FOBT (25 .0% ,13/52)(P<0 .05) .No significant difference was found in the diagnos‐tic specificity between the MS‐HRM assay (93 .3% ,28/30) and the FOBT (96 .7% ,29/30)(P>0 .05) .Conclusion MS‐HRM performs better th an FOBT and has great application potential in the detection of stool DNA methylation for colorectal cancer screening .【期刊名称】《重庆医学》【年(卷),期】2015(000)002【总页数】4页(P186-188,191)【关键词】甲基化;肿瘤;波形蛋白;DNA;进展期腺瘤;甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析【作者】肖著军;萧著玲;陈金敏;邓飞鸿;许岸高【作者单位】惠州市中山大学惠亚医院消化内科，广东惠州516081; 广东省惠州市医学研究所 516003;湖南省永州市蓝山县中心医院消化科 425800;南方医科大学南方医院消化内科，广州510515;南方医科大学南方医院消化内科，广州510515;广东省惠州市医学研究所 516003【正文语种】中文【中图分类】R574.6目前，全球大肠癌(colorectal cancer，CRC)的发病率和病死率居第3位，而且有逐年上升的趋势。
高分辨溶解(HRM)分析
一、原理
PCR扩增产物的熔解曲线完全取决于DNA碱基序 列。序列中如有一个碱基发生了突变，都会改变DNA 链的解链温度。但是这个差异极小，只有零点几摄氏 度，如果仪器的分辨率不高，是根本无法检测的。 HRM分析采用高精密仪器，在拥有饱和染料和高 分辨率仪器之后，对 PCR的扩增子进行加热，温度从 50°C逐渐上升到95°C。在此过程中，扩增子逐渐 解链，在到达熔解温度（Tm）时，DNA链分开，荧 光强度迅速降低。在HRM分析的初期，荧光强度很高， 随着温度升高，双链DNA逐渐减少，荧光强度也就下 降了。HRM仪器通过照相机，记录下荧光变化的整个 过程。通过对数据的作图，就生成了熔解曲线。
HRM 的应用领域
1 、基因的突变扫描：检测杂合子 SNP 、区段 / 碱基缺 基因的突变扫描： 前后重复、杂合子缺失。 失、前后重复、杂合子缺失。 相关研究方向： 1 ） 样本中特定突变位点（ SNP ）的筛查，包括一 个片段中多个位点的复合杂合突变的Genotyping。 2 ） 疾病相关基因（癌基因）特定区段突变位点的 扫描，新突变的发现。 3 ） 遗传育种中特定突变的筛查、未知突变的发现。 4 ） 植物抗逆性，突变与性状关联性的研究。 5 ） 动植物品质相关多态性位点的研究等。
6 ．法医学鉴定、亲子鉴定。 法医学鉴定、亲子鉴定。 检测单核苷酸多态性 SNP 鉴定，插入 / 缺 失多态性 DIP 鉴定等 将 HRM 用于法医学 SNP 、 DIP 鉴定，协 助犯罪鉴定，亲子鉴定。相对于传统鉴定方法， HRM 是一种简单、便宜、高通量的二等位基 因分子标记鉴定的方法
高分辨溶解（ 第二课 高分辨溶解（HRM）分析 ）
hnxide@
高分辨率熔解（High-resolution melting，简 称HRM）分析是一门新兴的技术。它仅仅通 过PCR之后的熔解曲线分析，就能检测PCR 片段的微小序列差异，从而应用在突变扫描、 序列配对和基因分型等多个方面
甲基化检测方法范文
甲基化检测方法范文甲基化是一种常见的DNA修饰方式，涉及到将甲基基团添加到DNA分子的CpG岛位点上。
甲基化的改变与许多疾病的发展和进展有关，因此甲基化的检测对于疾病的诊断和治疗具有重要意义。
本文将介绍几种常用的甲基化检测方法。
1.甲基特异性PCR（MSP）：甲基特异性PCR是一种常用的甲基化检测方法。
该方法使用两对引物，其中一对用于特异性扩增未甲基化的DNA 序列，另一对用于特异性扩增甲基化的DNA序列。
扩增产物可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。
甲基特异性PCR具有灵敏度高、特异性好等优点，但是需要设计引物，并且不能定量测量甲基化程度。
2.甲基化特异的限制性内切酶（MSRE）：MSRE是一种能识别并切割未甲基化的CpG岛位点的限制性内切酶。
该方法通过比较未经MSRE酶切和经MSRE酶切的DNA片段的数量来确定甲基化的程度。
MSRE具有高度的特异性和灵敏度，但是仅适用于富含CpG岛位点的DNA区域。
3.双链甲基化特异的限制性酶切（MSP-RE）：MSP-RE是一种结合甲基特异性PCR和限制性内切酶切的方法。
首先使用甲基特异性PCR扩增甲基化和未甲基化的DNA序列，然后使用限制性内切酶切割扩增产物。
通过比较未经酶切和经酶切的DNA片段的数量，可以确定甲基化的程度。
MSP-RE结合了两种方法的优点，具有高度的特异性和灵敏度，但也存在一定的局限性。
4.甲基化敏感的高分辨率热解性对抗静电泳（MS-HRCE）：MS-HRCE 是一种利用高分辨率热解性对抗静电泳技术检测DNA甲基化的方法。
该方法利用高分辨率分析技术对DNA进行分离和定量，可以检测DNA中不同位置的甲基化状态。
MS-HRCE具有高分辨率、高灵敏度和高通量等优点，可广泛应用于甲基化检测研究中。
综上所述，甲基化检测方法多种多样，选择合适的方法主要取决于实验需求和研究目的。
不同的方法具有各自的优缺点，可以根据具体需求选取。
未来，随着技术的不断发展，相信甲基化检测方法将更加准确、快速和方便，为疾病的诊断和治疗提供更有力的支持。
核酸质谱甲基化优点
核酸质谱甲基化优点
核酸质谱甲基化是一种通过质谱技术检测DNA或RNA中甲基化修饰的方法。
这项技术在生物学和医学研究中有一些优点，其中一些主要的优势包括：
1.高灵敏度：核酸质谱甲基化技术对甲基化修饰的高灵敏度使其成为检测低甲基化水平的有效工具。
这对于研究与疾病相关的低频甲基化变化非常重要，如癌症研究中的肿瘤抑制基因的甲基化。
2.定量能力：核酸质谱甲基化技术具有良好的定量能力，可以提供甲基化水平的准确度和可重复性。
这对于研究甲基化水平与表观遗传学、基因调控和疾病之间的关系至关重要。
3.全基因组覆盖：与传统的基因特异性甲基化检测方法相比，核酸质谱甲基化技术可以提供全基因组水平的甲基化信息。
这有助于全面了解基因组中的甲基化模式，识别与疾病相关的全基因组甲基化变化。
4.不依赖PCR扩增：与一些基于PCR扩增的甲基化检测方法不同，核酸质谱甲基化技术不依赖PCR扩增步骤，因此可以减少潜在的PCR引入偏差，提高数据的可靠性。
5.多样性检测：核酸质谱甲基化技术可以同时检测DNA或RNA中的多个位点的甲基化状态，使其成为研究多样性甲基化模式的有力工具。
6.适用于各种样本类型：核酸质谱甲基化技术可以应用于各种样本类型，包括组织、血液、细胞等，因此具有广泛的适用性。
总体而言，核酸质谱甲基化技术在研究基因组甲基化变化与疾病、发育和其他生物学过程之间的关系方面具有重要的优势。
然而，研究人员在选择方法时应根据研究问题和样本类型谨慎选择最合适的技术。
组蛋白甲基化检测方法
组蛋白甲基化检测方法
组蛋白甲基化是表观遗传修饰的一种形式，对细胞基因组在转录和染色质结构调控中起重要作用。
目前常用的组蛋白甲基化检测方法主要包括以下几种：
1. 免疫组化（IHC）：使用抗甲基化组蛋白抗体特异性地标记甲基化的组蛋白。
这种方法可以直接观察甲基化的组蛋白在细胞核中的分布情况。
2. 甲基化特异性荧光染色：使用甲基化特异性染料（如荧光标记的抗甲基化DNA抗体或者MethylTracker染料）与甲基化的组蛋白结合，并通过荧光显微镜观察甲基化的组蛋白在细胞核中的分布情况。
3. 碱性凝胶电泳（DIP）：通过将DNA与甲基甲基转移酶结合，然后将其与不带甲基的DNA进行比较，从而检测甲基化的组蛋白。
4. 甲基化敏感的限制性内切酶（MSRE）消化和甲基化特异性PCR：使用甲基化敏感的限制性内切酶切割基因组DNA中的未甲基化位点，然后进行甲基化特异性PCR扩增，通过比较PCR扩增产物的数量来判断甲基化位点的丰度。
5. 碳同位素示踪方法：通过给细胞提供13C标记的网状甲基供体（如SAM），通过质谱分析观察13C标记的甲基化组蛋白在细胞中的分布情况。
这些方法各有优缺点，选择适当的方法取决于研究的目的和样本的特点。
hrm甲基化位点检测的敏捷性[常识]
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hrm甲基化位点检测的敏捷性[常识] HRM甲基化位点检测的灵敏性点击次数:142 发布日期:2010-10-12 来源:本站仅供参考，谢绝转载，否则责任自负利用LightScanner上的高分辨熔解曲线进行DNA甲基化位点检测的灵敏性引言DNA甲基化是一种重要的表观遗传CpG二核苷酸修饰形式，异常的DNA甲基化模式发生在许多基因启动子的CpG岛，这会增加患癌症的风险。
CpG岛高甲基化常导致基因沉默，与癌症、老化、基因印记、X-染色体失活密切相关，此外，全基因组CpG高甲基化中也证实了发生在肿瘤形成的早期。
传统的检测甲基化位点的方法是通过重亚硫酸盐处理，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后进行直接测序。
甲基化的胞嘧啶没有发生改变，因此通过测序很容易识别。
本研究中我们系统的评价了通过LightScanner的高分辨溶解曲线检测甲基化的可靠性。
如果这种方法在检测甲基化中是可靠且灵敏度高，就可以减少测序的繁琐过程。
未处理的和经过SssI处理的pBluescript II SK(+)质粒用Qiagen EpiTect试剂盒进行重亚硫酸盐。
通过对有代表性的区域进行测序，确保样品完全甲基化以及亚硫酸盐处理。
引物设计在扩增片段大小在79-216bp的含有1-8个CpG位点的7个不同的片段。
100%甲基化的和未甲基化的样品按50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%的比例混合，100%甲基化的和未甲基化的样品可以明显的区分开。
当两个样品按以上比例混合后，熔解曲线表现出重复的剂量放映关系，当50%混合时与未甲基化的标准品偏性最大。
高分辨溶解曲线的灵敏度足够检测甲基化位点，对小片段的灵敏度可达到2%,大片段的可以10%。
重要的DNA甲基化位点显示在B淋巴细胞增生性疾病，如慢性淋巴细胞白血病(CLL)中。
瘤抑制基因的外部沉默可以通过DNA甲基化抑制剂处理而发生转变。
DNA甲基化检测技术应用及技术比较
DNA 甲基化检测技术应用与技术比较DNA 甲基化作为表观遗传学研究的重要范围，已经越来越碰到研究者的关注。
近些年来，随着 DNA 甲基化与组蛋白甲基化的结合作用体系、 RNA 搅乱体系及去甲基化体系的发现，使得 DNA 甲基化研究碰到广泛关注，从医学领域扩展到动植物研究中间，同时在研究方法上也获取了很大的打破。
现在用于 DNA 甲基化检测的方法大概有十多种，从应用上来分，大概能够分成两类：全基因组甲基化解析及特异位点甲基化检测。
下面，我们就这两大类检测技术进行解析比较，以便于在实质的科研工作中进行选择。
一、全基因组甲基化检测技术1.基于芯片平台的全基因组甲基化优选芯片平台作为目前比较成熟的优选工具，已经在很多领域有了相应的应用。
多家芯片公司在DNA 甲基化这块儿有了相应的产品供应，其中应用最为广泛的就Agilent 平台和 Illumina 平台，相应的产品包括AgilentHuman CpG Island MicroarrayKit ， Infinium HumanMethylation27 BeadChip和Infinium HumanMethylation450KBeadChip 。
其他 Roche NimbleGen 和 Affymetrix 也有相应的芯片推出，但是 NimbleGen 的芯片今年下半年已经停产。
不一样的芯片平台，各自的实验过程也是不同样的。
安捷伦前期采用的甲基化 DNA 免疫共积淀〔 MeDIP 〕技术。
将基因组DNA 分成两份，一份用来做MeDIP ，另一份作为比较。
两个样品都标记荧光(富集的样品用 Cy5 标记，比较用 Cy3 标记 )，尔后与芯片杂交。
芯片上每个探针的 Cy5/Cy3 强度比例显示出该地域的甲基化程度。
探针设计平台，能够安捷伦公司芯片平台因其富强的eArray 进行芯片的定制。
在甲基化领域同样合用。
Agilent 平台因为MeDIP 技术自己的特点，都不能够到达单碱基的分辨率，而Illumina 的 Infinium 和 GoldenGate检测技术却做获取。
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HRM甲基化位点检测的灵敏性
点击次数：142 发布日期：2010-10-12 来源：本站仅供参考，谢绝转载，否则责任自负
利用LightScanner上的高分辨熔解曲线进行DNA甲基化位点检测的灵敏性
引言
DNA甲基化是一种重要的表观遗传CpG二核苷酸修饰形式，异常的DNA甲基化模式发生在许多基因启动子的CpG岛，这会增加患癌症的风险。
CpG岛高甲基化常导致基因沉默，与癌症、老化、基因印记、X-染色体失活密切相关，此外，全基因组CpG高甲基化中也证实了发生在肿瘤形成的早期。
传统的检测甲基化位点的方法是通过重亚硫酸盐处理，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后进行直接测序。
甲基化的胞嘧啶没有发生改变，因此通过测序很容易识别。
本研究中我们系统的评价了通过LightScanner的高分辨溶解曲线检测甲基化的可靠性。
如果这种方法在检测甲基化中是可靠且灵敏度高，就可以减少测序的繁琐过程。
未处理的和经过SssI处理的pBluescript II SK(+)质粒用Qiagen EpiTect试剂盒进行重亚硫酸盐。
通过对有代表性的区域进行测序，确保样品完全甲基化以及亚硫酸盐处理。
引物设计在扩增片段大小在
79-216bp的含有1-8个CpG位点的7个不同的片段。
100%甲基化的和未甲基化的样品按50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%的比例混合，100%甲基化的和未甲基化的样品可以明显的区分开。
当两个样品按以上比例混合后，熔解曲线表现出重复的剂量放映关系，当50%混合时与未甲基化的标准品偏性最大。
高分辨溶解曲线的灵敏度足够检测甲基化位点，对小片段的灵敏度可达到2%,大片段的可以10%。
重要的DNA甲基化位点显示在B淋巴细胞增生性疾病，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）中。
瘤抑制基因的外部沉默可以通过DNA甲基化抑制剂处理而发生转变。
本研究中，CLL患者的miR-195基因CpG岛上游甲基化位点用Vidaza或Cladribine处理，重亚硫酸盐处理的CpG甲基化变化的最高的进行PCR扩增，之后用LightScanner进行高分辨溶解曲线分析。
样品经亚硫酸盐处理后有不同的的胞嘧啶的转换，然后通过单独和混合后分析检测的灵敏性。
不同克隆之间只要有意个被保留的C就可以在异源或同源混合的样品中区分开。
这一结果证实了高分辨熔解曲线是检测甲基化位点的简单且灵敏度高的方法。
图1：使用Sssl甲基化酶使2.9Kb的pBluescript CpG甲基化。
甲基化的和非甲基化的样品都使用Qiagen EpiTect Kit进行重亚硫酸盐处理，之后进行PCR扩增，Lightscanner检测，最后通过测序验证。
图1A：重亚硫酸盐处理的100%甲基化的和100%非甲基化的四个片段。
图1B：79-216bp的有2-8个CpG位点的甲基化的和非甲基化的片段进行不同比例的混合。
对CpG较少的小片段的检测的灵敏度在2%，有较多CpGs的大片段的检测的灵敏度在10%。
图1C：包含一个CpG位点的110bp，甲基化和非甲基化的样品按不同比例混合。
（8个重复）
图2：甲基化抑制剂处理患者CpG岛
下图为用甲基抑制剂Vidaza或Cladribine处理前后microRNA195（269bp）的上游CpG岛甲基化位点的变化
图3：miR-195 CpG岛的269bp扩增区
两个不同的病人的CpG位点见下表
图4：miR-195 CpG岛的150bp扩增区
图5：从4个CLL患者中克隆miR-195可能调控区，使用Qiagen EpiTect Kit进行重亚硫酸盐处理，之后PCR扩增，Lightscanner检测，测序。
不同的患者采取不同的甲基化模式扩增（0-8 Cs）。
熔解曲线是含有18 CpG位点的269bp的片段（A）和含有5 CpG位点的150bp的片段（B）。
图6：等量混合不同患者的进行不同甲基化模式的克隆，并扩增了含有5CpG的150bp的片段。
使用甲基抑制剂处理前后进行甲基化和未甲基化控制的比较，熔解曲线分别为患者P3（A），P4（B），V1（C），V3（D）。
图7：甲基化的和非甲基化的DNA样品按不同的比例混合，150bp的片段含有5和CpG位点。
用不同的DNA甲基化模式来评价LightScanner 高分辨熔解曲线的能力。
用质粒控制含100%甲基化的和未甲基化的部分表现出一定的剂量关系，50%混合后与未甲基化的偏离程度最大。
分析结果证明对小片段的甲基化检测的灵敏度在2%，大片段的灵敏度在10%。
在CLL分析中，经过甲基抑制剂处理后检测患者miR-195基因CpG岛的甲基化位点。
不同克隆之间只要有意个被保留的C就可以在异源或同源混合的样品中区分开。
结论证实了使用高分辨溶解曲线是检测甲基化位点简单且灵敏的方法。