对于叶绿素荧光全方面的研究

对于叶绿素荧光全方面的研究

叶绿素荧光现象的发现

将暗适应的绿色植物突然暴露在可见光下后，植物绿色组织发出一种暗红色，强度不断变化的荧光。荧光随时间变化的曲线称为叶绿素荧光诱导动力学曲线。最直观的表现是，叶绿素溶液在透射光下呈绿色，在反射光下呈红色的现象。其本质是，叶绿素吸收光后，激发了捕光色素蛋白复合体，LHC将其能量传递到光系统2或光系统1，期间所吸收的光能有所损失，大约3%-9%的所吸收的光能被重新发射出来，其波长较长，即叶绿素荧光。

叶绿素荧光动力学研究的特点

1、叶绿素荧光动力学特性包含着光合作用过程的丰富信息

光能的吸收和转换

能量的传递与分配

反应中心的状态

过剩光能及其耗散

光合作用光抑制与光破坏

2、可以对光合器官进行“无损伤探查”

3、操作步骤简单快捷

光合作用的光抑制

光抑制是过剩光能造成光合功能下降的过程。过剩光能指植物所吸收的光能超出光化学反应所能利用的部分。过去人们把光抑制与光破坏等同起来，认为发生了光抑制就意味着光和机构遭到破坏。甚至把光抑制、光破坏、光氧化等，沦为一体。

光抑制的基本特征表现为：

光合效率下降说明叶片吸收的光能不能有效地转化为化学能。光破坏：PSII 是光破坏的主要场所，破坏也可能发生在反应中心也可能发生在与次级电子受体结合的蛋白上。发生光破坏后的结果：电子传递受阻、光合效率下降。当过剩的光能，不能及时有效地排散时，会对光合机构造成不可逆的伤害，如光氧化、光漂白等等。一切影响二氧化碳同化的外界因素，如低温、高温、水分亏缺、矿质元素亏缺等都会减少对光能的利用，导致过剩光能增加，进而加重光破坏。

植物防御破坏的措施

1、减少对光能的吸收

增加叶片的绒毛、蜡质

减少叶片与主茎夹角

2、增强代谢能力

碳同化

光呼吸

氮代谢

3、增加热耗散

依赖叶黄素循环的热耗散

状态转换

作用中心可逆失活

光合作用

是指含叶绿素的植物细胞和细菌吸收光能，将无机物转化为有机物并释放氧气的过程。

叶绿素荧光仪分析植物热胁迫

选择大小、部位一致的植物叶片，分成几组每组10片，分别置于35℃、40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃、52℃的水中，当热胁迫结束后，分别用湿滤纸包住，暗适应一小时后测量暗适应后叶片的Fv/Fm值，然后再将叶片在光照下处理一段时间后测定其光系统II的有效量子产量。如果随着温度的升高而升高说明，热胁迫处理使植物光合作用失活，量子产量的平均值随处理温度升高而下降进一步证明了光合作用的失活，所以光系统II量子产量的降低会直接反映出光合作用的失活。叶绿素荧光可以分析光系统II的光化学电荷分离的效率，所有的电子都是通过光系统II泵出的，对电子传递过程的任何影响均可以通过叶绿素的变化反映出来。

荧光产生机理

荧光是一种光致发光的冷发光现象。当光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。

另外，荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发生。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共振荧光。常见的例子是物质吸收紫外光，发出可见波段荧光，我们生活中的荧光灯就是这个原理，涂覆在灯管的荧光粉吸收灯管中汞蒸气发射的紫外光，而后由荧光粉发出可见光，实现人眼可见。

荧光物质发生荧光的过程：

处于基态最低振动能级的荧光物质分子受到紫外线照射后，吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，从而跃迁到第一电子激发态的各个振动能级。

被激发到第一电子激发态的各个振动能级的分子，通过无辐射跃迁，降落到第一电子激发态的最低振动能级。

降落到第一电子激发态的最低振动能级的分子，继续降落到基态的各个不同振动能级，同时发射出相应的光量子，即荧光。

到达基态的各个不同真振动能级的分子，在通过无辐射跃迁最后回到基态的最低振动能级。

（发生荧光的第一个必要条件是该物质的分子必须具有与所有照射的光线相同的频率。分子具有什么样的频率与他们的结构密切相关，发生荧光必须有一吸收结构。第二个必要条件是吸收了与其本身特征频率相同的能量之后的分子，必须具有高的荧光效率。许多会吸收的物质并不一定会发生荧光，就是由于它们的吸收光分子的荧光效率不高，而将所吸收的能量消耗与溶剂分子或其他溶质分子之间的相互碰撞的缘故。）

叶绿素荧光诱导

叶绿素a荧光是指叶绿素分子PSII吸收光量子受激发态，通过在发射而产生的一种主要光信号，他的强度正比于叶绿素a激发分子的浓度。在许多连续耗散光合吸收光能的过程中，荧光只是其中的一种，只要能够引起光合作用的光也

就是波长在400-700nm的可见光，都可以进行荧光诱导，专业术语叫做光化光，也被称为作用光。在光合作用领域，400-700nm的光也被称为光合有效辐射。光化光可以为人工光，如来自日光灯、卤素灯或发光二极管的光，也可以为自然光。但为了使我们的实验具有可重复性，多数荧光诱导的测量会采用仪器提供的恒定光强的人工光来诱导。只有保证测量条件一致，才能对不同材料或不同处理的样品进行直接比较。

荧光参数

在叶绿素荧光分析中最常用的基本荧光参数是初始荧光Fo、暗适应后最大荧光产量Fm、可变荧光Fv、最大光化学效率Fv/Fm、光照下最大荧光产量Fm"、给定光强下稳态荧光Fs、光照下光系统II的有效量子产量Yield、光化学猝灭系数qP、非光化学猝灭系数qP和NPQ。在这里Fo是已经暗适应的光和机构光系统II反应中心均处于开放时的荧光强度，它与所激发的强度和叶绿素浓度有关，而与光合作用的光反应无关。Fm为充分暗适应后的最大荧光，是已经暗适应的光合机构光系统II反应中心全部关闭时的荧光强度，Fv是荧光的可变部分，受耗散能量的途径因素的影响。Fv/Fm是表明光化学反应状况的一个重要参数，反应光系统II反应中心的最大光能转换效应。

叶绿素荧光分析方法的分类

叶绿素荧光分析法主要分为两类，一类是研究荧光强度随时间变化，即叶绿素荧光诱导动力学；一类是研究荧光强度在波长空间范围内的变化，即叶绿素荧光光谱分析法，叶绿素荧光可以通过不同激发装置产生，常见的激发装置有LED 激发、卤素灯激发及激光激发等。

光谱分析的一般流程

光谱定量分析技术就是依据某种影响因素对光谱变化特性进行定量测定，所以应用光谱进行定量检测的技术关键就是在两者之间建立一种定量的函数关系，依靠这种关系，就能从未知样本光谱中对样本影响做出定量分析。因此，光谱定量分析技术与常规分析技术不同，它是一种间接分析技术，需要通过建立定标模型来实现对未知样本的定量分析。