等电点电泳 原理 步骤 详细

b. 蛋白质分子在正极端
c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
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在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电场 中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质带 上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移动， 迁移到与其相同的等电点位置上停留下来，即 被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。 The proteins become focused into sharp stationary bands with each protein positioned at a point in the pH gradient corresponding to its pI .
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二、IEFE的特点
（一）优点
• High Resolution • High Sensitivity • Good Reproduction
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（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能 发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不 溶或发生变性的蛋白质。
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分辨率(resolution)较不连续PAGE更高，特别 适合于分离分子量(molecuar weight,MW)相同 而电荷(electric charge)不同的生物大分子。
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1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes） 应具备的特征：
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的
缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，不
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进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的 pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品 不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带
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（一）pH梯度的建立
用 多 种 两 性 电 解 质 (ampholytes) 混 合 物 建 立 稳 定良好的pH梯度
干扰样品的测定。
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2.载体两性电解质的合成
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺 Ampholine（LKB） 本质：一系列脂肪族(aliphatic ampholytes)多氨基
多羧酸同系物和异构体，具有很多既不相同又 十分接近相互连接的pI值。 pH范围：pH3~10
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3.pH梯度的形成
载体两性电解质(Carrier ampholytes)是一系列 不同分子的两性电解质的混合物,在通电后，它 们各自迁移到适当位置形成一个连续的pH梯度 (pH gradient)。
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在电泳介质中放入载体两性电解质(carrier ampholytes) ，当通入直流电时，两性电解质形成 一个由正极(anode)到负极(cathode)逐渐增加的pH 梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。
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蛋白质分子的电聚焦过程
+ pH=pI
-
pI1
pI2
+
pI3
pIn
a
b
c
—
a. 蛋白质分子在负极端
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㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质
(carrier ampholytes)分子 以增加pI级数的办法将分 别在阳、阴极之间到达它 们自己的位置而给出一个 pI梯度。
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电解槽中，通电后，正负两极都会发生电极反应： 正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
李莉
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wenku.baidu.com
讲课内容
1 IEFE定义 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 5 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等电 点（isoelectric point，pI)不同的蛋白质的电泳 技术。
介质中放入载体两性电解质(Carrier ampholyte)，
当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳 极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不 同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点 位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中， 电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。
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讲课内容
1 IEFE定义 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 5 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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㈠没通电时的变化 所有的载体两性电解 质(Carrier ampholytes) 分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电 的基团数目相等，净 电 荷 (net charge) 为 零。
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㈡引入电场时的变化 载 体 两 性 电 解 质 (carrier ampholytes) 分 子 将 向 阴 极 (cathode)或阳极(anode)迁移， 带有最低等电点的分子（荷 最多的负电）将最快地向阳 极迁移。当它达到净电荷是 零的位置时才停止。 其次一些低pI的载体两性电 解质分子（荷其次多的负电） 也将向阳极移动，直到它的 净电荷被减少到零才停止。
Q M = ——
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讲课内容
1 IEFE定义 2 IEFE的特点 3 IEFE的基本原理 4 IEFE的应用 5 血红蛋白的等电聚焦电泳（实验）
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三、IEFE的基本原理
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蛋白质分子在不同pH下的解离状 态
NH3+
P
P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 COO-
pH＜pI pH＝pI pH＞ pI
Isoelectric focusing (IEF), is a technique for separating different molecules by their electric charge differences.
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等电聚焦(Isoelectric focusing ,IEF)就是在电泳
在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外 在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的 是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化
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由于载体两性电解质(carrier ampholytes)是一 系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的， 设其中某一成分为A，它的pI=pH’，当环境中的 pH>pH’时，它带负电荷，朝正极移动。