cDNA双链合成
cDNA和基因组文库DNA的构建
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.
11.DNA的生物合成
The model of DNA-pol III
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DNA pol I
H B
J
小片段 大片段 （Klenow fragment）
5 ‘ →3 ’聚合功能， 3 ' →5 '外切酶活性 5 ' →3 '外切酶活性
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真核细胞中DNA聚合酶
种类： DNA-pol α、β、γ、δ、ε… DNA pol δ：合成领头链
UGA（终止密码子）：Trp AGA/AGG（Arg）：终止密码子 AUA（Ile）：Met（起始密码子）
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3’
5’ 5’ 3’
OH
P
DNA-pol
5’
3’ 5’
3’
DNA-pol 的 5´3´聚合作用
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外切酶与内切酶作用图解
内切酶 （限制性内切酶） 5´ 3´外切 5’ 3´5´外切 3’
4. 冈崎片段（Okazaki fragment）：
不连续复制的片段
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ori 5. 双向复制 以起始点为中 心，向两个方 向进行复制。
6. 复制子(replicon) 真核生物两个相 邻复制起始点之 间的DNA片段。 ori
ori
ori
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滚环复制
是某些病毒，质粒、线粒体 DNA的特殊复制形式。
性质
Ⅲ 20 100000 有 无 有 复制
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Leading strand synthesis
Lagging strand synthesis
’
form the catalytic core
cDNA建库流程
cDNA文库组标准流程一. Total RNA的提取 (2)二. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)八．pBlueScript cDNA库扩增 (18)一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4、常用试剂及其配方：▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250ml，室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。
碱基互补配对原则
1，涉及到多种碱基互补配对关系，DNA分子内部有A与T配对，C 与G配对；DNA分子的模板链与生成的RNA之间有A与U配对，T与A配对，C与G配对。
2，涉及许多数量关系（规律），在DNA双链中，根据碱基互补配对的原则，一条链上的A一定等于互补链上的T；一条链上的G一定等于互补链上的C，反之如此。
因此，可推知多条用于碱基计算的规律。
规律一：在一个双链DNA分子中，A=T、G=C。
即：A+G=T+C 或A+C=T+G。
也就是说，嘌呤碱基总数等于嘧啶碱基总数，各占全部碱基总数的50%。
规律二：在双链DNA分子中，两个互补配对的碱基之和的比值与该DNA分子中每一单链中这一比值相等。
(A1+A2+T1+T2)/(G1+G2+C1+C2)=(A1+T1)/(G1+C1)=(A2+T2)/(G2 +C2)规律三：DNA分子一条链中，两个不互补配对的碱基之和的比值等于另一互补链中这一比值的倒数，即DNA分子一条链中的比值等于其互补链中这一比值的倒数。
(A1+G1)/(T1+C1)=(T2+C2)/(A2+G2)规律四：在双链DNA分子中，互补的两个碱基和占全部碱基的比值等于其中任何一条单链占该碱基比例的比值，且等于其转录形成的mRNA中该种比例的比值。
即双链(A+T)%或(G+C)%=任意单链(A+T)%或(G+C)%=mRNA中(A+U)%或(G+C)%。
规律五：不同生物的DNA分子中，其互补配对的碱基之和的比值(A+T)/(G+C)不同，代表了每种生物DNA分子的特异性。
计算：①A等于T，G等于C，A+G=T+CA+G/T+C等1。
②一条单链的A+G/T+C的值与另一条互补单链的A+G/T+C的值互为倒数。
③一条单链的A+T/C+G的值，与另一条互补链的A+T/C+G的值相等。
④在双链DNA及其转录的RNA之间有下列关系：一条链上的（A+T）等于另一条链上的（A+T）等于RNA分子中（A+U）等于12DNA双链中的（A+T）等，学生往往记不住。
DNA的生物合成
13/16.DNA的生物合成 13.2 原核生物DNA的复制 13.2.1 参与原核DNA复制的酶和蛋白质
1.原核生物的DNA聚合酶 （1）DNA聚合酶Ⅰ:
Klenow片段，含DNA聚合 酶和3´→5´核酸外切酶活性
13/16.DNA的生物合成
13.2 原核生物DNA的复制
13.2.1 参与原核DNA复制的酶和蛋白质
• 基因组能独立进行复制的单位称为复制子，每个复制子都含有控制复制起始
的起点，可能还有终止复制的终点
• 大多数原核生物染色体DNA的复制是双向，形成复制眼，单向复制的特殊形
式，称为滚动环式
• 真核生物染色体DNA是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子。
13/16.DNA的生物合成 13.1 DNA复制的概况 13.1.2 DNA复制的起点和方向
13/16.DNA的生物合成 13.2 原核生物DNA的复制 13.2.1 参与原核DNA复制的酶和蛋白质
1.原核生物的DNA聚合酶
β-滑动夹子 将正在复制的DNA固定在夹子中心，并能随DNA复制沿着模板DNA链滑动 使DNA聚合酶不易从模板脱离，有利于DNA的连续复制
13/16.DNA的生物合成 13.2 原核生物DNA的复制 13.2.1 参与原核DNA复制的酶和蛋白质
2.参与原核生物DNA复制的其他酶和蛋白质 （5）其它蛋白因子
单链结合蛋白（SSB-single-strand binding protein） 稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。
引发前体 它由多种蛋白质dnaA、dnaB、dnaC、n、n´、n´´ 和i组成。引发前体再与引发
若双链DNA中一条链有切口，一端是3´-OH，另一端是5´-磷酸基，连接酶可 催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。
DNA
DNA一．脱氧核糖核酸定义脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，缩写为DNA）又称去氧核糖核酸，是一种分子，双链结构，由脱氧核糖核苷酸（成分为：脱氧核糖、磷酸及四种含氮碱基）组成。
可组成遗传指令，引导生物发育与生命机能运作。
主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。
其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如蛋白质与RNA所需。
带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现。
组成简单生命最少要265到350个基因。
1.中文名：脱氧核糖核酸2.外文名：deoxyribonucleic acid3.简称：DNA4.分子结构：双螺旋结构5.与基因的关系：基因是有效遗传的DNA片段6.复制方式：随机半保留复制7.作用：引导生物发育与生命机能运作二．理化性质DNA是一种长链聚合物，组成单位为四种脱氧核苷酸，即：腺嘌呤脱氧核苷酸（dAMP ）、胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dTMP ）、胞嘧啶脱氧核苷酸（dCMP ）、鸟嘌呤脱氧核苷酸（dGMP ）。
而脱氧核糖（五碳糖）与磷酸分子借由酯键相连，组成其长链骨架，排列在外侧，四种碱基排列在内侧。
每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连，这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列，可组成遗传密码，指导蛋白质的合成。
读取密码的过程称为转录，是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA（信使RNA）的核酸分子。
多数RNA 带有合成蛋白质的讯息，另有一些本身就拥有特殊功能，例如rRNA、snRNA与siRNA。
在细胞内，DNA能与蛋白质结合形成染色体，整组染色体则统称为染色体组。
对于人类而言，正常的人体细胞中含有46条染色体。
染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制，细胞分裂间期又可划分为：G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。
对于真核生物，如动物、植物及真菌而言，染色体主要存在于细胞核内；而对于原核生物，如细菌而言，则主要存在于细胞质中的拟核内。
DNA的生物合成02
第三节 参与DNA复制的酶类
• • • • • • 参与DNA复制的酶或蛋白因子主要有以下几种： 1 DNA聚合酶 催化DNA的合成。 2 引物酶 起始DNA的合成 3 连接酶 连接岗奇片段 4 DNA解链，解旋酶 5 DNA结合蛋白。
一 DNA聚合酶(Polymerase)
• （一） 作用机制 • 以DNA做模板，碱基互补配对，催化4种dNTP 之间形成磷酸二酯键，从而延长DNA链。
终止子（Terminator)）含22bp
Tus: Terminus utilization substance 复制叉到达终止区，完成复制前， 复制暂停。两个子代DNA缠绕在 一起，需要分开。
四 线性DNA末端复制
• 对于真核细胞的终止，是如何补平5‘－末端除去 • 引物RNA后留下的缺口。
3 DNA复制的双向性
• 在两个方向同时进行，形成两个复制叉 • Replication Fork .
复制子 Replicon
• Replicon 基因组中能独立进行复制的结构单 位称复制子, 或者说单个复制起始点控制的DNA。 • 复制的起始位点 控制并起始复制的特定位点。 • 终止位点 终止复制的位点 • 复制子包含起始位点和终止位点，从起始位点 至终止位点的全部DNA。
3、大肠杆菌
DnaA与起始位点OriC 结合形成起始复合物 DnaA与A-T富含区作用，解 链，形成开放复合物 SSB与单链DNA结合
Hu因子促进引发过程
DnaA指导DnaB-DnaC 复合物结合到解链 区，形成前引发复 合物。
DnaB 引导DnaG引物合成酶的结合形成引发复合物，合成RNA引物
• 1) DnaA与起始位点OriC（9bp重复序列）紧
• DNA拓扑异构酶解决了 • 解开DNA双螺旋的问题
分子生物学第五章课后思考题答案【修订版】
分子生物学第五章作业1、哪些重要的科学发现和实验推动了DNA重组技术的产生及发展？答：近半个世纪来，分子生物学主要取得了三大成就：第一，20世纪40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；第二，50年代提示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题；第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。
但事实上，DNA分子体外切割与连接技术及核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组DNA技术的产生和发展。
其中，限制性内切核酸酶和DNA连接酶等工具酶的发现和应用是现代生物工程技术史上最重要的事件。
DNA重组技术的产生及发展过程中比较重要的科学发现和实验如下：1957年A.Kornberg从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶I。
1965年S. W. Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由"质粒"DNA所决定。
1967年年世界上有五个实验室几乎同时宣布发现了DNA连接酶。
1970 年H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶。
H.M.Temin和D.Baltimore从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。
1972-1973 年H.Boyer，P.Berg等人发展了DNA重组技术，于72年获得第一个重组DNA分子，73年完成第一例细菌基因克隆。
1978 年首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰岛素。
1981 年R. D. Palmiter和R. L. Brinster获得转基因小鼠；A. C. Spradling和G. M. Rubin得到转基因果蝇。
1982 年美、英批准使用第一例基因工程药物--胰岛素；Sanger等人完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。
cDNA第二链合成
1. Superscipt II―RT合成第一链:1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入xul mRNA(大约500ng)1ul Xho I Primer(1.4ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGT CTCGAG TTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)11-x ul RNase-free water（大于500ng mRNA 分n管(500ng/tube)合成第一链, 第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成.）2. 混匀后,70℃反应10分钟;3. 反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;4. 稍微离心一下,顺序加入以下试剂:4ul 5×first strand buffer2ul 0.1M DTT1ul 10mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟;6. 反应完成,趁热加入1 ul S uperscipt II―RT,混匀;7. 42℃反应50分钟,然后70℃,15分钟灭活反转录酶.2. cDNA第二链的合成 :1. 第一链反应完成后,取2ul一链产物－20℃冰箱中保存，待电泳检测。
其余的产物合并，混匀，然后顺序加入下列试剂(promega):20ul 10×DNA Polymerase I buffer6ul 10mM dNTP(自己配制)xul dd H2 O1ul RNase H(2U/ul)10ul DNA Polymerase I(10U/ul)总体系为200ul;2. 混匀后,16℃反应2.5小时;3. 70℃灭活10分钟;4. 反应完成后,得到200ul cDNA第二链反应体系,将此体系置于冰上;5．取2ul二链产物，同保存的一链产物一起电泳鉴定。
同时上1kb ladder，确定双链的大小范围。
注：一链，二链的电泳图是smear，且二链稍比一链大一些。
3. 双链cDNA末端补平 :1. 在第二链反应体系中,顺序加入下列试剂(promega):6ul 10mM dNTP2ul T4 DNA Polymerase(8.7U/ul)2ul BSA(10mg/ml)2. 稍微离心混匀反应物, 37℃反应至少30分钟,然后75℃灭活10分钟;3. 加入等体积酚/氯仿/异戊醇,剧烈振荡后,常温下13000g离心5分钟;4. 离心后,吸取上清于另一1.5ml eppendof管中,加入等体积氯仿,上下颠倒几次混匀后,常温下13000g离心5分钟;5. 吸取上清至另一eppendof管,加入1/10V3M NaAc(PH5.2)和2.5V预冷的无水乙醇,混匀,-20℃放置过夜以沉淀双链cDNA;6. 第二日,将昨日沉淀物在4℃,13000g离心60分钟以充分沉淀双链cDNA;7.离心完毕,弃上清,加入1ml 70%乙醇洗涤沉淀,常温下13000g离心5分钟;8.离心完毕,弃上清,干燥沉淀至无乙醇气味.注：第3，第4步可以用PCR 纯化试剂盒代替。
分子生物学名词解释
分子生物学名词解释分子生物学名词解释1.cDNA（complementary DNA）：在体外以mRNA为模板，利用反转录酶和DNA聚合酶合成的一段双链DNA。
2.CpG岛：真核生物中成串出现在DNA上的CpG二核苷酸。
5-甲基胞嘧啶主要出现在CpG序列、CpXpG、CCA/TGG和GATC中，在高等生物CpG二核苷酸序列中的C通常是甲基化的，极易自发脱氨，生成胸腺嘧啶，所以CpG二核苷酸序列出现的频率远远低于按核苷酸按核苷酸组成计算出的频率。
3.C值（Cvalue）：通常是指一种生物单倍体基因组DNA的总量，以每细胞内的皮克（pg）数表示。
4.C值反常现象（C value paradox）：也称C值谬误。
指C值往往与种系的进化复杂性不一致的现象，即基因组大小与遗传复杂性之间没有必然的联系，某些较低等的生物C 值却很大，如一些两栖物种的C值甚至比哺乳动物还大。
5.DNA的半保留复制（semiconservative replication）：DNA 在复制过程中，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。
这样新形成的两个DNA 分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样。
因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式被称为DNA的半保留复制。
6.DNA的半不连续复制（semi-discontinuous replication）：DNA复制过程中前导链的复制是连续的，而另一条链，即后随链的复制是中断的、不连续的。
7.DNA的变性（denaturation）和复性（renaturation）：变性是DNA双链的氢键断裂，最后完全变成单链的过程。
复性是热变性的DNA经缓慢冷却，从单链恢复成双链的过程。
8.DNA聚合酶（DNA polymerase）：一种催化由脱氧核糖核苷三磷酸合成DNA的酶。
因为它以DNA为模板，所以又被称为依赖于DNA的DNA聚合酶。
不同种类的DNA 聚合酶可能参与DNA的复制和／或修复。
生物化学习题三
一、名词解释1．遗传密码：mRNA是蛋白质合成的直接模板，mRNA线性序列上每三个核苷酸编码一个氨基酸，这三个核苷酸即称为一个氨基酸的遗传密码2. Klenow片段：复制时，DNA聚合酶Ⅰ用枯草杆菌蛋白酶进行有限的水解，得到两个大小不同的片段，其中的大片段即为Klenow片段，其含有5’→3’DNA聚合酶和3’→5’核糖外切酶两种活性。
3. 半保留复制：DNA的两条链彼此分开各自作为模板，按碱基配对规则合成互补链，由此产生的子代双螺旋DNA的一条链来自于亲代，另一条则是以这条亲代链为模板完全重新合成的新链，由于碱基互补，两个子细胞的DNA双链都和亲代母链碱基序列一致。
这样的复制方式为半保留复制。
4. 不对称转录：在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录，且模板链并非永远在同一条单链上。
5. 顺式作用元件：指DNA上影响基因活性的遗传元件，如启动子、增强子、操纵基因、终止子等。
6．第二信使：由第一信使激发，在细胞内传递信息的分子，如IP3、cAMP等7．操纵子：原核生物基因组织的相关功能的基因（结构基因）、控制基因及其其他元件组成一个协同表达的单位8．冈崎片段：在DNA复制中，以5，3，方向的DNA单链为模板与复制叉移动方向合成的许多不连续的DNA短链，即为冈崎片段。
9．启动子：作为一种顺式作用元件是用来启动基因转录必需的一段DNA序列，包括RNA 聚合酶的识别、结合和转录起始，以及激活该酶转录功能，本身不被转录。
10．逆转录：与中心法则遗传信息流向（DNA RNA 蛋白质）相反，以RNA为模板合成DNA的过程二、填空1. 遗传的物质基础是DNA ,其复制的方式为半保留复制。
2. 编码20种氨基酸的遗传密码有61种，起始密码为AUG 。
3. 以RNA为模板合成DNA的作用称为逆转录，合成的DNA称为cDNA或负链DNA 。
4. 氨酰-tRNA分子中的反密码子能与mRNA的密码子配对。
2020-2021学年高二生物人教版一教学案：专题5课题2多聚酶链式反应扩增片段版含答案生物
一、PCR扩增的原理和过程 (阅读教材P58～62 )1．细胞内DNA复制的条件原料4种脱氧核苷酸模板2条DNA母链酶解旋酶和DNA聚合酶引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸2.PCR扩增的原理及条件(1)PCR(多聚酶链式反响)：一种体外迅速扩增DNA片段的技术.它能以极少量的DNA 为模板,在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝.(2)原理：DNA的热变性原理,即：(3)扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸.(4)条件①模板：DNA .②引物：能分别与DNA两条模板链相结合的物质 .③原料：4种脱氧核苷酸.④酶：耐高温的DNA聚合酶,一般用Taq DNA聚合酶.⑤其他条件：需要稳定的缓冲溶液和能自动调控温度的温控设备.(5)引物一小段DNA或RNA ,能与DNA母链的一段碱基序列互补配对,用于PCR引物的长度通常为20～30个核苷酸 .3．PCR的反响过程(1)变性：温度上升到90 ℃以上时,双链DNA解聚为单链.(2)复性：温度下降到50 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合.(3)延伸：温度上升到72 ℃左右时,溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原那么合成新DNA链.二、实验操作及DNA含量的测定(阅读教材P62～63 )1．实验操作程序准备―→移液―→混合―→离心―→反响.2．DNA含量的测定(1)原理：利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量.(2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm处紫外分光光度计的读数)×稀释倍数.注：在标准厚度为1 cm的比色杯中,OD260为1相当于50 μg/mL的双链DNA .[共研探究]多聚酶链式反响简称PCR ,是一种体外迅速扩增DNA片段的技术,这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的.请结合已学过的DNA分子结构和复制的相关知识,答复以下问题.1．PCR技术(1) PCR的原理：在80～100_℃的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性.当温度缓慢降低后,两条彼此别离的DNA链又会重新结合成双链.(2)子链扩增：需要引物,合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸.(3)条件①模板：DNA .②引物：分别与DNA两条模板链相结合的两种小的核酸片段.③原料：A、T、G、C四种脱氧核苷酸.④酶：耐热DNA聚合酶,一般用耐高温的Taq_DNA聚合酶.⑤其他条件：需要一定的缓冲溶液和能严格控制温度的温控设备.(4)PCR扩增中的重点解读①DNA聚合酶不能从头开始合成DNA ,只能从引物的3′端延伸DNA链,因此扩增DNA 时应参加两种引物.②PCR扩增DNA过程中不需要解旋酶.③利用PCR技术扩增1个DNA分子n次,所得DNA分子中,不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是1/2n .含引物的DNA分子所占的比例是100% .2．PCR技术的过程(1)变性：当温度上升到90 ℃以上时,双链DNA解聚为单链.(2)复性温度下降到50 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合.(3)延伸温度上升到72 ℃左右,溶液中的四种脱氧核苷酸(A ,T ,C ,G)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原那么合成新的DNA链.3．PCR扩增的理论计算PCR扩增时,DNA数目呈指数形式扩增.假设只有一条DNA模板,那么复制n次后有2n条DNA；假设一开始有a条模板,那么复制n次后有a×2n条DNA .[总结升华]生物体内的DNA复制与PCR反响的比较体内DNA复制PCR反响不同点时期细胞有丝分裂间期和减数第|一次分裂前的间期体外随时进行场所活细胞内微量离心管内酶解旋酶、DNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)解旋在解旋酶的作用下,细胞提供能量,局部解开加热至||90 ℃以上时,双链全部解开,不需解旋酶引物一小段RNA可以是RNA也可以是单链DNA分子片段合成子链在引物根底上,一条链连续合成,另一条链不连续合成分别从两条链的引物的3′端开始,都是连续合成,控制温度在72 ℃左右特点边解旋边复制,半保存复制体外迅速扩增循环次数受生物体自身控制30屡次产物完整DNA DNA片段相同点原料4种脱氧核苷酸(A、G、C、T)复制原理严格遵循碱基互补配对原那么,半保存复制模板以DNA母链为模板引物都需要分别与两条模板链相结合的两种引物(1)DNA母链的3′端对应着子链的5′端,即DNA的两条链是反向平行的.(2)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开,DNA聚合酶、DNA连接酶催化形成磷酸二酯键.(3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上,需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口,不需要模板.(4)从第二轮循环开始,上一次循环的产物也作为模板参与反响,并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合,进行DNA的延伸.这样,DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列,使这段固定长度的序列呈指数形式扩增.[对点演练]1．近20年来,PCR技术(多聚酶链式反响)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段,其原理是利用DNA半保存复制,在试管中进行DNA的人工复制(如图) ,在短时间内,将DNA扩增几百万倍甚至||几十亿倍,从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体.(1)加热使DNA双链间的__________键完全翻开,称为________；而在细胞中是在________酶的作用下进行的.(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段,应该参加________种特定的引物.当温度降低至||55 ℃时,引物与两条 "舒展〞的模板的特定位置结合,在DNA聚合酶的作用下,只能在引物的________端连接脱氧核苷酸,两条子链的延伸方向都是________________ .(3)PCR技术的必需条件,除了模板、原料、酶之外,至||少还有三个条件,即液体环境、适宜的________和________ ,前者由________自动调控,后者那么靠________来维持.(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制,如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中,以14N 标记的脱氧核苷酸为原料,连续复制四次之后,那么15N 标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________ .解析：(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂,称为解旋,而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂.(2)PCR分为三个根本反响步骤：变性(95 ℃)、复性(55 ℃)、延伸(72 ℃) ,其特异性依赖于与靶序列互补的引物,引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段,两引物之间的距离决定扩增片段的长度.由于DNA聚合酶只能从引物的3′端延伸DNA链,那么DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸.(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同,除了需要模板、原料、酶以外,还需要液体环境(稳定的缓冲溶液) ,每一个步骤都需要适宜的温度和酸碱度等 .(4)一个DNA分子连续复制四次之后,形成16个DNA分子,15N标记的DNA分子有2个,那么15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8 .答案：(1)氢解旋解旋(2)两3′从子链的5′端向3′端延伸(3)温度酸碱度PCR仪缓冲液(4)1/8[共研探究]PCR是在PCR仪中完成的,经过屡次的循环使DNA片段得以大量地扩增,这个过程有严格的操作规程.1．结合下面实验操作过程,答复以下问题：(1)实验操作过程准备：按照PCR反响体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上↓移液：用微量移液器按照配方向微量离心管中依次参加各组成成分↓混合：盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管的侧壁↓离心：将微量离心管放在离心机上,离心约10 s ,使反响液集中在离心管底部↓反响：将离心管放入PCR仪中进行反响(2)本卷须知①防止外源DNA污染：所用离心管、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌.②缓冲液和酶分装成小份,并在－20_℃储存.③每添加一种反响成分,更换一个移液器上的枪头 .④混匀后离心处理,使反响液集中在离心管底部.2．实验中DNA含量的测定理论上DNA呈指数增长,但实际可能会有诸多因素影响DNA含量,所以需要对DNA 含量进行测定.(1)原理：DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰.峰值的大小与DNA的含量有关,可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定.(2)过程①稀释：取2 μL PCR反响液,参加98 μL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释.②对照调零：以蒸馏水作为空白对照,在波长260 nm 处,将紫外分光光度计的读数调节至||零.③测定：取DNA稀释液100 μL至||比色杯中,测定260 nm 处的光吸收值.④计算：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数.[总结升华]1．PCR过程用到的重要仪器(1)PCR仪：该仪器能自动调控温度,实现DNA的扩增.如果没有PCR仪,可用3个恒温水浴锅代替,操作时按程序在3个水浴锅中来回转移PCR反响的微量离心管.(2)微量离心管：总容积为0.5 mL ,实际上是进行PCR反响的场所 .(3)微量移液器：用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体.2．PCR技术的应用(1)医学上用该技术分析人的精液,对细菌、病毒感染进行早期诊断.(2)对单细胞中的DNA进行扩增,用于遗传病的基因诊断,并在此根底上进一步制备无突变的DNA片段供遗传病患者基因治疗时使用.(3)法医学用此技术来鉴别罪犯或进行亲子鉴定.(4)古生物学用此技术分析古生物化石样品,追溯其生存年代或迁徙踪迹.(5)在农业生物技术中,可运用此技术检测目的基因是否已经成功导入目标生物等.[对点演练]2．以下对PCR的实验操作顺序的表达,正确的选项是()A．准备→移液→混合→离心→反响B．准备→移液→离心→混合→反响C．离心→移液→混合→反响D．移液→离心→混合→反响解析：选A PCR的实验操作中,首||先是准备,即按照PCR反响体系的配方将需要的试剂摆放在实验桌上；其次是移液,即用微量移液器按照配方在微量离心管中依次参加各组分；然后是混合,即盖严离心管口的盖子,用手指轻轻弹击管壁,使反响液混合均匀；接着是离心,即将微量离心管放在离心机上,离心约10 s；最||后是反响.1．PCR技术扩增DNA ,需要的条件是()①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸④耐热的DNA聚合酶⑤mRNA⑥核糖体A．①②③④B．②③④⑤C．①③④⑤D．①②③⑥解析：选A PCR技术扩增DNA需要DNA模板(目的基因)、两种引物、四种脱氧核苷酸和耐热的DNA聚合酶等.2．以下有关PCR技术的表达,不正确的选项是()A．PCR技术利用的是碱基互补配对原那么B．PCR技术可用于基因诊断,判断亲缘关系等C．PCR技术需在体内进行D．PCR技术可分为变性、复性、延伸三个阶段解析：选C PCR技术是聚合酶链式反响的简称,是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术.3．DNA的复制需要引物,主要原因是()A．可加快DNA的复制速度B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链解析：选D DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA,而只能从3′端延伸DNA链,因此,DNA复制需要引物.当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链,DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸.4．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题,而被广泛应用,与细胞内的DNA复制相比,PCR可以快速扩增所需的DNA片段,请分析答复以下有关问题：(1)体内DNA复制过程中用解旋酶翻开双链DNA ,而PCR技术中的解旋原理是________________________________ .(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶,该酶是从__________________中别离的 .(3)与普通DNA聚合酶相比,Taq DNA聚合酶具有的特性是____________ .(4)与体内DNA复制相比较,PCR反响要在________________中才能进行,并且要严格控制________条件.(5)PCR中参加的引物有________种,参加引物的作用是_____________________ .解析：(1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键翻开,从而解旋,其原理是DNA的热变性原理.(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的.(3)与普通DNA聚合酶相比,Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的环境中不变性,具有耐高温的特性.(4)PCR反响需要适宜的温度和pH,因此PCR反响要在一定的缓冲溶液中进行,并需要严格控制好温度条件.(5)PCR需要两种引物,引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段.PCR中参加的引物是小段单链DNA或RNA ,作用是引导DNA复制,可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键,成为DNA复制的起点.答案：(1)DNA的热变性原理(2)水生耐热细菌Taq(3)耐高温(4)一定的缓冲溶液温度(5)2作为DNA复制的起点。
DNA合成 常见问题解答
DNA合成常见问题解答Q1. 如何保存寡核苷酸？通常，寡核苷酸应该-20℃保存，该温度下能稳定保存一年以上。
寡核苷酸在溶液中较为稳定，但易被污染的核酸酶降解，因此我们建议应干燥储存。
若要以溶液形式储存，最好将其分装在几管中分别保存，反复冻融会使寡核苷酸降解。
另外，酸性条件下，DNA会因为脱嘌呤作用而降解；碱性条件会使磷酸二酯键水解断裂。
Q2. 如何重悬寡核苷酸？为便于长期保存，我们建议使用TE缓冲液(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTApH8.0)，而不用无菌水来溶解寡核苷酸。
重悬后，寡核苷酸应该在-20癈保存以长期使用。
寡核苷酸在无菌水中很难溶解，加一定量的NaOH有助于寡核苷酸在水中溶解。
Q3. 如果寡核苷酸在室温中放置超过一星期，还可以使用吗？脱水的寡核苷酸是长期稳定的。
即使在溶液状态寡核苷酸也相当稳定，通常情况(没有引入使寡核苷酸降解的污染物)即使在室温中放置超过一星期也能使用。
Q4. 荧光染料标记的寡核苷酸，在储存和使用过程中必须特殊处理吗？如果暴露在光线下，荧光染料标记的寡核苷酸比未标记的寡核苷酸更易降解，荧光强度会逐渐降低。
为了保持其荧光效能，荧光染料标记的核苷酸应避光-20℃保存。
由于Cy3和Cy5在pH大于9时易被降解，所以Cy3和Cy5修饰Q5. 如何定量合成的寡核苷酸?合成的寡核苷酸的量非常少，不能直接称重来定量。
通常通过测量紫外吸光度值(OD值)来定量。
Q6. 如何通过紫外吸光度值来定量寡核苷酸？寡核苷酸的量经常用OD值来描述。
1个OD值是体积1ml寡核苷酸溶液，在内径1cm的比色杯中的吸光度值，约为33 mg寡核苷酸，序列不同的寡核苷酸OD值有所不同。
因为在260nm处单个碱基的吸光度值是已知的，所以序列已知的寡核苷酸的浓度就可以测定。
dT: 8.8 ml/µmoldG: 11.7 ml/µmoldC: 7.3 ml/µmoldA: 15.4 ml/µmol对于一段寡核苷酸，它的吸光度等于每个碱基的数目乘以它的吸光系数，然后将4种碱基的结果加起来就是整个寡核苷酸的吸光度。
分子生物学 名词解释
名词解释：断裂基因、外显子、内含子、C值、C值矛盾、基因家族、基因簇、卫星DNA、ORF、微卫星DNA、反向重复序列、正链/负链RNA病毒、重叠基因、端粒酶、假基因、Alu家族、基因组学。
断裂基因：在真核生物基因组中，基因是不连续的，在基因的编码区域内部含有大量的不编码序列，从而打断了对应于蛋白质的氨基酸序列。
这种不连续的基因又称断裂基因或割裂基因。
外显子：断裂基因中编码的序列称为外显子(exon)，即基因中对应于信使RNA序列的区域。
内含子：断裂基因中不编码的间隔序列称为内含子(intron)，内含子是在信使RNA被转录后的剪接加工中去除的区域。
C值：生物种的一个特征是一个单倍体基因组的全部DNA含量总是相对恒定的。
通常称为该物种的C值。
C值矛盾：C-值矛盾（C Value Paradox）是指真核生物中DNA含量的反常现象。
主要表现为：① C值不随生物的进化程度和复杂性而增加；②关系密切的生物C值相差甚大；③高等真核生物具有比用于遗传高得多的C值。
基因家族：基因家族(gene family)是真核生物基因组中来源相同，结构相似，功能相关的一组基因。
基因簇：基因簇(gene cluster)是指基因家族中的各成员紧密成簇排列成大段的串联重复单位,定位于染色体的特殊区域。
卫星DNA：有些高度重复DNA序列的碱基组成和浮力密度与主体DNA不同，在氯化铯密度梯度离心时，可形成相对独立于主DNA带的卫星带。
这些卫星带称为卫星DNA。
ORF：指核苷酸序列的可阅读框。
微卫星DNA：微卫星DNA是由更简单的重复单位组成的小序列，分散于基因组中，大多数重复单位是二核苷酸，也有少量三或四核苷酸的重复单位。
反向重复序列：在DNA分子中核苷酸顺序相同、区向相反的核苷酸序列。
如：AGTTC…CGTTATAACG…GCAAT正链/负链RNA病毒：所含核酸为RNA的病毒称为RNA病毒。
如果所含单恋核酸与mRNA序列相同称之为正链RNA病毒，与mRNA序列互补称之为负链RNA病毒。
dna互补碱基规律总结(优选3篇)
dna互补碱基规律总结第1篇1、在一个双链DNA分子中，A=T、G=C。
即：A+G=T+C或A+C=T+G。
也就是说，嘌呤碱基总数等于嘧啶碱基总数，各占全部碱基总数的50%。
2、在双链DNA分子中，两个互补配对的碱基之和的比值与该DNA分子中每一单链中这一比值相等。
（A1+A2+T1+T2）/(G1+G2+C1+C2）=(A1+T1）/(G1+C1）=(A2+T2）/(G2+C2）。
3、DNA分子一条链中，两个不互补配对的碱基之和的比值等于另一互补链中这一比值的倒数，即DNA分子一条链中的比值等于其互补链中这一比值的倒数。
（A1+G1）/ (T1+C1）=(T2+C2）/(A2+G2）。
4、在双链DNA分子中，互补的两个碱基和占全部碱基的比值等于其中任何一条单链占该碱基比例的比值，且等于其转录形成的mRNA中该种比例的比值。
即双链（A+T) %或（G+C)%=任意单链(A+T)%或（G+C)%=mRNA中(A+U)%或（G+C)%。
DNA为双链双螺旋结构。
dna互补碱基规律总结第2篇AT、CG互补配对，确实是DNA双链结构中最常见的现象，是由James Watson和Francis Crick在前人的研究基础上确定的。
因此，我们后人也将这种碱基互补配对的方式，称为Watson-Crick pairing（Watson-Crick配对）。
但就在James Watson和FrancisCrick阐明DNA双螺旋结构的十年之后，一名在荷兰出生的美国生化学家Karst Hoogsteen发现了一种全新的DNA晶体结构。
其中，AT和CG碱基互补配对的方式，和Watson-Crick pairing的是不同的。
我们先来看下面这个简化图：Karst Hoogsteen发现，相比Watson-Crickpairing，A碱基旋转了一个角度，用别的原子和T碱基发生互补配对。
如果用详细的化学结构式来看，就是下面这个样子：在Watson-Crickpairing中，A碱基的N1和C6上的N，分别与T碱基的N3和C4上的O，形成两个氢键。
dna双链连接结构
dna双链连接结构DNA（脱氧核酸）是存在于所有生物体内的一种巨大的分子，它携带着遗传信息。
DNA分子由两条互补的链组成，这两条链通过特定的化学键连接在一起，形成DNA的双链结构。
这种双链结构是DNA的基本组织形式，也是DNA携带和传递遗传信息的基础。
DNA的双链结构是由四种碱基（腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、鸟嘌呤G 和胞嘧啶C）组成的。
这四种碱基在DNA中按照特定的规则配对：A永远与T配对，G永远与C配对。
这种碱基之间的配对形成了稳定的氢键连接，将两条DNA链牢固地结合在一起。
DNA的双链结构呈螺旋状，被称为DNA双螺旋。
双螺旋结构中的两条链以相互平行的方式盘绕在一起，并且呈左旋。
每个碱基对都被双螺旋结构所包裹，形成一个螺旋周期。
DNA双螺旋的结构类似于梯子的形状，两条链就像是梯子的两个侧链，碱基对则像是梯子的横梁连接在一起。
DNA的双链结构具有很高的稳定性和可靠性。
这是因为碱基之间的氢键连接很强大，可以抵抗外界的各种影响。
同时，碱基之间的配对规则使得DNA能够迅速高效地进行复制和传递遗传信息。
在DNA复制过程中，两条链可以通过碱基互补规则进行分离，并且每一条链可以作为模板合成新的对应碱基的链。
这样，每一条新的DNA分子都包含了与原有DNA相同的遗传信息。
除了稳定性和可靠性，DNA双链结构还具有其他重要的特征。
双链结构中的碱基对按照一定的排列顺序存在，这种排列顺序被称为DNA 的序列。
DNA的序列是由碱基的排列决定的，它对于遗传信息的存储和传递至关重要。
通过对DNA序列的研究，科学家可以了解到生物体的遗传特征和变异情况。
此外，DNA的双链结构还具有自我修复的能力。
当DNA的双链结构发生损伤时，细胞会通过特定的修复机制来修复损伤，维持DNA的完整性和稳定性。
总结起来，DNA的双链连接结构是DNA的基本组织形式，由两条互补的链通过氢键连接在一起。
双链结构的稳定性和可靠性使得DNA能够进行高效的复制和遗传信息传递。
acgt碱基 结合方式
acgt碱基结合方式全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：ACGT碱基是DNA的四种碱基，它们分别代表腺嘌呤（Adenine）、胞嘧啶（Cytosine）、鸟嘌呤（Guanine）和胸腺嘧啶（Thymine）。
这四种碱基在DNA中的排列组合决定了DNA的编码信息，而它们之间的结合方式也是DNA分子的重要组成部分。
ACGT碱基之间是通过氢键的方式进行结合的，在DNA的双螺旋结构中，A和T之间通过两条氢键结合，而C和G之间通过三条氢键结合。
这样的配对方式保证了DNA的稳定性和可靠性，使得DNA分子在复制和传递遗传信息过程中能够保持准确性。
ACGT碱基之间的结合方式还直接影响了DNA的信息表达能力。
由于A和T之间的结合比C和G之间的结合更为松弛，因此在DNA的复制和转录过程中，A-T键容易发生突变，从而导致基因的突变和变异。
这也是为什么一些遗传病和疾病会与DNA的碱基配对方式有关。
除了在DNA的双螺旋结构中发挥重要作用外，ACGT碱基的结合方式还影响了DNA与蛋白质的相互作用。
DNA编码的信息通过碱基的排列组合决定了蛋白质的合成，而在这一过程中，ACGT碱基的结合方式会直接影响到DNA序列的解读和翻译。
ACGT碱基的结合方式对于DNA的结构和功能具有重要意义。
它不仅决定了DNA的稳定性和可靠性，还影响了DNA的信息传递和表达能力。
通过深入研究ACGT碱基之间的结合方式，我们能够更好地理解DNA的组成和功能，为人类基因组学和疾病治疗研究提供新的思路和方法。
【本文共XXX字】第二篇示例：DNA中的四种碱基，即腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）在生物学中发挥着至关重要的作用。
它们之间的结合方式是DNA双螺旋结构的基础，也是遗传信息传递的关键。
这些碱基通过特定的方式相互配对形成DNA双链的稳定结构，从而确保DNA 分子在细胞复制和转录过程中的准确传递，同时也是生物进化多样性的基础。
在DNA分子中，A和T以及C和G之间通过氢键形成稳定的碱基对。
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cDNA第二链的合成
1)离心沉淀cDNA第一链，并重悬在50μl水中，加50μl 2×第二链缓冲液(0.2mol／L Hepes，pH6.9，20m mol／L MgCl2，5 m mol／L DTT，0.14 mol／L KCl，1 m mol／L 4种Dntp)，混合均匀。
2)每微克底物加大肠杆菌DNA聚合酶K1enow片段20～50单位，15℃反应20小时，此酶能识别cDNA 3’末端发卡环，并以其为引物，cDNA第一链为模板，开始第二链的合成。
3)加0.5 mol／L EDTA 2μl终止反应。
取样电泳，以提取第一链同样的方法分离沉淀dsDNA。
对于这样合成的dsDNA不是全长的DNA分子，所以，需要进一步用逆转录酶合成。
4)溶解上述dsDNA在20μl水中，再加入：1mol／L Tris.HCl pH8.3)5μl，1 mol／L KCl 7μl,250m mol／L MgCl2 2μl，20m mol／L 4种‘dNTP各2.5μl,700m mol／L β-MCE 2μl，加重煎水到48μl，加逆转录酶2μl (40单位)、42℃保温反应1小时。
5)加0.5 mol／L EDTA 2μl终止反应，取样电泳，以同样方法抽提，分离沉淀dsDNA。
6)用两次合成的双链cDNA和单链cDNA在1.4％碱性琼脂糖凝胶上电泳，放射自显影后观察，如果dsDNA片段的长度是第一链cDNA的两倍，那么，合成便是成功的。
7)用核酸酶S1消化dsDNA，除去连接两条链的发卡环。