人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析

中国图书分类号Q784R318.04文献标识码Ａ文章编号1004-5503（2009）01-0006-04【基础研究】人NIRF基因真核表达质粒的构建及其蛋白产物的生物信息学分析

常蕾钱冠华段昌柱

【摘要】目的克隆人NIRF基因，构建其真核表达质粒，并运用生物信息学方法对NIRF蛋白进行分析。方法应用RT-PCR技术，从HeLa细胞中扩增NIRF基因，插入到真核表达载体pcDNA3.1-Flag中，双酶切鉴定并测序。在NCBI蛋白质结构数据库中寻找与NIRF具有较高同源性的1WY8和1Z6U，并利用Insight II结构生物信息学分析软件分析NIRF蛋白的结构和功能。结果扩增出约2400bp的人NIRF全长cDNA；重组真核表达质粒pcDNA3.1-Flag-NIRF酶切后，可见约2400bp的目的片段；测序结果表明NIRF全长cDNA与GenBank中NIRF序列完全一致。1WY8片段有3个赖氨酸残基，主要位于蛋白空间构象的表面；1Z6U片段含有Ring finger结构域，具有ligase活性。结论已成功克隆了人NIRF基因全长cDNA，构建了其真核表达质粒，并利用生物信息学方法，初步分析了NIRF蛋白泛素化作用的机理。

【关键词】NIRF基因；克隆；真核表达质粒；生物信息学

Construction of Eukaryotic Expression Vector for Human NIRF Gene and Bioinformatics of Deduced Expressed Protein

CHANG Lei,QIAN Guan-hua,DUAN Chang-zhu（Cell Biology Institute of Chongqing Medical University, Chongqing400016,China）

【Abstract】Objective To clone human NIRF gene,construct its eukaryotic expression vector and analyze the bioinformatics of deduced expressed protein.Methods NIRF gene was amplified from HeLa cells by RT-PCR and inserted into eukaryotic expres－sion vector pcDNA3.1-Flag.The constructed recombinant plasmid pcDNA3.1-Flag-NIRF was identified by restriction analysis and se－quencing.Fragments1WY8and1Z6U highly homologous to NIRF were screened from NCBI protein structure data bank for analyzing structure and function of NIRF protein by InsightⅡsoftware.Results The NIRF cDNA fragment at a full length of about2400bp was amplified.The target gene fragment at a length of about2400bp was recovered from recombinant plasmid pcDNA3.1-Flag-NIRF digested with restriction endonuclease,and its sequence was completely identical to that of NIRF reported in GenBank.1WY8frag－ment contained3lysine residues which was mainly located on the surface of spatial conformation of protein.1Z6U fragment contained a ring finger structural domain and showed the activity of ligase.Conclusion The full-length cDNA of human NIRF was successfully cloned,and its eukaryotic expression vector was constructed.The mechanism of ubiquitination of NIRF protein was preliminarily ana－lyzed by bioinformatical method.

【Key words】NIRF gene;Cloning;Eukaryotic expression vector;Bioinformatics

Np95／ICBP90-like RING finger protein（NIRF）是近年发现的一种核蛋白，其基因定位于9p24.1，全长NIRF含有802个氨基酸残基。研究表明，NIRF具有E3（Ubiquitin／UBL-protein ligase，泛素／类泛素连接酶）功能，在细胞内能与Cd k2-cyclin E2和PCNP （PEST-containing nuclear protein）结合，并参与PCNP 的泛素化。同时，该蛋白在细胞内能将肿瘤抑制蛋白P53直接泛素化［1］。最新研究表明，NIRF可能是癌症治疗的靶基因［2］。本研究克隆了人NIRF基因，构建其真核表达载体，并应用生物信息学方法，对其蛋白的空间结构及泛素化作用机理进行分析，为进一步探索NIRF在癌症治疗中的作用奠定基础。1.材料与方法

1.1细胞、质粒及菌株

HeLa细胞、pcDNA3.1-Flag质粒和大肠杆菌DH5α为本室保存。

1.2试剂

DMEM培养基和胎牛血清（FCS）为HyClone公司产品；Trizol试剂盒和superscriptⅡ反转录酶购自Invitrogen公司；oligodT购自TaKaRa公司；DNA高保真酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA marker、质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒和DNA 片段纯化试剂盒均购自Promega公司。

1.3细胞培养及总RNA的提取

用DMEM培养液及10％FCS常规培养HeLa 细胞，每3d换液传代。取约106个细胞，提取总RNA，逆转录反应按试剂说明进行。

基金项目：国家自然科学基金资助项目（No.30872248）；重庆市科技委员会资助（CSTC，2008BB5400）；重庆市教育委

员会资助（KJ080326）.

作者单位：重庆医科大学细胞生物学教研室（重庆400016）.

通讯作者：段昌柱，E-mail：shebeichu@