乳酸菌分类鉴定方法的研究进展
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[ 15] [ 10]
利用 16S r DNA 测 序和 DNA 杂交 技术研究
、 芽孢 杆菌
[ 11-12]
、 乳杆 菌
[ 13-14]
、 肠
了泡菜中乳酸菌的 菌群变化, 在泡 菜 ( 5d ) 的发酵 过程中 随机分离了 120 株乳酸菌, 结果发现在发酵的前中期, 柠 檬明串珠菌 ( L citreum ) 是 优势 种, 然而 在后期 主要 为清 酒乳杆菌 ( L sake ) 或弯曲乳杆菌以及短乳杆菌。 WATER J等
乳酸菌是利用可 发酵糖产 生大量 乳酸 的革兰 氏阳性 细菌的通称。乳酸菌是 广义范 畴的 概念, 是 非正 式、 非规 范的细菌分类学名称
[ 1]
用 API50CHL 体系分析了 317 株可能为乳酸菌的菌株, 只 有 38% 分离株被鉴定到 种的 水平。W IJTZES T 等 到种的水平。 虽然应用表型性状鉴定对部分乳酸菌是非常有用 的, 但对某些乳 酸菌 来说, 即使 表型 性状 很相 似, 也不 意 味 着基因型亲源关系很近 2 DNA 标记技术 传统的表型、 生物化 学方 法鉴定 微生 物耗时 耗力, 培 养条件的改变还可能导致结果发生改变, 鉴定结果很不 稳 定。因此, 人们希望能找到一种快速、 稳定、 灵敏的方法 用 于微生物的分类研 究。从分子 和基因 水平 来认识 乳酸 菌 的遗传结构、 组成和 分类, 许多 新的分 子标 记技术 被用 来 进行乳酸菌的 分类 和鉴 定, 如 16S r DNA、 16S ~ 23S r RNA 基因间隔 区 ( Intergen ic Spacer R eg ion, ISR ) 的 序列 分析 和 基于 PCR 技术的分子 标记技术 等, 其中 基于 PCR 技术 的 分子标记又 可分 为 随机 扩增 多态 性 DNA ( R andom ly Amp lified Polymorph ic DNA, RA PD ) 、 扩增片段 长度多态 性 ( Amp lified Fragm en t Length Po lym orph ism, A FLP )、 限制 性 片 段 长 度 多 态 性 ( Restriction Fragm en t L ength Po lym or ph ism, RFLP)、 重复基因外回文序列 ( R ep et itive Extragen ic
酸菌的分类鉴定不仅费时 , 有时甚至难以完成。随着分子生物技术的发展和基因数据库的建立 , 将分子标记技术、 新兴鉴定技术 与常规方法结合使用 , 将使乳酸菌的分类、 鉴定更为准确和便捷。 关 键 词 : 乳酸菌; 食品; 酿造 ; 鉴定 文献标识码: A 文章编号 : 0254 - 5071( 2009) 06 - 0001 - 04 中图分类号 : TS201 3
[ 17]
依据 16S~ 23S r RNA 的 ISR 设计的引物鉴定干酪乳
[ 8]
杆菌, 可以区分干酪乳 杆菌或 类干酪 乳杆 菌、 鼠李 糖乳杆 菌以及玉 米乳 杆菌。 SCARPELL I NIM 等 属菌种的鉴定。 但无论是 16S r DNA 序列还是 16S~ 23S rDNA ISR 序 列分析方法, 都是针对乳酸菌基因组的一部分序列进行分 析, 而不是在全基因组的水平上分析, 具有一定的局限性, 并且该方法比较耗时, 当样本数量很多时, 测序费用较高。 2 2 基于 PCR 的 DNA 标记技术 随着 DNA 标记技术的 不断 成熟, 人 们建立 了一 系列 以 DNA 标记为基础的微 生物 鉴定和 检测技 术, 根 据菌株 之间遗传距离所产生的 DNA 指纹差异来直接 反映检测微 生物菌株的 DNA 多态性来对其鉴定和分型。这些技术的 最大优势就是可以忽略各种复杂的微生物生长条件, 不需 要预先培养就可以鉴定和检测。多数研究结果 表明, DNA 标记分型技术具有从种属到菌株各种水平的鉴别能力, 为 乳酸菌的快速分子鉴定和分型提供了借鉴 2 2 1 特异性扩增靶片段 通过设计特异性的 引物在 一定条 件下 通过聚 合酶链 式反应选择性的特 异扩 增特定 的靶 DNA 片 段, 理 论上讲 可以在任何 分类 水平 上 对微 生物 菌株 进 行区 别和 鉴定。 虽然特异性扩增靶 DNA 片段可以快速准确地 在种和亚种 甚至菌株水平鉴定乳酸菌, 但是需要较复杂的引物设计策 略, 并鉴定引物的有效 性后才 能获得 一系 列有效 的引物。 因此这种方法只有在 对检测和 鉴定的 菌株 完全了 解的情 况下, 才最为有效和实用。 2 2 2 基因组短重复序列标记 这类标记主要是指基因组中的分散保守重 复 DNA 元 件 ( Intersp ersed Con served R epetitive DNA E le m ents), 依据 它们在整个细菌基因组 DNA 中存在多个拷贝 进行引物设 计。现在已有 3 类重复性元件得到了确认, 即重复基因外 回 文 序 列 ( R epet itive Extragen ic Palindrom ic Sequen ces ,
Progress in research on lactic acid bacteria identification m ethod s
PANG Hu ili , TAN Zhong fang , CA I Y m i in , Q I N G uangyong
1 1 2 1*
( 1. Provincia lK ey Labora tory of Ion Beam B io-engineer ing, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China; 2. N a tional Institute of L ivestock and G rassland of Japan, T ochig i3292793, Japan)
[ 5] [ 4]
利用
。当前, 乳酸菌产品以其独特的生
2 种碳源发酵测试体系也未能将 14种 乳酸菌分 离株鉴 定
物学功能呈现出前所未有的商业开发利用价值, 乳酸菌在 酿造工业 中有 广 泛的 应 用, 如在 白 酒固 态 发酵 酿 造中, 乳酸菌产生的乳 酸可 以与乙 醇酯 化生成 乳酸 乙酯, 对于 白酒的风味十分 重要, 用于 葡萄酒 及苹 果酒酿 造中 的乳 酸菌可以 触发 苹果 酸、 乳酸 发酵 等。所 以优 良菌 株 的筛 选、 生产菌种的保护越来越引起商家的重视。 1 经典方法 (表型特征鉴定 ) 人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有悠久的历史, 并积累了丰富的经验和知识, 形成了至今一直沿用的传统 分类鉴定方法, 包括形 态特征、 生理生 化反 应及血 清学反 应等, 这些方法都是基 于微生 物表面 受体 的特异 性, 属于 表型分类法。 一般 情 况 下, 表 型 鉴 定 是 一 种 比 较 廉 价 的 方 法。 GONZLEZ C J等
收稿日期 : 2008 -11-07 基金项目 : 国家 973 项目 ( 2004CB719604
[ 3]
利
4) ; 农业部核技术农业应用专项资助课题 ( 200803034 )
作者简介 : 庞会利 ( 1982 -), 女 , 河南洛阳人 , 博士研究生 , 主要从事乳酸菌的分类鉴定及应用研究工作 ; 秦广雍 * , 通讯作者。
专论与综述
中
国
酿
造
ຫໍສະໝຸດ Baidu
2009年 第 6期 总第 207期
1
乳酸菌分类鉴定方法的研究进展
庞会利 , 谈重芳 , 蔡义民 , 秦广雍
1 1 2 1*
( 1 郑州大学 离子束生物工程省重点实验室, 河南 郑州 450052; 2 日本国立畜产草地研究所, 日本 枥木县 329-2793)
摘 要: 对目前使用的乳酸菌表型特征鉴定和基因型特征鉴定方法的优缺点进行了综述。依据表型的常规生理生化特征进行乳
[ 7]
等。
2 2 3 随机扩 增多态 性 DNA 技术 ( Random Am p lified Poly morph ic DNA, RA PD ) RAPD 作为 一 种分 子 标 记, 具有 种 属 甚至 种 间 特 异 性。该方法的重现率较低, RAPD 技术 很难将乳 酸菌鉴 定 到种的水平。现在主要和 其他方法 一起使 用, 如 ANTONSSON M 等 [ 16] 先将分 离自 奶酪 的 33 株 乳酸 菌分 为 10 个 RAPD 型 ( RAPD types) , 再用温度梯度凝胶电 泳 ( T e m per atu re G rad ien t G el Electrophoresis)技 术将这 些细菌 鉴定 到 种的 水平。 CU S ICK S M 等
[ 2]
。
利用 44种形态学和生理学特征从淡水
鱼及其生活环境 中分 离到 249 株乳 酸菌 进行 鉴定, 其中 90% 以上的分离株被 鉴定到 属的 水平。目 前已经 有一些 比较 受 欢 迎 的 微 生 物 鉴 定 体 系, 如 API 、BI OLOG 和 AP I50CHL 等应用于微 生物的 鉴定。 CORSETT I A 等
2
2009 No .6 Serial No . 207
C hina Brew ing
Forum and Summ ary
Palind ro m ic Sequen ces , REP)、 肠细菌基因间重复共有序列 ( Enterobacterial Repetit ive Intergen ic Consen sus S equences , ER IC)等。 21 r DNA / rRNA 序列的分子标记 16S rDNA 或 rRNA 序 列 既具 有保 守性, 又 具有 高变 性, 是目 前细 菌 分 类和 鉴 定 经 常 使用 的 一 种 检 测 方法。 CHO I I K 等
[ 6]
REP )、 肠细菌基因间重复 共有序列 ( En terobacterial R epet itive In tergen ic Con sensu sSequen ces , ER IC) 、 BOX 序 列以 及 ( GTG ) 5序列。 重 复 序 列 PCR ( repetit ive sequence -based PCR, RepPCR )技术可以迅速而准确地在亚种和菌株 水平上鉴别 微 生物分离株。 rep-PCR 主要应用 于细菌, 其 中乳酸 菌方 面 主要集中 在双 歧 杆菌 球菌
Ab stract : T his paper prov ides an overvie w of phenotyp ic and geno type techniques that are curren tly used for identification of LAB, and the mer it and sho rtco m ing o f a ll k inds ofm ethods are summer ized . T he conventional phenotypes based on the physio log ical and biochem ica l characteristics o f lactic acid bacter ia identification not on ly tm i e -consum ing but also so m etm i es difficult to wo rk ou. t W ith the deve lopm ent o fm o lecu lar techn iques and genetic da tabase , using a co m bination ofm olecular markers , e m erg ing identification techno log ies and conventionalme thodsw ill enable the c las sifica tion and identification of lactic ac id bacteria m ore accurate and conven ien. t K ey word s : lactic ac id bacteria ; food ; bre w ing ; identification
利用 16S r DNA 测 序和 DNA 杂交 技术研究
、 芽孢 杆菌
[ 11-12]
、 乳杆 菌
[ 13-14]
、 肠
了泡菜中乳酸菌的 菌群变化, 在泡 菜 ( 5d ) 的发酵 过程中 随机分离了 120 株乳酸菌, 结果发现在发酵的前中期, 柠 檬明串珠菌 ( L citreum ) 是 优势 种, 然而 在后期 主要 为清 酒乳杆菌 ( L sake ) 或弯曲乳杆菌以及短乳杆菌。 WATER J等
乳酸菌是利用可 发酵糖产 生大量 乳酸 的革兰 氏阳性 细菌的通称。乳酸菌是 广义范 畴的 概念, 是 非正 式、 非规 范的细菌分类学名称
[ 1]
用 API50CHL 体系分析了 317 株可能为乳酸菌的菌株, 只 有 38% 分离株被鉴定到 种的 水平。W IJTZES T 等 到种的水平。 虽然应用表型性状鉴定对部分乳酸菌是非常有用 的, 但对某些乳 酸菌 来说, 即使 表型 性状 很相 似, 也不 意 味 着基因型亲源关系很近 2 DNA 标记技术 传统的表型、 生物化 学方 法鉴定 微生 物耗时 耗力, 培 养条件的改变还可能导致结果发生改变, 鉴定结果很不 稳 定。因此, 人们希望能找到一种快速、 稳定、 灵敏的方法 用 于微生物的分类研 究。从分子 和基因 水平 来认识 乳酸 菌 的遗传结构、 组成和 分类, 许多 新的分 子标 记技术 被用 来 进行乳酸菌的 分类 和鉴 定, 如 16S r DNA、 16S ~ 23S r RNA 基因间隔 区 ( Intergen ic Spacer R eg ion, ISR ) 的 序列 分析 和 基于 PCR 技术的分子 标记技术 等, 其中 基于 PCR 技术 的 分子标记又 可分 为 随机 扩增 多态 性 DNA ( R andom ly Amp lified Polymorph ic DNA, RA PD ) 、 扩增片段 长度多态 性 ( Amp lified Fragm en t Length Po lym orph ism, A FLP )、 限制 性 片 段 长 度 多 态 性 ( Restriction Fragm en t L ength Po lym or ph ism, RFLP)、 重复基因外回文序列 ( R ep et itive Extragen ic
酸菌的分类鉴定不仅费时 , 有时甚至难以完成。随着分子生物技术的发展和基因数据库的建立 , 将分子标记技术、 新兴鉴定技术 与常规方法结合使用 , 将使乳酸菌的分类、 鉴定更为准确和便捷。 关 键 词 : 乳酸菌; 食品; 酿造 ; 鉴定 文献标识码: A 文章编号 : 0254 - 5071( 2009) 06 - 0001 - 04 中图分类号 : TS201 3
[ 17]
依据 16S~ 23S r RNA 的 ISR 设计的引物鉴定干酪乳
[ 8]
杆菌, 可以区分干酪乳 杆菌或 类干酪 乳杆 菌、 鼠李 糖乳杆 菌以及玉 米乳 杆菌。 SCARPELL I NIM 等 属菌种的鉴定。 但无论是 16S r DNA 序列还是 16S~ 23S rDNA ISR 序 列分析方法, 都是针对乳酸菌基因组的一部分序列进行分 析, 而不是在全基因组的水平上分析, 具有一定的局限性, 并且该方法比较耗时, 当样本数量很多时, 测序费用较高。 2 2 基于 PCR 的 DNA 标记技术 随着 DNA 标记技术的 不断 成熟, 人 们建立 了一 系列 以 DNA 标记为基础的微 生物 鉴定和 检测技 术, 根 据菌株 之间遗传距离所产生的 DNA 指纹差异来直接 反映检测微 生物菌株的 DNA 多态性来对其鉴定和分型。这些技术的 最大优势就是可以忽略各种复杂的微生物生长条件, 不需 要预先培养就可以鉴定和检测。多数研究结果 表明, DNA 标记分型技术具有从种属到菌株各种水平的鉴别能力, 为 乳酸菌的快速分子鉴定和分型提供了借鉴 2 2 1 特异性扩增靶片段 通过设计特异性的 引物在 一定条 件下 通过聚 合酶链 式反应选择性的特 异扩 增特定 的靶 DNA 片 段, 理 论上讲 可以在任何 分类 水平 上 对微 生物 菌株 进 行区 别和 鉴定。 虽然特异性扩增靶 DNA 片段可以快速准确地 在种和亚种 甚至菌株水平鉴定乳酸菌, 但是需要较复杂的引物设计策 略, 并鉴定引物的有效 性后才 能获得 一系 列有效 的引物。 因此这种方法只有在 对检测和 鉴定的 菌株 完全了 解的情 况下, 才最为有效和实用。 2 2 2 基因组短重复序列标记 这类标记主要是指基因组中的分散保守重 复 DNA 元 件 ( Intersp ersed Con served R epetitive DNA E le m ents), 依据 它们在整个细菌基因组 DNA 中存在多个拷贝 进行引物设 计。现在已有 3 类重复性元件得到了确认, 即重复基因外 回 文 序 列 ( R epet itive Extragen ic Palindrom ic Sequen ces ,
Progress in research on lactic acid bacteria identification m ethod s
PANG Hu ili , TAN Zhong fang , CA I Y m i in , Q I N G uangyong
1 1 2 1*
( 1. Provincia lK ey Labora tory of Ion Beam B io-engineer ing, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China; 2. N a tional Institute of L ivestock and G rassland of Japan, T ochig i3292793, Japan)
[ 5] [ 4]
利用
。当前, 乳酸菌产品以其独特的生
2 种碳源发酵测试体系也未能将 14种 乳酸菌分 离株鉴 定
物学功能呈现出前所未有的商业开发利用价值, 乳酸菌在 酿造工业 中有 广 泛的 应 用, 如在 白 酒固 态 发酵 酿 造中, 乳酸菌产生的乳 酸可 以与乙 醇酯 化生成 乳酸 乙酯, 对于 白酒的风味十分 重要, 用于 葡萄酒 及苹 果酒酿 造中 的乳 酸菌可以 触发 苹果 酸、 乳酸 发酵 等。所 以优 良菌 株 的筛 选、 生产菌种的保护越来越引起商家的重视。 1 经典方法 (表型特征鉴定 ) 人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有悠久的历史, 并积累了丰富的经验和知识, 形成了至今一直沿用的传统 分类鉴定方法, 包括形 态特征、 生理生 化反 应及血 清学反 应等, 这些方法都是基 于微生 物表面 受体 的特异 性, 属于 表型分类法。 一般 情 况 下, 表 型 鉴 定 是 一 种 比 较 廉 价 的 方 法。 GONZLEZ C J等
收稿日期 : 2008 -11-07 基金项目 : 国家 973 项目 ( 2004CB719604
[ 3]
利
4) ; 农业部核技术农业应用专项资助课题 ( 200803034 )
作者简介 : 庞会利 ( 1982 -), 女 , 河南洛阳人 , 博士研究生 , 主要从事乳酸菌的分类鉴定及应用研究工作 ; 秦广雍 * , 通讯作者。
专论与综述
中
国
酿
造
ຫໍສະໝຸດ Baidu
2009年 第 6期 总第 207期
1
乳酸菌分类鉴定方法的研究进展
庞会利 , 谈重芳 , 蔡义民 , 秦广雍
1 1 2 1*
( 1 郑州大学 离子束生物工程省重点实验室, 河南 郑州 450052; 2 日本国立畜产草地研究所, 日本 枥木县 329-2793)
摘 要: 对目前使用的乳酸菌表型特征鉴定和基因型特征鉴定方法的优缺点进行了综述。依据表型的常规生理生化特征进行乳
[ 7]
等。
2 2 3 随机扩 增多态 性 DNA 技术 ( Random Am p lified Poly morph ic DNA, RA PD ) RAPD 作为 一 种分 子 标 记, 具有 种 属 甚至 种 间 特 异 性。该方法的重现率较低, RAPD 技术 很难将乳 酸菌鉴 定 到种的水平。现在主要和 其他方法 一起使 用, 如 ANTONSSON M 等 [ 16] 先将分 离自 奶酪 的 33 株 乳酸 菌分 为 10 个 RAPD 型 ( RAPD types) , 再用温度梯度凝胶电 泳 ( T e m per atu re G rad ien t G el Electrophoresis)技 术将这 些细菌 鉴定 到 种的 水平。 CU S ICK S M 等
[ 2]
。
利用 44种形态学和生理学特征从淡水
鱼及其生活环境 中分 离到 249 株乳 酸菌 进行 鉴定, 其中 90% 以上的分离株被 鉴定到 属的 水平。目 前已经 有一些 比较 受 欢 迎 的 微 生 物 鉴 定 体 系, 如 API 、BI OLOG 和 AP I50CHL 等应用于微 生物的 鉴定。 CORSETT I A 等
2
2009 No .6 Serial No . 207
C hina Brew ing
Forum and Summ ary
Palind ro m ic Sequen ces , REP)、 肠细菌基因间重复共有序列 ( Enterobacterial Repetit ive Intergen ic Consen sus S equences , ER IC)等。 21 r DNA / rRNA 序列的分子标记 16S rDNA 或 rRNA 序 列 既具 有保 守性, 又 具有 高变 性, 是目 前细 菌 分 类和 鉴 定 经 常 使用 的 一 种 检 测 方法。 CHO I I K 等
[ 6]
REP )、 肠细菌基因间重复 共有序列 ( En terobacterial R epet itive In tergen ic Con sensu sSequen ces , ER IC) 、 BOX 序 列以 及 ( GTG ) 5序列。 重 复 序 列 PCR ( repetit ive sequence -based PCR, RepPCR )技术可以迅速而准确地在亚种和菌株 水平上鉴别 微 生物分离株。 rep-PCR 主要应用 于细菌, 其 中乳酸 菌方 面 主要集中 在双 歧 杆菌 球菌
Ab stract : T his paper prov ides an overvie w of phenotyp ic and geno type techniques that are curren tly used for identification of LAB, and the mer it and sho rtco m ing o f a ll k inds ofm ethods are summer ized . T he conventional phenotypes based on the physio log ical and biochem ica l characteristics o f lactic acid bacter ia identification not on ly tm i e -consum ing but also so m etm i es difficult to wo rk ou. t W ith the deve lopm ent o fm o lecu lar techn iques and genetic da tabase , using a co m bination ofm olecular markers , e m erg ing identification techno log ies and conventionalme thodsw ill enable the c las sifica tion and identification of lactic ac id bacteria m ore accurate and conven ien. t K ey word s : lactic ac id bacteria ; food ; bre w ing ; identification