8第八章重组讲义体的筛选
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最好用单克隆抗体（monoclonal antibody）
四、Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法， 转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、 中性尼龙膜等）。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。
二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
的靶序列灵敏度高 – 能准确反映组织细胞的相互关来自百度文库及功能状态
实验步骤
Smad2 mRNA在系膜增生型IgA肾病肾小球的表达 原位杂交×200
肺腺癌β-cat mRNA 原位杂交法×400
2、斑点印迹杂交
★斑点印迹杂交与菌落原位杂交的原理相同 ★将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙 膜上 ★优点：简单、快速、可同时检测多个样品 ★常用于病毒核酸的定量检测
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
5、酶切电泳筛选法 原理 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）
用合适的内切酶切下插入片断，再用其 它酶切这个片断，电泳后比较结果。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
第二节 免疫化学与核酸分析法
合成某一aa的基因 连接
酶切
重组
转化 缺少该aa合成 酶基因的菌株
载体
重组子
生长、获得
筛选
只缺少该aa的 基本培养基
二、核酸分子的物理检测法
原理： 碱基配对
杂交双方： 待测的核酸序列 插入片段基因制备的DNA或RNA探针
核酸杂交方法：
菌落印迹原位（in situ）杂交
斑点（dot）印迹杂交
Southern印迹杂交
实验原理与步骤
提取
点样
加热
RNA或DNA
变性
NC膜
碱溶液
放射性探针
固定
杂交
X-底片
放射自显影
一定条件
显影、定影
标记斑点
检测
3、Southern 印迹杂交
★1975年，英国Southern创建 ★ DNA与DNA的杂交，即将DNA电泳、 转印到固相支持物上，用探针进行检测的 方法。
限制性酶切割
Southern杂交定位kan抗性基因
4、直接凝胶电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
实 验 步 骤
A
B
C
M
bp
—1534
— 994 — 695
— 515
— 377 — 237
8第八章重组体的 筛选
精品
将目的DNA片段与载体连接形 成重组子，然后通过各种方法将重 组子导入宿主细胞，得到所需要的 带有重组DNA的转化子，这是基因 工程的目的所在。
转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志 的细菌细胞或其他受体细胞。
重组子的鉴定可以从直接和间接两个方 面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不 同水平进行鉴定。
直接 筛选
重组子 的筛选
间接 筛选
DNA 鉴定
载体 筛选
重组子大小鉴定
重组子酶切图谱鉴定
DNA序列分析 同源性分析鉴定（原位杂交）
质粒载体的抗性标记筛选 噬菌体包装容量的正性筛选
质粒载体的α互补筛选（蓝白色斑
筛选法） 标记补救筛选
翻译产物 Western blotting
转录产物 其他方法
Northern blotting （报告基因等）
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。 1. 原理
抗原——抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成 “沉淀圈”。
第一节 核酸分子的遗传学与物理检测法 一、遗传学检测法
1、根据载体表型特征的筛选
（1）抗药性标记插入失活筛选法
Kan
克 隆
抗 性 基 因
（2）β -半乳糖苷酶显色反应筛选法
蓝 白 菌 落
蓝白菌落
筛选白色菌落
2、根据插入基因遗传性状的筛选
重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞 之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够 实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大 肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就 可以利用营养突变株进行筛选。
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
实 验
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
步 骤
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
凝胶
滤
玻 璃
纸板
白瓷盘
尼龙膜
滤纸
吸水纸
玻璃板
重物
吸水纸转膜
用途
用于分析混合DNA样品中是否存 在能与特定探针杂交的序列。
Southern杂交由于滤膜是从凝胶 上原位印迹而来，因而能够显示出与 探针杂交的DNA片段的大小。
酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无
色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察
2.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
都是通过一定的物理方法将菌落（噬菌斑） 或突起的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持 物上，然后同液体中的探针进行杂交。
1、菌落印迹原位杂交
• 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核 酸进行杂交，称为原位杂交。
• 特点
– 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 – 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低
四、Western blotting
① Western（转膜）
电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法， 转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、 中性尼龙膜等）。
对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行 原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。
三、酶联免疫吸附测定（ELISA）
Enzyme-linked immunosorbant assay
1. 原理：
一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。
二抗（secondary antibody）： 与一抗的特异性结合。
的靶序列灵敏度高 – 能准确反映组织细胞的相互关来自百度文库及功能状态
实验步骤
Smad2 mRNA在系膜增生型IgA肾病肾小球的表达 原位杂交×200
肺腺癌β-cat mRNA 原位杂交法×400
2、斑点印迹杂交
★斑点印迹杂交与菌落原位杂交的原理相同 ★将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙 膜上 ★优点：简单、快速、可同时检测多个样品 ★常用于病毒核酸的定量检测
对表达产物的检测。蛋白——蛋白“杂交” 利用抗体作为“探针”来检测转入受体 菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。
一、放射性抗体检测法
1. 抗体与产物的结合方式 根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗） 的性质可分为几种作用方式：
固相支 持滤膜
一抗
待测基因 产物蛋白
125I标记的二抗
固相支 持滤膜
一抗
5、酶切电泳筛选法 原理 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切 图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电 泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）
用合适的内切酶切下插入片断，再用其 它酶切这个片断，电泳后比较结果。
A
B
A或B
不同克隆的酶切结果
筛选A 过A程T T
TA AT
表型筛选加酶切筛选
第二节 免疫化学与核酸分析法
合成某一aa的基因 连接
酶切
重组
转化 缺少该aa合成 酶基因的菌株
载体
重组子
生长、获得
筛选
只缺少该aa的 基本培养基
二、核酸分子的物理检测法
原理： 碱基配对
杂交双方： 待测的核酸序列 插入片段基因制备的DNA或RNA探针
核酸杂交方法：
菌落印迹原位（in situ）杂交
斑点（dot）印迹杂交
Southern印迹杂交
实验原理与步骤
提取
点样
加热
RNA或DNA
变性
NC膜
碱溶液
放射性探针
固定
杂交
X-底片
放射自显影
一定条件
显影、定影
标记斑点
检测
3、Southern 印迹杂交
★1975年，英国Southern创建 ★ DNA与DNA的杂交，即将DNA电泳、 转印到固相支持物上，用探针进行检测的 方法。
限制性酶切割
Southern杂交定位kan抗性基因
4、直接凝胶电泳检测法
利用有插入片段的重组载体的分子量比 野生型载体分子量大。
从转化后的菌体克隆
中分离质粒，电泳、
比较其分子量。
重
分子量
组 克
Marker 隆
载体
实 验 步 骤
A
B
C
M
bp
—1534
— 994 — 695
— 515
— 377 — 237
8第八章重组体的 筛选
精品
将目的DNA片段与载体连接形 成重组子，然后通过各种方法将重 组子导入宿主细胞，得到所需要的 带有重组DNA的转化子，这是基因 工程的目的所在。
转化子：导入外源DNA后获得了新的遗传标志 的细菌细胞或其他受体细胞。
重组子的鉴定可以从直接和间接两个方 面分析，可以从DNA、RNA和蛋白质三个不 同水平进行鉴定。
直接 筛选
重组子 的筛选
间接 筛选
DNA 鉴定
载体 筛选
重组子大小鉴定
重组子酶切图谱鉴定
DNA序列分析 同源性分析鉴定（原位杂交）
质粒载体的抗性标记筛选 噬菌体包装容量的正性筛选
质粒载体的α互补筛选（蓝白色斑
筛选法） 标记补救筛选
翻译产物 Western blotting
转录产物 其他方法
Northern blotting （报告基因等）
待测基因 产物蛋白
二抗
125I 标记的二 抗结合蛋白
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 125I标记的二抗
固相支 持滤膜
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
125I 标记的二抗 结合蛋白
2. 放射性抗体检测法过程
二、免疫沉淀检测法
检测分泌型产物。 1. 原理
抗原——抗体凝集反应。
2. 方法
把非放射性抗体加到平板培养基中， 当插入基因的表达产物被细菌分泌到 菌落周围时，就会与抗体反应形成 “沉淀圈”。
第一节 核酸分子的遗传学与物理检测法 一、遗传学检测法
1、根据载体表型特征的筛选
（1）抗药性标记插入失活筛选法
Kan
克 隆
抗 性 基 因
（2）β -半乳糖苷酶显色反应筛选法
蓝 白 菌 落
蓝白菌落
筛选白色菌落
2、根据插入基因遗传性状的筛选
重组体DNA分子转化到大肠杆菌受体细胞 之后，如果插入在载体分子上的外源基因能够 实现其功能性的表达，而且表达的产物能与大 肠杆菌菌株的营养缺陷突变形成互补，那么就 可以利用营养突变株进行筛选。
限制片段
DNA分子
琼脂糖电泳
带有DNA片段的凝胶
实 验
用缓冲液转移DNA 至膜（尼龙膜或硝酸 纤维素滤膜）上
步 骤
凝胶 滤膜
转膜
吸附有DNA 片段的膜
杂交、显影
凝胶
滤
玻 璃
纸板
白瓷盘
尼龙膜
滤纸
吸水纸
玻璃板
重物
吸水纸转膜
用途
用于分析混合DNA样品中是否存 在能与特定探针杂交的序列。
Southern杂交由于滤膜是从凝胶 上原位印迹而来，因而能够显示出与 探针杂交的DNA片段的大小。
酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无
色的底物转变为有色的物质（或发光），再 通过比色测定有色物质的含量（或光强度）， 从而推测目标分子的含量。
待测基因 产物蛋白
一抗
待测基因 产物蛋白
一抗 二抗
酶
二抗
酶
无色的底物
有色的产物
比色观察
2.ELISA的局限性 有效，但准确性稍差（主要取决于一抗 的特异性）。 必须与其他方法一起综合考虑。
都是通过一定的物理方法将菌落（噬菌斑） 或突起的DNA从平板或凝胶上转移到固体支持 物上，然后同液体中的探针进行杂交。
1、菌落印迹原位杂交
• 将标记的核酸探针与细胞或组织中的核 酸进行杂交，称为原位杂交。
• 特点
– 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 – 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低