神经元原代培养

神经元原代培养

一、准备

1. 试剂

1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。对照瓶内插入1～2支温度计(保证测试温度的准确性)。将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56℃时，定时30分钟。灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20～-70℃保存。

2）D-Hank’s液(g/L)：NaCl: 8, KCl: 0.4, KH2PO4: 0.06, Na2HPO42H2O: 0.06, NaHCO3: 0.35; 酚红：0.02，超纯水溶解，调节PH至7.2，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。

3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤，200μl或400μl/tube分装, -20度储存。母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma，P2636，100mg）。配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。用时加入49ml超纯水稀释为0.1mg/ml的工作液。

4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50μl/tube，-20℃保存。使用时需将终浓度调整为25μM（购自Sigma，G8415，100g，分子量：147.13）。配制方法：电子天平称量谷氨酸1.4713g，即0.01mol=10mmol，溶于200ml超纯水中，配制为50mM的谷氨酸母液。

例：500ml的Neurobasal Medium中加入Glutamate母液（50mM）250μl，此时终浓度约为25μM。

5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone，SH30042.01，100ml）。

6）阿糖胞苷（AraC）母液：10mM，(阿糖胞苷，1：1000稀释用)（购自Sigma，C1768，100mg，分子量：243.22）；配制方法：100mg/243.22≈0.41mM，加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。

AraC工作液：10μM（半量换液，终浓度5μM）；

7）DNAse I（）（购自ROCHE，，100mg，1mg=2000U，用dH2O配成10mg/ml 母液，过滤分装100μl/tube，每次使用50-100μl）

8）培养基

FBS

DMEM/F12：购自Hyclone，SH30023.01B，500ml

双抗：购自GIBCO，，100ml

Neurobasal Medium-A：购自GIBCO，(新生鼠)或（孕鼠），500ml

B27：购自GIBCO，17504-044，10ml

Glutamax-100X：购自GIBCO，3505061，100ml

①分离培养基：10%FBS+DMEM/F12+双抗

②培养用Start Medium：Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax-100X 5ml+ Glutamate 25μM

③换液用Culture Medium：Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax 100X 5ml

2. 耗材

1）EMS盖玻片：膜片钳和激光共聚焦检测试验时才需要使用。

2）各型枪头：10μl、100μl、1000μl、5ml

3）细胞培养皿：

4）细胞培养瓶：

5）离心管：

二、步骤

1. 手术器械消毒：直头眼科剪、直头、弯头显微镊各1把为一套器械，准备两套并分别置于50ml烧瓶中，70%酒精浸泡30min。

2. 动物：出生24小时内的SD大鼠（下称乳鼠）约10只；

3. 海马组织分离：

①培养皿2个，分别加入冰冻D-Hank’s液约5ml，至于冰盘上；

②取乳鼠，用左手拇指和食指固定乳鼠头部，酒精棉球皮肤消毒3遍，直头眼科剪酒精灯火焰消毒后（下同）剪开皮肤，换第二把直头眼科剪剪开颅骨，弯头显微镊向两侧牵拉开颅骨暴露乳鼠大脑，换第二把弯头显微镊由颅底部分离乳鼠大脑，然后置入冰冻的D-Hank’s液中。

③用直头显微镊固定乳鼠大脑，将两大脑半球分离后，用弯头显微镊分离脑干后，以直头显微镊固定并敞开皮质，最后用弯头显微镊由海马游离端仔细分离海马组织，并剔除血管及脑膜。

④将分离好的海马组织至于加有冰冻D-Hank’s液的青霉素瓶中，用直头眼科剪剪碎组织至约1mm3的小块，加入约5倍组织体积的0.25%胰蛋白酶37℃消化10min，加入分离培养基终止消化。

⑤机械吹打分散细胞，40μm筛网过滤，制成单细胞悬液，1000rpm室温离心6min，弃去上清液，加Starting medium，尖嘴吸管吹打分散细胞后，制成4×105个/ml 的单细胞悬液，接种在预先包被有多聚赖氨酸（PLL）的培养板内。

⑥在通以95%空气、5%CO2，37℃细胞培养箱中培养。接种72h后，加入含10μM 阿糖胞苷的Culture Medium作用48h，以抑制胶质细胞的过度增殖。之后每隔两天用Culture Medium换液，每次更换的量为原体积的1/2，培养12天后对神经元进行鉴定并用于实验。

换液举例：1月1日培养神经元，于1月4日用含AraC（10μM）的Culture Medium换液，AraC作用48小时后（1月6日）用Culture Medium换液，最后一次于1月9日换液。此为一般情况，视具体情况而定，应于换液前在显微镜下观察，看是否污染、胶质细胞多少、神经元状态，胶质细胞较多时可延长AraC 作用时间，污染和神经元状态不好应丢弃，若需延长培养时间可以加换一次液体。