病毒学研究的基本方法
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呼肠孤病毒能够抵抗pH 3.0；
口蹄疫病毒在pH 6.0～6.5及pH 8.0～ 9.0迅速灭活；
猪水泡病病毒在pH2.2条件下24h内仍 保持其感染性。
? 因此pH的稳定性，是鉴定某些病毒的一个 重要指标。
（三）辐射
? 电离辐射中的γ射线和X射线以及非电离辐 射紫外线，都对病毒呈现灭活作用。其原 因是它们可以破坏病毒核酸的分子结构， 使其失去生物活性。
? 对含病毒的组织材料可以直接低温冷冻保 存，如有些病毒可先浸入50％的甘油缓冲盐 水中，再行低温保存，效果更好。
? 2. 冷冻干燥 在真空条件下使冰冻病毒悬液 脱水（通常是冷冻真空干燥），可保存几 年甚至几十年，毒力不变。
? 毒种的保护剂：一般用脱脂牛乳、经灭活 的动物血清、饱和蔗糖溶液等。真空干燥 时，将病毒液加等量保护剂，每支装0.2～ 0.5ml，放入冻干机内冷冻。现代冻干机具 有冷冻、干燥、抽真空等全部装置，使用 十分方便。
（四）超声波和光动力作用
? 超声波主要以强烈振荡对细菌和其他微生 物以及细胞等呈现破坏作用，但对病毒的 灭活作用并不明显。常用超声波破坏细胞， 使病毒粒子从细胞内释放，以便收获和提 纯病毒。
? 有些病毒核酸被染料（如甲苯胺蓝、啶橙） 作用后，就能被可见光灭活，称为染料的 光动力作用。
（五）脂溶剂
? 病毒喜冷怕热。
? 大多数病毒可在4℃以下良好地生存，特别 是在干冰温度(-70℃)和液氮(-196℃)下更可 长期保持其感染性。
? 相反地，大多数病毒可在55～60℃条件下几 分钟到十几分钟内灭活，100℃可在几秒钟 内灭活。
? 因此必须低温保存病毒和疫苗等。
? 各种病毒对热的抵抗力不同，甚至有着明 显的差异。例如： 黏病毒和RNA肿瘤病毒等具有包膜的病 毒，感染半衰期为37℃ 1h 而痘病毒在干燥状态下，却可耐受100℃ 加热5～10min
2、实验动物的等级
普通级实验动物（conventional animals, CV） 清洁级实验动物（clean animals, CL）
无特定病原动物（specific pathogen-free animals, SPF） 无菌动物（germ-free animals, GF）
了解各种理化因素对病毒的灭活作用，有着 重要的实际意义。
? 由于不同病毒对各种理化因子的敏感性不 同，因此在消毒时必须针对该病毒特点， 选择最为有效的消毒剂。
? 相反，在保存毒种或病毒材料时，则必须 注意防止和避免各种灭活条件。
? 病毒对不同理化因素的抵抗力，也是鉴定 病毒的一个重要依据。
Fra Baidu bibliotek
（一）温度
三、病毒的分离培养
? 病毒与细菌不同，病毒是严格的活细胞内 寄生的，因此分离培养病毒应采用： 寄主(易感动）接种法 鸡胚培养法 细胞培养法
? 而且还必须根据不同病毒的要求进行选择， 才能得到满意的结果。
（一）寄主接种法 ? 分离的标本接种于实验寄主的种类和接种
途径主要取决于：
病毒寄主范围 组织嗜性 同时还应考虑操作、培养及结果判定的 简便
? 乙醚、氯仿和丙酮等脂溶剂对有包膜的病 毒具有灭活作用。
? 乙醚等灭活试验是鉴定病毒的一个重要指 标。
（六）甘油和抗生素
? 应用50％的甘油盐水，病毒可以存活数日， 甚至几年。生产实践中常用50％甘油盐水保 存病毒材料，同时采取冷藏措施，效果较 为理想；
? 一般的抗生素对病毒无作用，故常加入到 含有病毒的材料中去，以杀死细菌而有利 于病毒的分离与培养。
? 热对病毒的灭活作用，受周围环境因素的 影响。蛋白质以及钙、镁等离子的存在， 常可提高某些病毒对热的抵抗力。
长期保存病毒一般采用下述两种方法：
? 1. 快速低温冷冻 于病毒液中加入灭活的正 常动物血清或其他蛋白保护剂，最好再加 入5％～10％的二甲基亚砜，并迅速冷冻和 保存于-70℃～-196℃。
第三节 病毒学研究的基本方法
内容
一、理化因素对病毒的作用 二、标本的采集和处理 三、病毒的分离培养 四、病毒的鉴定 五、病毒定量的几个概念
一、理化因素对病毒的作用
理化因素包括热、辐射、pH和化学试剂等 对病毒的灭活作用，其作用的的结果是： ? 改变和破坏病毒核酸，使其失去转录和翻 译的功能； ? 或者是改变和破坏病毒蛋白衣壳或脂质等 结构，从而消除病毒的感染性。 ? 但是经灭活的病毒可继续保持其抗原性以 及诱导产生干扰素。
? 动物病毒标本可接种于敏感动物的特定部 位： 嗜神经病毒接种于动物脑内； 嗜呼吸道病毒接种于动物鼻腔；
? 常用动物有： 实验动物：小白鼠、大白鼠、地鼠、家
兔和猴子等。 本动物：
? 接种病毒后，隔离饲养，每日观察动物发 病情况，根据动物出现的症状，初步确定 是否有病毒增殖。
实验动物接种 1、实验动物培养病毒的优点和缺点
? 近年来，人们已发现一些抗生素对病毒有 作用，有的已用在病毒病的预防和治疗上， 如金刚铵、利福霉素、放线菌素D等。
二、标本的采集和处理
? 用于分离病毒的标本应含有足够量的活病 毒，因此必须根据病毒的生物学特性、病 毒感染的特征、流行病学规律以及机体的 免疫保护机制，来选择所需要采集标本的 种类、确定最适采集时间和标本处理的方 法。
（二）pH 值
? 大多数病毒在pH6～8的范围内保持稳定。 在pH5.0以下的酸性环境中，以及pH9.0以上 的碱性环境中，病毒大多迅速灭活。
? 酸、碱溶液是病毒学实践中常用的消毒剂。
? 贮存病毒，以中性或微碱性为宜，例如病 毒病料置中性的50％甘油盐水中保存。
? 但是必须指出，各种病毒对pH变化的稳定 性可能显著不同。例如：
? 标本采集必须无菌操作，如有细菌污染， 可通过加抗菌素、过滤和离心等方法处理。
? 由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经 处理后一般应立即接种。
? 若需要运送或保存，数小时内可置于50％中 性甘油内4℃保存，对需较长时间冻存的标 本最好置于-20℃以下或干冰保存。
? 以感染病毒的动物病料采集为例，一般说 来，应从病畜体内存在病毒最多的器官或 组织采取病料。例如上呼吸道疾病取鼻分 泌物，脑炎取脑组织，痘症取患部皮肤。 采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。 检查抗体时，则采取一个病畜的初期和恢 复期的血清，以了解抗体滴度的变化。
口蹄疫病毒在pH 6.0～6.5及pH 8.0～ 9.0迅速灭活；
猪水泡病病毒在pH2.2条件下24h内仍 保持其感染性。
? 因此pH的稳定性，是鉴定某些病毒的一个 重要指标。
（三）辐射
? 电离辐射中的γ射线和X射线以及非电离辐 射紫外线，都对病毒呈现灭活作用。其原 因是它们可以破坏病毒核酸的分子结构， 使其失去生物活性。
? 对含病毒的组织材料可以直接低温冷冻保 存，如有些病毒可先浸入50％的甘油缓冲盐 水中，再行低温保存，效果更好。
? 2. 冷冻干燥 在真空条件下使冰冻病毒悬液 脱水（通常是冷冻真空干燥），可保存几 年甚至几十年，毒力不变。
? 毒种的保护剂：一般用脱脂牛乳、经灭活 的动物血清、饱和蔗糖溶液等。真空干燥 时，将病毒液加等量保护剂，每支装0.2～ 0.5ml，放入冻干机内冷冻。现代冻干机具 有冷冻、干燥、抽真空等全部装置，使用 十分方便。
（四）超声波和光动力作用
? 超声波主要以强烈振荡对细菌和其他微生 物以及细胞等呈现破坏作用，但对病毒的 灭活作用并不明显。常用超声波破坏细胞， 使病毒粒子从细胞内释放，以便收获和提 纯病毒。
? 有些病毒核酸被染料（如甲苯胺蓝、啶橙） 作用后，就能被可见光灭活，称为染料的 光动力作用。
（五）脂溶剂
? 病毒喜冷怕热。
? 大多数病毒可在4℃以下良好地生存，特别 是在干冰温度(-70℃)和液氮(-196℃)下更可 长期保持其感染性。
? 相反地，大多数病毒可在55～60℃条件下几 分钟到十几分钟内灭活，100℃可在几秒钟 内灭活。
? 因此必须低温保存病毒和疫苗等。
? 各种病毒对热的抵抗力不同，甚至有着明 显的差异。例如： 黏病毒和RNA肿瘤病毒等具有包膜的病 毒，感染半衰期为37℃ 1h 而痘病毒在干燥状态下，却可耐受100℃ 加热5～10min
2、实验动物的等级
普通级实验动物（conventional animals, CV） 清洁级实验动物（clean animals, CL）
无特定病原动物（specific pathogen-free animals, SPF） 无菌动物（germ-free animals, GF）
了解各种理化因素对病毒的灭活作用，有着 重要的实际意义。
? 由于不同病毒对各种理化因子的敏感性不 同，因此在消毒时必须针对该病毒特点， 选择最为有效的消毒剂。
? 相反，在保存毒种或病毒材料时，则必须 注意防止和避免各种灭活条件。
? 病毒对不同理化因素的抵抗力，也是鉴定 病毒的一个重要依据。
Fra Baidu bibliotek
（一）温度
三、病毒的分离培养
? 病毒与细菌不同，病毒是严格的活细胞内 寄生的，因此分离培养病毒应采用： 寄主(易感动）接种法 鸡胚培养法 细胞培养法
? 而且还必须根据不同病毒的要求进行选择， 才能得到满意的结果。
（一）寄主接种法 ? 分离的标本接种于实验寄主的种类和接种
途径主要取决于：
病毒寄主范围 组织嗜性 同时还应考虑操作、培养及结果判定的 简便
? 乙醚、氯仿和丙酮等脂溶剂对有包膜的病 毒具有灭活作用。
? 乙醚等灭活试验是鉴定病毒的一个重要指 标。
（六）甘油和抗生素
? 应用50％的甘油盐水，病毒可以存活数日， 甚至几年。生产实践中常用50％甘油盐水保 存病毒材料，同时采取冷藏措施，效果较 为理想；
? 一般的抗生素对病毒无作用，故常加入到 含有病毒的材料中去，以杀死细菌而有利 于病毒的分离与培养。
? 热对病毒的灭活作用，受周围环境因素的 影响。蛋白质以及钙、镁等离子的存在， 常可提高某些病毒对热的抵抗力。
长期保存病毒一般采用下述两种方法：
? 1. 快速低温冷冻 于病毒液中加入灭活的正 常动物血清或其他蛋白保护剂，最好再加 入5％～10％的二甲基亚砜，并迅速冷冻和 保存于-70℃～-196℃。
第三节 病毒学研究的基本方法
内容
一、理化因素对病毒的作用 二、标本的采集和处理 三、病毒的分离培养 四、病毒的鉴定 五、病毒定量的几个概念
一、理化因素对病毒的作用
理化因素包括热、辐射、pH和化学试剂等 对病毒的灭活作用，其作用的的结果是： ? 改变和破坏病毒核酸，使其失去转录和翻 译的功能； ? 或者是改变和破坏病毒蛋白衣壳或脂质等 结构，从而消除病毒的感染性。 ? 但是经灭活的病毒可继续保持其抗原性以 及诱导产生干扰素。
? 动物病毒标本可接种于敏感动物的特定部 位： 嗜神经病毒接种于动物脑内； 嗜呼吸道病毒接种于动物鼻腔；
? 常用动物有： 实验动物：小白鼠、大白鼠、地鼠、家
兔和猴子等。 本动物：
? 接种病毒后，隔离饲养，每日观察动物发 病情况，根据动物出现的症状，初步确定 是否有病毒增殖。
实验动物接种 1、实验动物培养病毒的优点和缺点
? 近年来，人们已发现一些抗生素对病毒有 作用，有的已用在病毒病的预防和治疗上， 如金刚铵、利福霉素、放线菌素D等。
二、标本的采集和处理
? 用于分离病毒的标本应含有足够量的活病 毒，因此必须根据病毒的生物学特性、病 毒感染的特征、流行病学规律以及机体的 免疫保护机制，来选择所需要采集标本的 种类、确定最适采集时间和标本处理的方 法。
（二）pH 值
? 大多数病毒在pH6～8的范围内保持稳定。 在pH5.0以下的酸性环境中，以及pH9.0以上 的碱性环境中，病毒大多迅速灭活。
? 酸、碱溶液是病毒学实践中常用的消毒剂。
? 贮存病毒，以中性或微碱性为宜，例如病 毒病料置中性的50％甘油盐水中保存。
? 但是必须指出，各种病毒对pH变化的稳定 性可能显著不同。例如：
? 标本采集必须无菌操作，如有细菌污染， 可通过加抗菌素、过滤和离心等方法处理。
? 由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经 处理后一般应立即接种。
? 若需要运送或保存，数小时内可置于50％中 性甘油内4℃保存，对需较长时间冻存的标 本最好置于-20℃以下或干冰保存。
? 以感染病毒的动物病料采集为例，一般说 来，应从病畜体内存在病毒最多的器官或 组织采取病料。例如上呼吸道疾病取鼻分 泌物，脑炎取脑组织，痘症取患部皮肤。 采集病料的时间，以症状刚出现时为佳。 检查抗体时，则采取一个病畜的初期和恢 复期的血清，以了解抗体滴度的变化。