细胞凋亡的研究方法实验

细胞凋亡

同学们好，这一讲开始我们来学习细胞凋亡的检测方法。

细胞死亡的方式有很多种，最常见的有坏死（necrosis），它是细胞受到物理或化学损伤的情况下，以及缺氧时会发生的现象，另一种常见的死亡方式是细胞凋亡（apoptosis），又称细胞程序性死亡，它是细胞主动的有序的死亡过程，用来去除多余的，不需要的或异常的细胞，保障生物体内环境的稳定，是一种基本的生物学现象。其他死亡方式还有自噬性细胞死亡（autophagic cell death）和细胞焦亡（Pyroptosis）。随着生命科学的发展，这些死亡方式逐渐进入我们的视野，被关注。

不同的死亡方式有着各自的特征。比如坏死，从形态学上观察，胞体肿胀、胞质空泡化，胞膜破损、最后崩解，所以坏死又称细胞胀亡（Oncosis）。而细胞凋亡，胞体缩小，膜表面出芽状形成凋亡小体，最终从细胞表面脱落，膜基本保持完整、。

细胞凋亡研究有着非常重要的生理和病理意义，2002年诺贝尔生理学或医学奖就授予了细胞程序性死亡方面的研究工作。细胞凋亡参与机体的正常发育与分化、内环境的稳定、免疫系统防御等重要的生理过程，一旦凋亡异常就会导致一些重大疾病的发生与发展，比如肿瘤的发生，肿瘤早期阶段细胞凋亡都是受到抑制的，诱导肿瘤细胞凋亡已成为抗肿瘤药物研发的一个重要方向。

近年来，许多细胞凋亡检测方法得到广泛的应用。下面介绍四种近年来细胞凋亡的主要检测方法：

一、形态学观察

细胞发生凋亡时会出现一系列独特的形态学特征，如细胞体积变小;核固缩，染色质高度凝聚，且堆积在核膜内侧缘或聚集于核中央部;接着凋亡小体的产生，细胞膜皱褶、细胞表面产生了许多泡状或芽状突起，形成单个的凋亡小体。借用光学显微镜、电子显微镜或荧光显微镜可不同程度、不同层次地观测到这些形态学特征。这种细胞凋亡形态学检测的方法简易、直观和有较好定位，但也有不足之处:缺乏特定标准，主观性大，因人而异;又不能定量，有较大的局限性，因而形态学观察多用于固定组织细胞检测，常作为其他技术的辅助。

二、流式细胞术

流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是一种对液相中分散着的细胞进行定性、定量分析与分选的设备，具有分析速度快、敏感性好，和精确度高的特点，能够对于不同细胞发生凋亡进度不同的过程，进行准确检测。当待检测的细胞随着液流系统经过探测点，检测到的前向散射光强度代表了细胞的大小，而侧向散射光反应细胞内颗粒的复杂程度。细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞的前向散射光降低，侧向散射光增高;而坏死细胞的前向散射光和侧向散射光同时增高。因此，可区分正常、坏死和凋亡细胞。FCM可以配合荧光染料进行多参数测定，凋亡检测中常用的是AnnexinV-FITC/PI双荧光标记，能够进行早、中期凋亡阶段凋亡率的测定。

三、细胞凋亡的DNA片段检测

DNA断裂是细胞凋亡最显著的生物化学特点，细胞凋亡时，核酸内切酶与相关蛋白水解酶被激活，将DNA降解，形成长度为180～200bp或其整倍数的

DNA片段。正常生长时，活细胞DNA不断裂。通过琼脂糖凝胶电泳可观察DNA片段来检测细胞凋亡。正常细胞染色质DNA为一条大分子条带；坏死细胞的DNA随机断裂，凝胶电泳表现为弥漫连续模糊的条带;而凋亡细胞的凝胶电泳一般形成等腰梯形条带，这是凋亡具有代表性的重要的生化结果。此法操作简单，定性准确，不能定量。

四、TUNEL

原位末端标记法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)，它的检测原理是：细胞凋亡时，DNA断链会出现3'-OH，借助末端脱氧核苷酸转移酶，，可直接催化3'端的核酸聚合反应，将带有标记的游离核苷酸从3'-OH末端连接到断片上，可显示出含有断裂DNA的细胞，用于细胞凋亡的鉴定。正常细胞或增殖细胞几乎没有DNA的断裂，没有3'-OH形成不会染色。原位末端标记法能对凋亡细胞或凋亡小体进行原位检测，并且能够检测出少量凋亡细胞，适用于冰冻切片、石蜡包埋组织切片，敏感性高、使其成为细胞凋亡检测的又一个热门方法。

细胞凋亡是一个步骤繁多的过程，在基础实验以及临床诊断中，细胞凋亡的检测占有非常重要的地位，每种方法均有其各自的优缺点，在实际应用中，应针对不同凋亡阶段的细胞采用多种检测方法相结合，这样才可以观察到实验细胞真实准确的凋亡结果，得出准确的结论。

今天针对细胞凋亡检测方法的介绍就先谈到这里，再见。