宏基因组实验计划
宏基因组项目报告
宏基因组项目报告一、引言宏基因组研究是一种利用高通量测序技术对不同环境中微生物的DNA进行直接测序，从而获得未经培养的微生物群落的全基因组信息的研究方法。
宏基因组项目旨在揭示细菌、真菌等微生物群落的复杂性和多样性，以及它们在各种环境中的功能特征，为人类提供更多关于微生物界的了解和应用。
二、项目设计本次宏基因组项目选择了一个自然河流水样品和一个土壤样品作为研究对象，采用Illumina HiSeq平台进行测序。
首先，对样品进行DNA提取，并进行多次PCR扩增，得到足够的片段数目进行测序。
然后，对测序得到的片段进行质量控制和去除低质量序列、接头序列和宿主DNA。
之后，使用比对软件将高质量测序读序比对到相关数据库，如NR、Kegg等，分析序列的生物学功能、多样性等。
三、结果分析1.宏基因组的物种多样性分析通过序列比对和分类，我们发现水样品中含有大量的细菌，真菌和病毒等微生物，其中以细菌为主要成分。
而土壤样品中细菌的数量明显高于真菌和病毒。
此外，从解析结果中，我们还发现了一些未知物种，这些物种可能是新的微生物，为我们探索未知微生物的多样性提供了线索。
2.宏基因组的功能分析通过对序列的注释和比对，我们可以了解微生物群落的功能特征。
我们利用Kegg数据库进行宏基因组的功能注释和代谢通路分析，发现了许多参与碳、氮、磷循环等重要代谢通路的微生物，并对其基因编码产物进行分析和功能预测。
此外，我们还发现了一些与环境适应性和生存竞争力相关的基因。
3.宏基因组的群落结构分析通过对序列的分析，我们还可以了解微生物群落的结构特征。
我们使用OTU(Operational Taxonomic Unit)对宏基因组的群落结构进行了描述和分析，发现了丰度较高的菌群，并推断其在不同环境中的生态角色和相互之间的相互作用。
此外，通过构建菌群之间的共生和拮抗网络，我们可以了解不同微生物之间的互动关系，从而进一步探究宏基因组在生态系统中的功能和影响。
宏基因组学技术实验流程
宏基因组学技术实验流程
宏基因组学技术是将一个物种的细胞基因组测序后，利用生物信息学方法从测序结果中揭示细胞基因组结构、功能结构及动态变异的重要技术。
宏基因组学技术为广大生物学家开辟了一条全新的活跃的研究道路，丰富了多学科间的联系，有助于深入了解我们不同物种及地理环境间的关系。
宏基因组学技术实验流程主要包括以下几步：第一步，准备实验样本，利用细胞培养或蛋白质学实验制备实验样本；第二步，实行基因组测序，采用高通量测序技术进行基因组测序；第三步，数据分析，对测序结果进行深度分析，使用生物信息学工具分析表达水平、进化变异等；第四步，科学解释，将所得结果进行深入的科学解释，结合生物学原理和其它实验结果，揭示整个分析问题的本质和规律。
宏基因组学技术可广泛应用于多学科之间，特别是对大规模基因组技术的累积分析，能够更准确而精确地确定不同物种或地理环境间的变异和关联，为生物财主类的比较和研究提供了高学术价值的分子标记和高拆分率的研究方法，在现代生命科学研究过程中发挥着重要作用。
中国高校和高等教育机构在推广运用宏基因组学技术研究中可以充分发挥学术积极性和多学科跨界思维的特点，为进一步开拓和拓展现代生命科学研究打下坚实的基础。
宏基因组文库构建
宏基因组文库构建宏基因组文库构建分子微生物生态学的研究业已证明环境中大量存在未能培养的微生物，某些环境中采用现有培养技术能够培养的微生物不到1%，超过99%的微生物尚未能培养(1)，可见基于微生物分离培养的技术途径开发利用微生物资源受到了极大的限制。
为了突破上述限制，充分挖掘和利用微生物的多样性基因资源，人们在寻找新技术方法上倾注了极大的热情。
“宏基因组（Metagenome）”是由Handelsman等1998年提出的新名词，其定义为“the genomes of the total microbiota found in nature”，即生境中全部微小生物遗传物质的总和，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和（2 ）。
宏基因组文库既包含了可培养的又包含了未能培养的微生物基因，避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间。
目前已采用土壤、海水、海洋浮游生物、海棉、甲虫、人唾液等环境样品成功构建了宏基因组文库，已筛选到的生物活性物质有各种酶类及一些次生代谢产物，包括脂酶/酯酶、蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、几丁质酶、核酸酶、膜蛋白、4-羟基丁酸代谢酶系、生物素合成酶系、色素、抗菌抗肿瘤活性物质及抗生素抗性基因等（3、4、5）。
一、实验原理1、基本原理从环境样品中直接提取总DNA，经纯化后部分酶切，然后把这些DNA片段连接到载体上，转化替代宿主细胞，形成一个重组DNA文库即宏基因组文库。
获得的克隆子根据宿主细胞获得的新功能进行筛选, 或用相关已知序列设计探针或PCR引物寻找并分离目的基因片段，加上表达调控元件后使目的基因表达，从而获得产物。
2、载体促使宏基因或基因簇在重组克隆子中表达或提高表达量，载体起着重要作用。
载体的选择主要是针对有利于感兴趣的目标产物基因的表达、目标基因的扩增及在筛选细胞毒类物质时表达量的调控等。
1）大片段插入载体由于很多微生物活性物质是其次生代谢产物，代谢途径由多基因簇调控，尽量插入大片段DNA以获得完整的代谢途径多基因簇是很有必要的。
(完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序目的研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。
技术简介宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。
宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。
是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。
它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。
而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序技术检测标准简介：宏基因组测序介绍宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。
随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。
高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。
可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。
目前又可以分为针对16sDNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。
下面就是对这两者的具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA 测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。
目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。
因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。
二、宏基因组全测序在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。
这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。
可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。
此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。
样品处理：宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。
样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。
尽量留足备份样品。
核酸提取：宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。
对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。
宏基因组-PPT
Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Escherchia coli Saccharomyces
2.环境保护和污染修复
挖掘降解基因和功能菌株，进行生物修复 获取任何序列的基因或功能，由此合成新物质或发 现新的生物物种。 发掘极端环境为生物的新物种，了解其耐受机制， 帮助极端环境的污染修复。 从宏基因组中分离的重要基因元件组编成具有其他 活性成分、或可降解污染物功能的基因簇，以替代 原有不易降解化合物，或直接降解环境中石油烃、 有害有害化合物、重金属。
（1）基于序列的筛选方法
②.焦磷酸测序( Pyrosequencing)
焦磷酸测序技术是在焦磷酸盐测序法的基础 上结合一种乳胶材料和皮升级反应孔，将基因组 DNA 进行随机切割，批量地进行整个测序反应， 能够在相同的时间内破译 6×106组以上的基因组 序列，比 Sanger法要快100倍，提高了测序的效 率。
底物诱导基因 表达法SIGEX screening
1.样品中DNA的提取和富集
采用合适的方法，既要尽可能地完全抽提出 环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以 获得完整的目的基因或基因簇。所以提取原 则是在最大提取量和最小剪切力之间折中 常用的提取方法有直接裂解法和间接提取法 (细胞提取法)
3.开拓天然产物新资源
2000年8月, Brady和 Clardy等人构建了一 个含有约7000000个5个, 并从 其中一个克隆发酵物 中分离出一系列具有 抗菌活性的长链N2酰 基酪氨酸类新化合物 1213
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案
病原宏基因组测序实验方案是一种用于研究病原微生物群落内基因组的技术方法。
它通过测序病原体样本中的DNA或RNA，生成大量的测序数据，并利用生物信息学分析方法来解析样本中存在的病原体群落。
该实验方案的实施步骤如下：
1. 样品采集与制备：首先，需要从疾病患者或环境中收集病原体样品。
样品可
以是血液、组织、粪便等。
接下来，需要对样品进行处理，包括提取DNA或RNA，并进行质量检测。
2. 文库构建：经过样品制备后，将提取得到的DNA或RNA进行文库构建。
这一步骤包括DNA片段化、连接测序引物、PCR扩增等。
构建好的文库将被用于下
一步的测序。
3. 测序：使用高通量测序技术，如Illumina测序平台，对构建好的文库进行测序。
该步骤将产生数百万条短读长序列，形成所谓的测序数据。
4. 数据分析：测序完成后，需要对产生的测序数据进行生物信息学分析。
这一
步骤包括序列拼接、质控、去除人类宿主序列、物种注释等。
通过这些分析方法，可以得到病原体群落的基因组组成和功能特征。
5. 结果解释和研究：最后，根据数据分析结果，可以解释病原体群落的组成和
特征。
这对于研究病原体的致病机制、药物抗性等具有重要意义。
病原宏基因组测序实验方案为研究者提供了一种全面了解病原体群落结构和功
能的方法。
它可以用于研究不同疾病的病原微生物组成，探究其与疾病发生发展的关系，并为疾病的预防、诊断和治疗提供重要依据。
同时，这一技术方法也有助于了解病原体的毒力机制、耐药性乃至新病原体的发现。
宏基因组
Transform methods transduction transduction transduction
transformation transformation
宏基因组（广义）
广义宏基因组是指特定环境下所有生物 所有生物 遗传物质的总和，它决定了生物群体的 生命现象。它是以生态环境中全部DNA 作为研究对象，通过克隆、异源表达来 筛选有用基因及其产物，研究其功能和 彼此之间的关系和相互作用，并揭示其 规律的一门科学
宏基因组（狭义）
狭义宏基因组学则以生态环境中全部细 全部细 菌和真菌基因组DNA作为研究对象，它 菌和真菌 不是采用传统的培养微生物的基因组， 包含了可培养和还不能培养的微生物的 基因，通过克隆、异源表达来筛选有用 基因及其产物，研究其功能和彼此之间 的关系和相互作用，并揭示其规律
底物诱导基因表达筛选 (substrate-induced gene-expression screening，SIGEX) 缺点： 缺点：
目标基因的结构性和适应性很敏感， 无法用于分析不能进入细胞质的底物， FACS对进样设备的要求也比较高； 代谢特定底物的调控子和操纵子在位置上不一定都 相邻； 有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他 因子的诱导， 有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的， 有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表 达
λphage
Cosmid,fosmid
24 35~45 70~100 120~300 100~300
linear circular circular circular circular linear
宏基因组分析方案_微基生物
宏基因组分析教程
PCoA图
7. 差异分析-LefSe分析
LDA Effect Size(LEfSe分析)：LEfSe采用线 性判别分析 (LDA) 来估算每个组分(物种)丰度对差 异效果影响的大小，找出对样品划分产生显著性差 异影响的群落或物种。LEfSe分析强调统计意义和 生物相关性。
1. 将物种丰度表按照分级顺序重新生成表格， 如图1；
2. 使用LefSe软件根据LDA值筛选出差异物 种，如图2；
3. 以树图的形式展示分组间差异物种信息， 如图3，黄色代表此水平物种没有差异，不同颜色 代表相应分组的此水平物种是差异物种。
图1 LefSe输入文件
图2 LDA图
图3 cladogram图
8. 相关性分析
使用物种/功能/基因丰度表结 合其他特征值（质量性状或者数量性 状）进行相关性分析，得到物种、基 因、功能以及其他特征值之间的相关 性。
2. 箭头长度越长，代表其对研 究对象分布的影响越大；
3. 研究对象对箭头的夹角代表 其与环境因子的相关性，锐角：正相 关；钝角：负相关；直角：无相关；
4. 研究对象与箭头的垂直距离 代表环境因子对此研究对象的影响力。 距离越近，影响越大。
RDA图
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CARD(the Comprehensive Antibiotic Research Database) 其 核心是 ARO(Antibiotic Resistance Ontology)， ARO 包含了与抗生素抗性基因，抗性机制等。 CARD 数据库不仅包含了 ARDB 数据库中所有抗性信息，并搭建了一个基于志 愿者贡献的数据共享平台，做到了实时更新保证了数据的有效性。目前，CARD 数据库收集了超过 1600个已知的抗生素抗性 基因。
宏基因组项目报告
细菌宏基因组分类测序项目总结报告目录1.名词解释 (4)2.本项目使用软件与数据库： (6)2.1 软件： (6)2.2 数据库 (6)3.实验流程简介 (7)4.分析流程 (7)5.项目分析内容 (8)6.流程说明 (8)7.分析结果展示 (9)7.1 数据预处理 (9)7.1.1 方法说明 (10)7.1.2 结果展示 (11)7.2 去除嵌合体及靶区域外序列 (13)7.2.1 方法说明 (13)7.2.2 结果展示 (13)7.3 操作分类单元(OTU)分类 (14)7.3.1 方法说明 (14)7.3.2 结果展示 (14)7.4 赋予物种分类单元 (17)7.4.1 方法说明 (17)7.4.2 结果展示 (18)7.5 Alpha多样性分析 (26)7.5.1 方法说明 (27)7.5.2 结果展示 (28)7.6 Beta多样性分析 (34)7.6.1 方法说明 (34)7.6.2 结果展示 (35)7.7 样本间菌群丰度差异分析 (39)7.7.1 方法说明 (40)7.7.2 结果展示 (40)7.8 PTCA/POCA分析 (40)7.8.1 方法说明 (40)7.8.2 结果展示 (40)7.9 RDA/CCA分析 (41)7.9.1 方法说明 (42)7.9.2 结果展示 (42)7.10 进化树分析 (48)7.10.1 方法说明 (48)7.10.2 结果展示 (48)7.11 MEGAN分析 (50)7.11.1 方法说明 (50)7.11.2 结果展示 (50)8.结果说明 (52)9.参考文献 (57)1.名词解释Bp:base-pair，碱基对，读长的单位，每一个bp指一对互补的碱基。
Read：读长，测序数据中每一条序列就是一个read。
Raw_reads: 原始数据Clean_reads：QC之后的数据Barcode：标签序列，位于reads的开头，用于区分这一条reads属于哪一个样本。
宏基因组测序技术检测方法
宏基因组测序技术检测方法宏基因组测序（metagenomics sequencing）是一种用于研究微生物群落组成和功能的技术。
它通过对环境样本中的DNA进行高通量测序，可以获取到微生物群落的整个基因组信息，包括群落中各种微生物的组成、丰度以及功能特征。
首先是样品采集。
宏基因组测序可以应用于各种环境样品，包括土壤、水体、肠道、皮肤等。
样品采集时需要注意避免污染，并选择适当的采集方法和样品保存条件，以确保得到代表性的样品。
其次是DNA提取。
由于微生物在环境中通常以微量存在，所以需要进行DNA提取以获取足够的DNA样本。
提取方法通常使用商业化的DNA提取试剂盒，其原理大致相同：首先破解细胞壁和细胞膜，释放DNA，并经过一系列的沉淀和洗涤步骤，最终得到纯化的DNA。
然后是测序。
宏基因组测序技术常用的测序平台包括Illumina HiSeq，PacBio SMRT和Oxford Nanopore等。
其中Illumina HiSeq平台是目前最为广泛应用的测序平台。
测序时将建好的文库片段与测序芯片上的测序引物配对，通过不同的测序方法（如合成DNA链延伸和荧光信号检测等）获取DNA片段的序列信息。
最后是数据分析。
宏基因组测序所得到的海量数据需要进行生物信息学分析，以解读数据中的信息。
数据分析包括序列质量控制、去除主机DNA、去除低质量序列、进行序列拼接和比对、物种分类和功能注释等。
其中物种分类可以使用16S或18SrRNA基因序列进行，功能注释可以使用基因数据库进行。
通过这些分析，可以获取样品中各种微生物的组成和丰度，并了解其功能特征。
总结来说，宏基因组测序技术的检测方法包括样品采集、DNA提取、建库、测序和数据分析等几个重要步骤。
这些步骤通常需要借助一系列的实验方法和设备来完成。
宏基因组测序技术的快速发展，为我们深入了解微生物群落提供了有力的工具，也为环境保护、农业生产、医学研究等领域提供了更加准确、细致的数据支持。
宏基因组实验流程
宏基因组实验流程一、样本采集。
这宏基因组实验，第一步就是样本采集啦。
这采集样本就像去寻宝一样，要特别小心谨慎。
咱得根据研究目的来选择采集的样本类型哦。
比如说，如果想研究土壤里的微生物群落，那就要去合适的地方挖土。
这个地方可不能随便选，要考虑土壤的类型、周围的环境之类的。
要是研究人体肠道微生物呢，那就得找志愿者啦，用专门的采样工具从肠道里采集样本。
采集的时候一定要保证样本的质量，就像挑水果一样，得挑那种新鲜又能代表整体情况的。
要是样本采得不好，后面的实验可就全白搭喽。
二、样本处理。
样本采好后就进入处理阶段啦。
对于土壤样本，里面可能有很多杂质，像小石子啊、植物残渣啥的。
这时候就得想办法把这些杂质去掉，不然会干扰实验结果。
就像淘米一样，把脏东西淘出去，只留下咱们想要的东西。
对于生物样本，可能还需要进行一些特殊的处理，比如说破碎细胞，把细胞里的DNA释放出来。
这就像是打开宝藏的盒子，把里面的宝贝拿出来一样。
不过这个过程要很轻柔，不能把DNA弄坏啦，DNA 可是很脆弱的呢，就像小玻璃球一样，一不小心就碎了。
三、DNA提取。
接下来就是DNA提取啦。
这可是个关键步骤哦。
有好多方法可以提取DNA呢，就像有好多条路都能到达目的地一样。
但是不管用哪种方法，目的都是要得到高质量、高纯度的DNA。
提取出来的DNA要足够多，这样才能满足后面实验的需求。
而且要保证没有其他杂质，要是有杂质混在里面，就像在白米饭里混进了沙子，那可不行。
这个过程就像是从矿石里提炼黄金一样，要把最纯的DNA提炼出来。
四、宏基因组文库构建。
有了DNA之后，就要构建宏基因组文库啦。
这就像是给DNA建一个小房子，让它们都住进去。
在这个过程中，要把DNA进行一些加工，比如说把它切成合适的片段，然后再把这些片段连接到一些载体上。
这个载体就像一辆小车子，带着DNA片段到处跑。
构建文库的时候要特别注意各个环节的准确性，要是哪个地方出了错，就像搭积木搭歪了一样，整个文库可能就构建不好了。
宏基因组测序
宏基因组测序1宏基因组研究概况宏基因组学（Metagenomics，又称元基因组学）这一概念最早在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出，随后伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter将宏基因组定义为：应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株的科学。
鉴于环境中99%的微生物不可培养，宏基因组无需进行微生物分离操作的技术特点打破了传统微生物学基于纯培养研究的限制，为充分认识全球和人体范围内微生物和开发利用未培养微生物，并从完整的群落水平上研究微生物的活动和发掘潜在功能提供了可能。
传统的宏基因组学研究通过直接从环境样本中提取DNA，构建DNA克隆载体的宏基因组文库，并利用基于核酸序列差异分析、克隆子的特殊代谢活性、底物诱导基因的表达和（或）稳定同位素和荧光原位杂交等技术对宏基因组文库进行筛选和分析，从而有效地利用环境中丰富的微生物资源和挖掘新的特殊功能代谢物。
在宏基因组学研究的发展前沿中，核酸测序技术测序速度和通量的增长引人注目。
在下一代测序技术（NGS，又称第二代高通量测序技术）出现之前，基于宏基因组测序的核酸序列差异分析通常使用Sanger测序（主要基于双脱氧核苷酸链终止反应）方法，对宏基因组克隆文库或功能扩增子进行测序，来研究环境中微生物群落多样性及功能特征。
但Sanger测序方法通量较小、测序周期较长且价格昂贵。
随着新一代测序技术的迅猛发展以及广泛应用，宏基因组测序的方法也发生了翻天覆地的变化，目前科学家们可以对环境中的微生物全部基因组进行测序，在获得海量的数据后，全面地分析微生物群落结构以及基因功能组成，了解微生物如何耐受极端环境，发觉新的生物资源并探索微生物与环境间的相互作用。
下一代测序方法使用了几种不同的高通量平台，最先使用的是基于焦磷酸聚合酶乳液的RocheGS20 454测序仪（又称焦磷酸测序仪）。
小鼠肠道微生物宏基因组分析流程
揭开老鼠小肠微生物的秘密本身就是一场冒险！所有这一切都从收集一些老鼠的便便开始（是的，你读的对），开始到提取微生物DNA
的微弱。
我们用特别的药包将DNA从粪便样本中分离出来一旦我们得到了DNA，我们把它通过一些质量检查，以确保它为下一阶段——测序。
然后我们潜入一个激动人心的世界，准备DNA库，我们
把它分解成碎片，添加一些测序适配器，用一点PCR动作来推动它。
同样的，我们的DNA库都准备开始下一个冒险——在一个超级高科技的下一代评台上进行排序。
这就像发送我们的DNA库关闭一个令
人兴奋的滚球车的发现！
一旦测序完成，我们就会清理原始数据，以清除任何像低质量读取和
适配器序列这样的垃圾。
然后我们仔细看看好东西找出肠道里挂着的细菌我们还试图找出这些细菌可能做的什么工作比如破坏食物或制造维生素这可以让我们更好地了解肠道是如何运作的，以及它对我们
的健康会有什么影响。
对小鼠肠道微生物元素进行综合分析时遵循了一个结构化的工作流程，该流程通过样本收集、DNA提取、测序和生物法分析。
这一方法对于确定肠道微生物的准确位置和功能潜力至关重要，这反过来又为调查
微生物对健康和疾病的影响提供了宝贵的见解。
通过深入了解肠道微
生物的遗传位置，研究人员可以发现其对宿主新陈代谢，免疫功能和
整体福祉的影响。
这种办法符合战略方向和政策框架，以推动我们了
解微生物与宿主生理学之间的复杂关系，从而为公共卫生和生物医学研究方面的循证决策提供信息。
宏基因组的测定流程
宏基因组的测定流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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宏基因组分析流程
宏基因组分析流程宏基因组分析是一种用来研究微生物群落的方法，它通过对微生物群落的DNA进行测序，以及后续的数据处理和分析，来了解微生物群落的组成和功能。
宏基因组分析流程一般包括以下几个步骤：采样、DNA提取、测序、数据预处理、生物信息学分析和结果解读等。
首先，采样是宏基因组分析的第一步。
采样要注意代表性，可以选择不同环境样品来进行比较和研究。
例如，可以采集不同土壤样品、水样、肠道样品等，以获得不同地理位置、不同物种群落和不同物理化学环境下的微生物样品。
第二步是DNA提取，它是宏基因组分析的基础步骤。
DNA提取是从采样物中提取出微生物DNA的过程。
由于微生物的特点是数量少，与宿主DNA、细胞碎片等杂质混合，所以DNA提取的方法要注意高效、纯度高，并且能够获得足够的DNA浓度。
第三步是测序。
测序是宏基因组分析的关键步骤。
常用的宏基因组测序方法有Illumina HiSeq和MiSeq等，也有传统的Sanger测序方法。
Illumina HiSeq和MiSeq等高通量测序技术能够产生大量高质量的短序列片段，对于宏基因组分析来说是非常有效和经济的方法。
第四步是数据预处理。
宏基因组测序产生的数据量非常大，需要进行数据预处理和质量控制，以去除噪声和低质量的序列片段。
这一步包括质量过滤、去除接头、去除低质量片段和短片段等。
数据预处理还包括序列拼接，将多个片段拼接成更长的序列以得到更好的基因组组装。
第五步是生物信息学分析。
生物信息学分析包括序列比对、基因组组装、物种注释、功能注释等。
序列比对是将测序后的序列片段与参考基因组比对，以确定片段的起源。
基因组组装是将拼接后的序列片段组装成完整的基因组。
物种注释是将基因组中的序列与已知的物种进行比对，以确定微生物群落的组成。
功能注释是将基因组中的序列与已知的功能数据库比对，以确定微生物群落的功能。
最后一步是结果解读。
根据宏基因组分析的结果，可以了解微生物群落的组成和功能。
宏基因组测序及分析
研究思路
瘘管奶牛牛
将柳枝稷样品置于牛牛的瘤胃中培 养72小小时，然后对附着在柳枝稷 样品上的所有微生生物进行行基因组 分析。
Illumina GAIIx ＋Illumina HiSeq2000 测序建库：200,300,3k,5k 双端测序：2*125、2*200、2*75
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研究结果
总共识别了27,755 与碳水水化合水水物绑定模块或具有催化功能的候选基因
物种组成16s18sits10代谢通路分析物信息分析三基因功能分析11cog注释cazyme注释物信息分析三基因功能分析12物信息分析四个性化分析基于筛选因对样品进聚类分析13什么是宏基因组研究宏基因组研究的分析流程宏基因组研究的相关应用14研究案例science
迪康金金诺NGS应用用交流会
宏基因组研究在肠道微生生物中的最新研究应用用
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研究案例（三）
Gut：运动可能增加肠道菌群多样性 背景：研究表明，肠道菌群多样 性的减少与肥胖及其他健康问题 相关，而而肠道菌群多样性的增加 则有利于新陈代谢和免疫。
运动可能对肠道菌群的多样性产 生生有益影响。
Clarke, S.F., et al., Exercise and associated dietary extremes impact on gut microbial diversity. Gut, 2014.
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研究思路
平均身身体质量指数（BMI），用用于衡量体重指标，运动员组被试的平均身身体质 量指数（BMI）是29.1
样本收集：
40名专业橄榄球运动员；此外还有23名是正常BMI组（BMI≤25），23名 则属于高高BMI组（BMI≥28）46个样本作为对照组。(肠道样本和血血液样本)
微生物宏基因组测序
35～75个自然日
案例解析
［案例一］ 婴儿肠道微生物宏基因组[1]
肠道微生物对人体至关重要，本文采用宏基因组测序技术对98个瑞典产 妇的粪便及婴儿的粪便进行分析，研究出生一年内肠道的微生物，评估 分娩方式和喂养方式对肠道菌群建立的影响。与顺产婴儿的肠道微生物 相比，剖腹产婴儿肠道微生物与母亲相似性明显降低。营养对肠道微生 态的组成和功能有重要影响，促使婴儿肠道微生物向成人肠道微生物群 转变的主要驱动力量并不是开始喂食固体食物，而是停止母乳喂养。微 生物群落组成和生态网络在不同样本阶段具有明显差异，与微生物功能 成熟度相关。
Occurrence frequency（n＝15）
图1 不同生产方式及不同年龄阶段肠道菌群的差异
［案例二］ 全的主要推动力，但对它们的功能多样性、微 生物种群结构以及生态因素进行总体分析还存在很大的挑战。本研究采 集全球海洋68个位点的上层和中层海水的243个样本进行宏基因组分 析，得到7.2TB数据。对获得的数据进行分析，发现139个样本中含有 的微生物物种数目多于35,000个，而且在上层海水的垂直分层中，温度 是影响微生物种群分布的主要因素。分析海洋微生物核心功能，发现其 与人体肠道微生物的相似性高达73%。
[2] Sunagawa S, Coelho L P, Chaffron S, et al. Structure and function of the global ocean microbiome [J]. Science, 2015, 348(6237): 1261359.
参考文献
图2 Tara Oceans在全球海洋微生物中发现的新基因多样性
宏基因组测序及分析
宏基因组测序及分析在样品收集和处理阶段，我们需要根据研究目的选择合适的样品类型，并进行必要的处理，如过滤、离心等，以去除样品中的杂质。
DNA提取是宏基因组测序的关键步骤之一，它是将微生物样品中的DNA提取出来。
有许多不同的DNA提取方法，包括机械破碎法、化学溶解法等。
选择合适的提取方法能够最大限度地提取到目标微生物的DNA，并减少宿主DNA的污染。
测序样本库制备是为了将DNA样品转化为高通量测序所需的文库，并对其进行放大、纯化等步骤。
根据实验要求，我们可以选择不同的文库构建方法，如16SrRNA基因文库、全基因组文库等。
DNA测序是宏基因组测序中的关键一步，它使用高通量测序平台（如Illumina MiSeq、Ion Torrent等）对文库进行测序。
这些平台能够同时测序多个样品，从而减少了测序时间和成本。
数据分析是宏基因组测序的核心步骤，它包括对测序数据进行质量控制、数据过滤、序列比对、OTU聚类（操作税的单元，Operational Taxonomic Unit）等分析。
通过这些分析，我们可以了解样品中微生物的群体结构、物种多样性及其功能。
宏基因组测序及分析在许多领域都有广泛的应用。
例如，在环境科学中，它可以用于研究土壤中微生物的功能，揭示微生物对土壤质量和养分循环的贡献；在医学领域，它可以研究肠道微生物群落与人类健康之间的关系，为疾病的诊断和治疗提供新的思路。
总之，宏基因组测序及分析为我们认识微生物世界提供了全新的视角，通过揭示微生物群体的组成和功能，帮助我们更好地理解生态系统的结构和功能。
随着测序技术的不断发展，相信它将在更多的领域中发挥重要作用。
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宏基因组实验计划
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宏基因组学方法研究明永冰川的初步实验计划
起草人：李浩宇
宏基因组学研究方向及意义
研究：环境胁迫对集体遗传变异的过程和机理。
发掘:环境应激和应答基因的多态性。
探究：多态性基因的功能。
实验大体步骤:
I.环境样品的采集:
1）避免人源污染,采样的器具都要高温灭菌,采样过程中要戴手套。
2) 样品的迅速处理保存。
有条件最好用液氮冷冻运输,没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。
带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品,迅速用预冷缓冲液（多为PBＳ)重悬，离心收集沉淀。
分装成小份,冻存于液氮或者‐80 ℃冰箱中，避免反复冻融。
3）如果后续用间接法提取总ＤＮA 的话,此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，一般适用于水样。
IＩ.DNA提取方法的选择：
总ＤNＡ的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。
直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA。
间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。
两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。
直接提取法的优缺点:直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等）总DNA 的试验中。
其最大的优点在于得率高,在某些环境样品总DNA 提取实例中,比间接提取法高数倍至数百倍。
造成这种情况的最主要原因一是环境样品中存在丰富的胞外DＮA;二是许多微生物与基质形成复杂的结构,间接提取法不易对其进行分离。
在样品较珍贵时多采用此法。
其缺点同样明显,所得DＮA的纯度远不及间接提取法所得，基质中含的腐殖质一并被保留下来，使得所得ＤNＡ呈现黄褐色甚至黑色。
可以考虑MoBiｏ和Ｅpicenｔre的DＮＡ提取的商业试剂盒（主要用于提取土壤样品）。
间接提取法的优缺点:间接提取法则既可以用来提取固相样品总ＤNA也可以用来提取液体样品总DNＡ。
在提取液体样品(如海水、河流等样品)总DNA 时，需要用抽滤的方式浓缩。
与直接提取法刚好相反,其最大的优点在于提取ＤNA 纯度高，既使在提取固体样品微生物总DＮA 时，也可以用缓冲液对收集的菌体进行反复冲洗以去除表面所带杂质。
其缺点是DＮA 得率低。
ﻫ
土壤ＤNA 直接提取法：
(1)从超低温冰箱中取出保存样品(5 ｇ）;
(２) 于室温融化；
（３)加入1３.５ml CTAＢ抽提缓冲液和5０μl 蛋白酶Ｋ贮存液;
(4) 离心管于37oC ２25 ｒpm 水平振荡30 mｉn;
(５) 加入1．5 mL20%ＳDS;
(6) ６5oC 水浴2 h,每隔15 mｉn 轻轻颠倒数次;
(7) 室温6,0０0g 离心1０min,收集上清液,转移至一个新的50ml 离心管中;
(8) 沉淀中再加入4．5 ｍｌ提取液和０.5 ｍl 2０%SＤS，轻轻涡旋至混匀;
(9)浸入液氮中冷冻3 mｉｎ后，于沸水中煮沸3 min;
(１0)室温6,000g离心10 miｎ，收集上清液，与上次上清液合并；
(1１）重复(8)、(９)、(1０)一次;
(12) 将三次提取所获上清液与等体积的苯酚:氯仿(1:１v/v) 混合,摇匀后于4 ℃
12，０0０g 离心10 min；
(１3) 将上层水相转移至一新的50 ｍｌ离心管中,加入等体积的氯仿：异戊醇（24:１)，混匀后于4℃１２,000g 离心10 miｎ；
（14）再次转移上清至一新的离心管中，加入0.６倍体积的异丙醇于室温沉淀1 h; (１5）室温12,00０g 离心２０min；
(16) 收集沉淀,用预冷的70%乙醇洗涤沉淀；
(17) 向离心管中加入１ml TＥ，于4 ℃放置过夜,分装保存于‐20℃。
实验过程中的注意事项及一些技巧:ﻫﻫ(1) 整个提取过程吹吸动作要轻柔,避免剧烈震荡(试剂盒提取除外)。
ﻫ(2）用到的枪头在灭菌之前最好将头部剪掉,避免机械剪切。
ﻫ(３)酚氯仿抽提时,中间相一定不要吸到，宁可多丢弃一些。
(4）异丙醇沉淀时不要放在低温,０.7 倍体积室温沉淀足够了。
(5) ＤNA溶解时可以放在4℃静置过夜,次日离心取上清去除多余杂质。
ﻫ(6)水平震荡可以用左右摇晃的震荡器。
水样DＮA 间接提取法:
(1)抽滤的方式浓缩采集到的水样。
（2)采取差速离心取得水样中的菌体。
（3)取得微生物后进行裂解提取。
此方法还在查证中，具体前期对样品的处理方法还在整理中。
例如:用多少的水样进行浓缩，差速离心的转速选择。
会不会有ＤNＡ的丢失等等。
Ｅｐｉcｅｎtre推出了宏基因组DNA分离试剂盒（MｅｔａgｅnｏｍiｃDNＡＩｓoｌa
ｔion Kit for Watｅr),能从水样中分离已随机剪切的,可直接用于fosmiｄ克隆的DＮA片段。
此试剂盒能从水样中的培养或未培养微生物(包括革兰氏阳性菌)中提取4０ｋb大小的DNA。
提取的DNＡ可立即进行末端修复，并在乙醇沉淀洗涤后克隆到Ｅpiceｎtre的ＰCC １ＦＯS载体上。
优势:
１．无需化学剪切，琼脂糖块或大小选择。
2.无需纯化柱或酚/氯仿提取。
３.产量更高，从低丰度的微生物中回收DNA的概率更大。
4．Fosｍｉｄ载体与DＮA的克隆只需要90分钟。
下图为方法与流程：
粗提DＮA 的纯化
采用直接提取法提取的总DNA或多或少都含有腐殖质的存在。
它的存在对后续的分子生物学操作会有影响,时常会导致ＰＣR 扩增不出来,酶切困难,连接转化率低。
需要进行纯化。
纯化的方法包括:胶回收，柱纯化,电泳/电洗脱，梯度离心。
a 胶回收
胶回收最大的优点在于快捷,可以在很短的时间内完成。
纯化后的DＮA往往能够满足ＰCR要求。
但其缺点在于，膜截留式的纯化方式难免会对DＮA分子造成机械损伤,使得DNＡ弥散，完整度下降。
如果后续的实验室分析16S r DNA,则这种纯化方式不失为一种好方法。
ﻫ
b柱纯化
柱纯化相对于胶回收来说更为快速,十几分钟内可完成。
与胶回收相比，其纯化效果要差一些。
但通常情况下，纯化之后的ＤNA也能够满足ＰCＲ需求。
这种方法也会造成ＤNＡ分子的机械损伤，使得DNA 弥散,完整度下降。
ﻫ
c 电泳／电洗脱
电泳／电洗脱法相对于前两种有很多优点：其一,其价格低；其二,整个过程都很温和,能够保证DNA 的完整性;其三,纯化后的DNA 纯度较之前两种要好一些。
但是其亦有些许不便:其一,过程耗时长，包括透析袋的准备,电洗脱,洗脱液的浓缩等;其二,DNＡ损失量较前两种大，透析袋上会残留DNA。
如果样品不是很珍贵，并且后续要进行Metａgenoｍic 研究，这种方法不失为一种好方法。
如果有脉冲场凝胶电泳系统,用此方法可以得到高纯大片段DNＡ,可以满足后续的metagenomiｃC／Fosｍｉｄ文库构建。
d 蔗糖/氯化铯密度梯度离心
如果实验室有超速离心机(1０0,０0０ｇ以上),那么这种方法无疑也是一种好方法。
与电泳电洗脱法相同，这种方法在连续介质中对DNA 及杂质进行分离，可以很好的纯化DＮA。
纯化得到的DNＡ经过低熔点凝胶电泳切胶回收,可以得到高纯度大片段的DNA，可以满足后续的ｍｅtagｅnｏmｉc C／Fｏｓmｉｄ文库构建。
纯化质量的检测
ＤNＡ纯化完毕之后往往需要对纯化效果做一个初步的判断，主要包括两方面：其一,完整度判断；其二,纯度判断。
a完整度判断
完整度判断同前所述,千万要记得的是加纯化之前的DＮA样品做对照。
结果可以告诉我们纯化得率及完整度。
同样，最好能跑脉冲场凝胶电泳。
b 纯度判断
纯度判断通常可以采用两种方法:分光光度计法和PCR 扩增法。
分光光度计可以测定双链D ＮＡ在2６0nｍ处的吸收值及杂质在其他波长的吸收值。
通过不同波长吸收值的比,可以对DNＡ纯度做出判定。
通常这种方法由于灵敏性较高,所以在存在杂质时误差较大。
IIＩ．所提ＤNＡ完整性检测
ＤNA 的完整性主要采用普通琼脂糖凝胶电泳进行指示。
最好采用0．8％琼脂糖凝胶电泳,低电压长时间跑。
至少要用laｍbｄa DＮA／Ｈｉnd III 做marker,如果在23 kb 处有一条完整或略拖尾的带，则证明DNA 完整性尚好。
如有条件,可以采用脉冲场凝胶电泳对提取ＤNA的完整度进行分析。
用脉冲场凝胶电泳分析时，除了上面提及的那个ｍaｋeｒ，至少还应该有完整lambｄａDNA (约４8 kb)充当另一个makeｒ。
以上为送测序前样品的采集，DNA的提取,验证等前期处理与方法的大致步骤与方法。
Ｉllumina所进行的测序是由Gｅnome Ａnaｌyzer测序仪所完成的：
以上为GenoｍeＡnalyzer技术的基本原理IV.在DNA提取,检验完成后送BGI进行后续测序。