双水相萃取技术

双水相萃取技术

D09生物张燊睿092203112 内容提要:本文主要叙述双水相萃取技术的概念，原理，操作，未来发展方向以及在生物、食品工业中的应用。

Abstract:This paper mainly describes the two aqueous phase extraction technology concept, principle, operation, the future development direction as well as in the biological, food industry application

关键词：萃取、分离、双水相体系、提取、生物分离、未来发展、亲和作用。

引言：随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、、代谢工程等高新技术研究工作的广泛的开展，各种高附加值得食品生化新产品不断涌现，对食品、生化等分离技术提出了越来越高的要求。包括精馏、吸取、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术的三大特点：分离过程伴随有相的变化；筛分过程不能实现分子级别的分离；精制过程成本极高，这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术不相适应。围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流，即新型分离技术产生的背景。

双水相系统：基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固－液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐（一种是离散盐且另一种是亲液盐）在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成的。

例如用聚乙二醇（PEG Mr为6000）/磷酸钾系统从大肠杆菌匀浆中提取β-半乳糖苷酶。这是一个很有前途的新的分离方法，特别适用于生物工程得出的产品的分离。

一．双水相萃取原理：

双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术（partition of two aqueoue phase system）近年来发现的、引人注目的、极有前途的新型分离技术。早在1896年，荷兰微生物学家Beijerinck[1]发现，把明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时得到一种不透明的混合溶液，静止后风味两相，上相含大部分水，下相含大部分琼脂，而两相的主要成分都是水，人们把这种现象称为聚合物的不相溶性，由此产生了双水相萃取。1955年，瑞典伦德大学的Albertsson[2]首次利用双水相技术从单细胞藻类中分离淀粉核，从此开创了双水相分配技术。1979年德国GBF 的Kula和Kroner等[3]水相体系用于提取酶和蛋白质，使胞内酶提取过程大为改善。几十年来，国内外的研究者们已经就双水相分配技术的各个方面展开了系统的研究，包括新型双水相体统的开发，成相机理研究、系统物性的测定、热力学性质的研究生物大分子及小分子活性物质的分配、萃取工艺流程的设计、工业化大生产中的应用以及聚合物的回收等等，并取得很大进展。

双水相萃取的聚合物不相容性：根据热力学第二定律，混合是熵增过程可以自发进行，但分子间存在相互作用力，这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大。当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大

的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位，即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相溶性。

可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。生物分子的分配系数取决与溶质于双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用。因此，分配系数是各种相互作用的和。

1．相系统的选择;成功的利用双水相萃取技术分离提取目标蛋白质的第一步是选择合适的双水相系统，使目标蛋白质的收率和纯化程度均达到较高的水平，并且成相系统易于利用静置沉降或离心沉降法进行相分离。如果以胞内蛋白质为萃取对象，应使破碎的细胞碎片分配于下相中，从而增大两相间地密度差，满足两相的快速分离、沉降操作成本和操作时间的产业化要求。

2．水相萃取工艺设计：条件：待分离物质与原料液中的杂质应分配在不同的相中；待分离物质在双水相体系中的某一相中的分配系数相对较大，使得经过一次萃取后就能得到较高的提取率；双水相系统的上下相应易于分离。

双水相萃取技术的工艺流程一般分为三部分：目的产物的萃取；PEG的循环；无机盐的循环。

2.1 目的产物的萃取：(1)如果目标产物在上相中的分配系数足够大，则细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。一步双水相萃取是把生物材料悬浮液和双水相系统混合后，分离上下相，其中下相含有大多数杂质，而上相在通过超过滤操作进行进一步的提纯目标产物，同时

高聚物一相可以得到回收。在两步萃取操作中，把一步萃取体系中的上相分离出来后，再加入盐使其形成新的双水体系，则富含PEG的上相得到回收，同时，含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离目标，而且可以通过浓缩可以进行回收再利用。

(2) 细胞内蛋白质的萃取：双水相萃取法可选择性地使细胞碎片分配于双水相系统下的下相，而目标产物分配于上相，同时实现目标产物的部分纯化和细胞碎片的除去，从而节省利用离心法或膜分离法除去碎片的操作过程。因此，双水相萃取应用于胞内蛋白质的分离纯化是非常有利的。从细胞匀浆中萃取目标产物时，除成相系统外，匀浆液浓度是影响分离效率的重要因素。一方面，为降低设备体积，减少城乡聚合物用量，即降低设备投资和操作成本，添加匀浆液浓度应尽量高。但令一方面，如果匀浆液添加过多，其中细胞碎片、核酸和蛋白质的浓度达到与成相系统浓度相当的值，会不同程度地扰乱成相系统，改变相体积比。因此，一般来说，根据细胞种类与目标产物的不同，每千克系统的处理量上限为200~400g湿细胞。

步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。第一步萃取使细胞碎片、大部分杂蛋白和亲水性核酸、多糖等进入下相，而目标产物分配在上相；如目标产物尚未有杂质时，可在上相中加入适量的盐使其重新形成双水相，进行第二步萃取，除去大部分多糖与核酸；为便于目标产物与PEG分离和PEG的重复利用，在第三步萃取中，使目标产物分配与盐相。如第一步选择性足够大，目标产物的纯度已达到要求，则可直接进入第三步，将目标产物分配与盐相，再用超过滤法去除残余的PEG，以提高产品的纯度。

2.2 PEG循环：在大规模双水相萃取过程中，成相材料的回收和循环使用，不仅可以减少废水处理的费用，还可以节约化学试剂，降低成本。PEG的回收有两种方法：（1）加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG；（2）将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱机先洗去PEG，再洗出蛋白质。