双水相萃取技术
《双水相萃取技术》课件
03
双水相萃取技术的实验操作
实验准备
01
02
03
实验材料
准备双水相萃取所需的试 剂和材料,如蛋白质溶液 、双水相体系、离心管等 。
实验设备
确保实验所需的设备齐全 ,如离心机、天平、量筒 等。
安全措施
确保实验环境安全,穿戴 适当的实验服和护目镜, 避免试剂溅出。
实验步骤
加入蛋白质溶液
将待分离的蛋白质溶液加入离 心管中。
应用范围广泛
该技术在生物、医药、环保等领域有 广泛应用,可用于蛋白质、酶、细胞 等的分离和纯化。
操作简便高效
双水相萃取技术操作简单,分离速度 快,可实现大规模生产。
环境友好
该技术使用无毒或低毒性的物质,对 环境友好,符合绿色化学的发展趋势 。
技术展望
深入研究机理
进一步深入研究双水相萃取技术的机理,提高分 离效率和选择性。
蛋白质回收率测定
测定蛋白质的回收率,评估双水相萃取技术的效 果。
3
数据分析
对实验数据进行统计分析,了解双水相萃取技术 的分离效果和影响因素。
04
双水相萃取技术的优缺点
技术优势
高分离效率
双水相萃取技术能够实现高效率的分离过程,对于一些难以分离 的物质,如蛋白质、酶等,能够实现快速、准确的分离。
低成本
收集上清液
将上清液收集到适当的容器中 ,以便后续分析。
配制双水相体系
按照所需的浓度配制双水相体 系,确保比例准确。
离心分离
将离心管放入离心机中,设定 适当的转速和时间进行离心分 离。
清洗沉淀
清洗离心管中的沉淀,确保蛋 白质的纯度和回收率。
实验结果分析
1 2
萃取技术—双水相萃取技术(药物分离纯化课件)
内侧流 外侧 分配 萃取物
体 流体 系数
细胞色素 C 磷酸盐 PEG 0.18 肌红蛋白 磷酸盐 PEG 0.009 过氧化氢酶 磷酸盐 PEG 0.12 尿激酶 磷酸盐 PEG 0.65
内侧流 速,cm/s
16.3 4.0 16.3 16.3
外侧流 传质系 速,cm/s 数,cm/s
6.6 5.5?0 -6 5.0 7.5?0 -7 5.0 2.8?0 -5 5.0 2.0?0 -4
双水相萃取的应用--双水相萃取技术(萃取技术)
1.双水相萃取的应用
双水相分离条件 (1) 目的分子与细胞应分配在不同的相 (2) 分配系数应足够大 (3) 离心机容易分离
双水相萃取的应用
分离物质
举例
体系
NaDS-硫酸葡聚糖
酶 核酸 生长素 病毒 干扰素
细胞组织
过氧化氢酶的分离 分离有活性核酸DNA 人生长激素的纯化 脊髓病毒和线病毒纯化 分离β-干扰素
双水相萃取的应用--双水相萃取技术(萃取技术)
2.双水相萃取分离技术的发展方向 (1)廉价双水相体系的开发
优点: (1)蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15%以前没有沉淀,但在PEG浓度大于
5%时,溶解度显著地减小,在盐溶液中的溶解度更小。 (2)粘度小。PPT的粘度是粗dextran的1/2,传质好。 ⑶价格便宜。PPT几十$/kg,粗dex几百$/kg
系线
TMB:系线连接双节线上两点的 直线。
在临界点处,分配系数为1
临界点
药物分离与纯化技术课程
3.双水相相图
系线反映的信息:
(1)系线长度:衡量两相间相对差别的尺度。越长则两相间性质差 别越大,反之则越小;趋向于零时,(双节线上的点,临界点), 两相差别消失,成为均一相。
双水相萃取技术
双水相萃取技术双水相体系简介( 双水相体系简介(Aqueous two phase extraction, ATPE) )早在1896年,Beijerinck发现,当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液相混时,得到一个混浊不透明的溶液,随之分为两相,上相富含明胶,下相富含琼脂(或淀粉), 这种现象被称为聚合物的不相溶性(incompatibility),从而产生了双水相体系(Aqueous two phase system,ATPS)。
双水相萃取原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力( 如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
对于某一物质,只要选择合适的双水相体系,控制一定的条件,就可以得到合适的分配系数,从而达到分离纯化之目的。
双水相的形成双水相系统PEG = 聚已二醇Kpi = 磷酸钾DX = 葡聚糖(dextran双水相体系的分类高聚物/高聚物双水相体系高聚物/无机盐双水相体系低分子有机物/无机盐双水相体系表面活性剂双水相体系双水相萃取体系的特点1) 整个体系的含水量高(70%~90%), 萃取是在接近生物物质生理环境的条件下进行,故而不会引起生物活性物质失活或变性;2) 单级分离提纯效率高。
通过选择适当的双水相体系,一般可获得较大的分配系数,也可调节被分离组分在两相中的分配系数,使目标产物有较高的收率;3) 传质速率快,分相时间短。
双水相体系中两相的含水量一般都在80%左右,界面张力远低于水-有机溶剂两相体系,故传质过程和平衡过程快速;4) 操作条件温和,所需设备简单。
整个操作过程在室温下进行,相分离过程非常温和,分相时间短。
大量杂质能与所有固体物质一起去掉,大大简化分离操作过程;双水相萃取体系的特点5) 过程易于放大和进行连续化操作。
双水相萃取易于放大,各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低,易于与后续提纯工序直接相连接,无需进行特殊处理,这对于工业生产来说尤其有利;6) 不存在有机溶剂残留问题,高聚物一般是不挥发性物质,因而操作环境对人体无害;7) 双水相萃取处理容量大,能耗低。
双水相萃取技术详解
① 与固定床反应器相比,不需载体,不存在多孔载体中的
扩散阻力,故反应速度较快,生产能力较高;
② 生物催化剂在两水相系统中较稳定;两相间表面张力低, 轻微搅拌即能姓曾高度分散系统,分散相液滴在10μ m 以下,有很大的表面积,有利于底物和产物的传递。
3.5 工业设备
在萃取过程中,要求在萃取设备内两相能密切接触并伴 有较高的湍动,以实现两相之间的质量传递;尔后,又能使
二.双水相萃取的原理及流程 2.1 原理
一定条件下,水相也可以形成两相甚至多相。所以有 可能将生物活性物质(水溶性的酶、蛋白质等)从一个水 相转移到另一个水相中,从而完成分类任务。
因此双水相萃取与溶媒萃取的原理相似。
当两种高聚物水溶液相互混合时,他们之间的相互作 用可分为三类:
互不相容(imcompatibility)
3.1.1特点
1)体系易于放大,各种参数可以按比例放大而产物的回收率并 不降低, 这点对于工业应用尤为有利;
2)体系内传质和平衡速度快,回收率高,可达到90%以上, 比起 其他的一些分离过程,其能耗小;
3)体系的相间张力大大低于有机溶剂与水的相间张力,分离条 件温和,因而能保持绝大部分生物分子的活性; 4)操作条件温和,整个过程可在常温常压下进行; 5)离子液体的蒸汽压几乎为零,不会出现像有机溶剂那样因挥 发而引起环境问题;
迄今为止, 双水相萃取技术已被成功应用于生物工
程、药物提取、金属离子分离等方面。在生物工程、药
物分析、环境科学等方面有着广阔的应用前景。尽管其 已发展成为一种相对比较成熟的技术, 然而, 相关研究
和应用还不够深入, 一些技术难题还有待解决,但仍然
有值得深入研究与完善的方面。
1.3 双水相概念
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术
蛋白分离纯化技术之双水相萃取技术双水相萃取是一项蛋白分离和蛋白纯化技术,是利用物质在两相间的选择分配差异而进行分离提纯的,目前已经被广泛应用与医药化学、细胞生物学、生物化工和食品工业等领域。
双水相萃取技术用于提取蛋白质等生物活性物质时,具有操作简单、体系含水量高,在萃取过程中可以保持物质的构象稳定、蛋白不易失活并获得高的萃取率的特点。
1、双水相萃取技术可分离和纯化蛋白双水相萃取技术可以用于蛋白分离和蛋白纯化,包含在一些蛋白分离公司提供的服务。
早期,如在20世纪60年代,有研究者全面进行了生物大分子在双水相系统中的分配行为的研究,得到了蛋白质、酶、核酸、病毒、抗体抗原复合物以及细胞等的分配数据。
双水相系统具有温和的操作条件,对于在极性条件下易造成变性失活的蛋白质和酶的提取中表现出了很大的优势。
双水相萃取法进行蛋白分离和蛋白纯化的原理是:聚合物与聚合物之间或聚合物与盐之间由于分子空间阻碍作用形成了双水相。
当待分离物质进入体系后,由于各组分表面性质、电荷作用和各种力的作用和溶液环境的影响,使其在上、下相中的分配系数不同,通过调节体系参数使被分离物质在两相间选择性分配,从而实现目标组分的分离纯化。
双水相萃取技术进行蛋白分离和蛋白纯化具有以下优点:(1)易于放大,各种参数可以按照比例放大而不降低产物收率[1];(2)双水相系统传质和平衡过程速度快,回收效率高、能耗较小;(3)易于进行连续化操作、设备简单,且可以直接与后续提纯工序相连接,无需进行特殊处理;(4)相分离条件温和,双水相体系的张力很小,有利于保持生物分子的活性,可以直接用在发酵液中;(5)影响双水相体系的因素比较复杂,可调参数多,便于改变操作条件提高纯化效果。
美迪西提供蛋白质分离纯化技术服务,可以根据客户要求,提供从小试到规模生产全程的蛋白分离纯化服务,并根据工艺的要求结合产品特点给客户定制适用的工艺和系统。
2、双水相萃取技术分离和纯化物质的研究α-淀粉酶是一类用途十分广泛的酶,在粮食、食品加工,以及医药行业等都经常使用,由于α-淀粉酶是具有重要应用价值的工业酶,周内外很多课题组对它进行了研究。
双水相萃取全解
聚乙二醇
非离子型聚合物/ 非离子型聚 合物
聚丙二醇
聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
聚合物/ 低分子量化合物
葡聚糖硫酸钠
葡聚糖
羧甲基纤维素钠
丙醇
磷酸钾
聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵
双水相的形成
在聚合物∕盐或聚合物∕聚合物系统混合时, 会出现两个不相混溶的水相
②聚合物∕无机盐双水相
某些聚合物溶液和一些无机盐溶液 相混时,在一定浓度下,由于盐析作 用,也会形成两相,即聚合物/ 无机 盐双水相体系,常用的无机盐有磷酸 盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外, 能形成双水相体系的物质还有高分子 电解质、低分子量化合物。
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物 葡聚糖
影响双水相萃取平衡的主要因素有: 组成双水相体系的高聚物类型、高聚物 的平均分子量和分子量分布、高聚物的 浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的 离子浓度、pH值、温度等。
1)聚合物的类型
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水 性,聚合物的疏水性按下列次序递增:葡萄 糖硫酸盐糖<葡萄糖<羟丙基葡聚糖<甲基 纤维素<聚乙二醇<聚丙三醇,这种疏水性 的差异对目的产物的作用是重要的。
缺点:
• 成相聚合物的成本较高, 且高聚物回收困难。 • 水溶性高聚物大多数粘度 较大,不易定量控制。 • 易乳化,相分离时间较长。 • 影响因素复杂。
3、双水相萃取原理
(1) 分配系数
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的 原理相似, 都是依据物质在两相间的选择 性分配。当萃取体系的性质不同, 物质进 入双水相体系后, 由于分子间的范德华力、 疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之 间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的 浓度不同, 从而达到分离的目的。
双水相萃取技术
H2PO4- < HPO42-
(二)疏水作用
• 一般情况下,蛋白质的表面均存在疏水区,疏水 区所占比表面越大,其疏水性越强。不同组分由 于其表面疏水性的差异使得其各自在上下相中产 生相应的分配平衡。
• 聚合物-无机盐-水系统:盐析 作用。
为什么会形成双水相?
• 聚合物之间的不相容性:聚合物分子的空间阻碍作 用使相互间无法渗透,从而在一定条件下分为两 相。
• 只要两种聚合物水溶液的水溶性有所差异,混合 时就可发生相分离,并且水溶性差别越大,相分 离倾向也就越大。
• 某些聚合物的溶液在与某些无机盐等低分子质量 化合物的溶液相混时,只要浓度达到一定值,也 会产生两相。其形成机理是由于盐析作用。
• 上、下相的组成取决于两种聚合物(如 PEG/Dx)的加入量以及其分子质量的大小。
• 当物质进入双水相体系后,由于表面性质、 电荷作用和各种作用力(如憎水键、氢键 和离子键等)的存在和环境的影响,使其 在上、下相中的浓度不同。
• 分配系数 K不同而分离
相图
• 双水相形成条件和定量 PEG
关系可用相图表示。
• 当上下两相间密度差 小时,两相的体积近 似服从杠杆规则。
VT BM
VB MT
PEG400 0.700g
H2O 0.5ml
绘制相图实验操作
(NH4)2SO4
混和
记录 (NH4)2SO4
ml数
双水相萃取技术
新型功能双水相系统
温度敏感型双水 相体系
聚合物浓度的影响
聚合物分相的最低浓度为临界点,系线的 长度为零,此时分配系数为1,即组分均 匀的分配于上下相. 随着成相聚合物的总浓度或聚合物/盐混合 物的总浓度增大,系统远离临界点,系线 长度增加,两相性质的差别(疏水性等)增 大,蛋白质分子的分配系数将偏离临界点 处的值(K=1),即大于1或小于1。因此,成 相物质的总浓度越高,系线越长,蛋白质 越容易分配于其中的某一相。
盐的种类影响
在双聚合物系统中,无机离子具有各自的分配系数, 不同电解质的正负离子的分配系数不同,从而产生不 同的相间电位。由于各相要保持电中性,使得带电生 物大分子,如蛋白质和核酸等分别向两相移动分配。
盐浓度的影响
盐的浓度不仅影响蛋白质的表面疏水性,而且扰 乱双水相系统,改变各相中成相物质的组成和相 体积比。 例如,PEG/磷酸盐体系中上下相的PEG和磷酸 盐浓度及Cl-在上下相中的分配平衡随添加NaCl 浓度的增大而改变,这种相组成即相性质的改变 直接影响蛋白质的分配系数,如图。 离子强度对不同蛋白质的影响程度不同,利用这 一特点,通过调节双水相系统的盐浓度,可有效 地萃取分离不同的蛋白质。
lnK=lnK0+lnKe+lnKh+lnKb+lnKs+lnKc
式中,下标e、h、b、s、c分别表示静电作用、疏水作用、生 物专一性、分子大小、形态结构对分配系数的贡献。lnK0是 包括其他因素(盐的水合作用、配体相互作用)在内的分配 系数。
静电作用
非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影 响,利用相平衡热力学理论可推导下述分配系数表 达式: lnK=Mλ/RT M-溶质的相对分子质量;λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数;R-玻尔兹曼常数;T-绝对温度。 生物大分子物质的M值一般很大,λ的微小变化 会引起分配系数很大的变化。因此利用不同的表面 性质,可以达到快速分离非电介质型的大分子溶质 的目的。
第五章 双水相萃取技术
利用前式可确定不同双水相系统的HF值。如果在pH为 等电点的双水相中蛋白质的分配系数(m0)与HF值之间 呈线性关系,则直线的斜率定义为该蛋白质的表面疏 水性,用HFS (hydrophobic factor of solutes)表示 lnm0=HF× HFS × 一般形式 lnm=HF(HFS+∆HFS)+ ∆φFZ/RT
• (5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双 水相体系中可将发酵生产过程中的生物 转化与下游处理的第1步相结合,即生物 反应在其中一相中进行,同时生成的反 应产物被连续萃取到另一相中。不仅解 决了产物反馈抑制作用造成的产量低的 问题,而且酶在高聚物溶液中比在缓冲 液中更稳定,活性更大。因为生物反应 和生物产物的提取同时进行,尤其适于 连续生产。
lnmaa=HF(RH+B)
其中,RH为氨基酸的相对疏水性(relative hydrophobicity),是 通过测定氨基酸在水和乙醇中溶解度的差别确定的,并设疏水 性最小的甘氨酸的RH=0。
B = lnmGly/HF
所以,pH=pI时氨基酸在双水相系 统中的分配系数与其RH值呈线性关 系,直线的斜率就是该双水相系统 的HF值。
实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解 质,当这些离子在两相中分配浓度不同时(即分配系数 ≠1),将在两相间产生电位差,此时,荷电溶质的分配 平衡将受相间电位的影响,从相平衡热力学理论推导 溶质的分配系数表达式为: lnm=lnmo+∆φFZ/RT 因此,荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数 成正比,由于同一双水相系统中添加不同的盐产生的 相间电位不同,故分配系数与静电荷数的关系因无机 盐而异.
成相高聚物浓度界面张力成相高聚物浓度界面张力成相高聚物的相对分子量成相高聚物的相对分子量一般来说蛋白等高分子量物质易集中于一般来说蛋白等高分子量物质易集中于低分子量相低分子量相电化学分配电化学分配双水相萃取时蛋白质的分配系数受离子双水相萃取时蛋白质的分配系数受离子强度的影响很小强度的影响很小疏水反应疏水反应生物亲和分配生物亲和分配温度及其它因素温度及其它因素双水相系统的聚合物组成包括聚合物类型平均分子量盐类包括离子的类型和浓度离子强度ph值溶质的物理化学性质包括分子量等电点以及体系的温度等
双水相萃取技术
一般来说,双水相萃取时,如果相系统组成位于临界
点附近,则蛋白质等大分子的分配系数接近于1。高
聚物浓度增加,系统组成偏离临界点,蛋白质的分配
系数也偏离1,即K>1或K<1 。
盐对带电大分子的分配影响很大。各种盐的分
配系数存在着微小的差异,产生了相间电位。由 于蛋白质等大分子在水溶液中常带有电荷,相间 电位造成的静电力能影响所有带电大分子和带电 细胞粒子在两相中的分配。例如,DNA萃取时,
高聚物(P) 聚丙二醇 聚乙二醇 甲基纤维素 乙基羟乙基纤维素 羟丙基葡聚糖 聚蔗糖 聚乙二醇
高聚物或低聚物(Q) 甲基聚丙二醇,聚乙二醇,聚乙烯醇, 聚乙烯吡咯烷酮,羟丙基葡聚糖,葡聚糖 聚乙烯醇,葡聚糖,聚蔗糖 羟甲基葡聚糖,葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁,硫酸铵,硫酸钠,甲酸钠,酒石 酸钾钠
温度的影响是间接的,它主要影响相的高 聚物组成,只有当相系统组成位于临界点
附近时,温度对分配系数才具有较明显的
作用。
对酶的分配系数也有很大关系,特别是在系
统中含有磷酸盐时,由于pH的变化会影响
磷酸盐是一氢化物还是二氢化物磷酸盐的存
在,而一氢化物磷酸盐对界面电位有明显的
影响。
Dextran、FiColl、淀粉、纤维素等高聚物具有光学 活性,它们应该可以辨别分子的D、L型。因此,对
从10ml直接放大到1m3规模(105倍),而各种试验参
数均可按比例放大,产物收率并不降低。
生物化学
细胞生物学 生物化工
食品化工
主要是分离蛋白质 ,酶,病毒,脊髓病毒和线病 毒的纯化,核酸,DNA的分离,干扰素,细胞组 织,抗生素,多糖,色素,抗体等。 目前,用此法来提纯的酶已达数十种,其分离过 程也达到相当规模,I-Horng Pan等人利用 PEG1500/ NaH2PO4体系从Trichoderma koningii发酵液中分离纯化β-木糖苷酶,该酶主 要分配在下相,下相酶活回收率96.3%,纯化倍 数33。
第七章 双水相萃取技术
双水相萃取
双水相萃取:利用 物质在互不相溶的 两水相之间分配系 数的差异,进行萃 取的方法。
第一节 双水相分离理论
一、双水相的形成
当两种聚合物混合时,究竟是否分层或混合成一相, 取决于两种因素:
体系熵的增加:与分子数量有关,与分子大小无关。
分子间作用力:主要表现为分子中各个基团间的相互 作用力。分子量越大,分子间的作用力也越大。 对于大分子间的混合,分子间作用力决定是否分层。
双水相萃取技术的应用
要成功地运用双水相萃取方法,应满足一些要求:
(1)欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中;
(2)酶的分配系数应足够大,使在一定的相体积比 时,经过一次萃取,就能得到较高的收率; (3)两相用离心机很容易分离。
胞内酶连续双水相萃取工艺流程
第三节 双水相萃取技术的发展
lnK = -ΔE/(kT) 式中:ΔE — 溶质从相2转移到相1所需的功
k — 波尔兹曼常数(J/K)
T — 温度(K)
表面自由能的影响
lnK = -ΔE/(kT)
假设溶质分子或粒子为球形,它在两相中的表面 能分别为:4πR2γS1、4πR2γS2 ΔE = 4πR2γS1- 4πR2γS2 = 4πR2(γS1-γS2) 式中:R — 溶质分子或粒子半径 γS1 、γS2 — 溶质与相1间、相2间的表面张力 lnK = -4πR2(γS1-γS2)/(kT)
分配系数与pH的关系
影响分配平衡的参数
— 温度
影响分配平衡的参数
— 微生物
对于同一种双水相 体系,微生物影响 体系上下相的比例 以及胞内蛋白在体 系的分配系数。
双水相萃取技术
三、双水相体系的组成
• 当两种高聚物的水溶液相互混合时,若两种 被混合分子间存在空间排斥作用,使它们之间无 法相互渗透,则在达到平衡时就有可能分成两相, 形成双水相。两相的组成和密度均不相同,通常 密度较小的一相浮于上方,称为上相(轻相); 密度较大的一相沉于下方,称为下相(重相)。 一般认为,只要两种聚合物水溶液的水溶性有所 差异,混合时就可以发生相分离,并且差别越大, 相分离倾向就越大。 • 聚乙二醇/葡聚糖和聚乙二醇/无机盐是常用 的双水相体系,由于葡聚糖价格昂贵,因此聚乙 二醇/无机盐体系应用更为广泛。聚乙二醇/无机 盐中所用无机盐主要是磷酸盐和硫酸盐。
参考文献
• [1]郭会灿.双水相萃取技术及其在药物分离中的应 用[J].河北化工.Vol.34,No.8.Aug.201 1. • [2]王志华,马会民,马泉莉. 双水相萃取体系的研究 [J].应用化学.Vol.18,No.3.Mar.2001. • [3]胡松青,李琳,郭祀远.双水相萃取技术研究新进 展[J].现代化工.22.Jun. 2004. • [4]马春宏,朱红,王良.双水相萃取技术的应用研究 进展[J].光谱实验室.Vol.27,No.5September,2010.
3、无机盐的循环
将盐相冷却,结晶,然后用离心机离心 分离回收。其它方法有电渗析法、膜分离 法回收盐类或除去PEG 相的盐。
五、影响双水相萃取技术的因素
• • • • • •
组成双水相系统的高聚物类型 高聚物的平均分子量及浓度 组成双水相系统的盐的种类 离子强度和浓度 被分离的各种物质的种类、性质、分配特性等 操作条件如pH值、温度等
四、双水相萃取技术的工艺流程
双水相萃取技术的工艺过程主要由3 部分构成:目的产物的萃取、PEG 的循 环、无机盐的循环。
双水相萃取技术
三、双水相萃取3.1 双水相萃取的原理及特点3.1.1 双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2 双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点:(1)含水量高(70%~90%),是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性;(2)分相时间短,自然分相时间一般为5~15min;(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m),有助于强化相际间的质量传递;(4)不存在有机溶剂残留问题;(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去,使分离过程更经济;(6)易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点,因此,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。
在黄豆匀浆中加入PEG4000,可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%),PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液,用离心萃取器完成双水相体系的两相分离,整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/(NH4)2SO4双水相体系,经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%),pH=8,α-淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。
双水相萃取技术
三、双水相萃取3.1双水相萃取的原理及特点3.1.1双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点:(1)含水量高(70%〜90%),是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性;(2)分相时间短,自然分相时间一般为5~15min ;⑶界面张力小(10-7〜10-4mN/m),有助于强化相际间的质量传递;⑷不存在有机溶剂残留问题;(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去,使分离过程更经济;(6)易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点,因此,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。
在黄豆匀浆中加入PEG4000,可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%),PGK在上相、GAPGH 在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液,用离心萃取器完成双水相体系的两相分离,整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/(NH4)2SO4 双水相体系,经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取a淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2S04(20%),pH=8,a淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。
双水相萃取全解
双水相体系的双结线模型
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
双节线 均相区
两相区 系线
临界点
二、双水相萃取工艺流程操作
工艺流程主要由三部分组成:
• 目标产物的萃取 • 聚合物(PEG)的循环 • 无机盐的循环
双水相萃取工艺流程图
萃取液 相似相溶原理
上相
PEG
ATPE
无机盐
相体系回收示意图
PEG的循环
2)聚合物及其相对分子质量
不同聚合物的水相系统,疏水性不同; 同一聚合物,疏水性随分子量增加而增加, 其大小的选择取决于萃取过程的目的和方 法,在PEG/Dex体系中,PEG分子量的 减少,会使萃取液在两相中的分配系数增 大,当PEG的分子量增加时,在质量浓度 不变的情况下,亲水性蛋白质不再向富含 PEG相中聚集而转向另一相。
R=Vt/Vb,K=Ct/Cb,G=1/RK, Y=(1+1/RK)-1 ×100%
式中:R-相比;Vb-下相体积,mL;
Vt-上相体积,mL; K-分配系数; Cb-下相溶质的质量浓度,g/mL; Ct -上相溶质的质量浓度,g/mL; G-上、下相溶质的质量比; Y-萃取率,%。
(3) 双水相相图制作
综合利用以上因素,可通过实验确定最佳双 水相萃取系统。以PEG/硫酸铵双水相体系萃取 一种蛋白质为例: (1)固定硫酸铵为某一浓度,用梯度浓度的 聚乙二椁与其形成一系列双水相体系,萃取分 离蛋白质,分别测量上、下相蛋白质的含量, 确定PEG的最佳浓度。 (2)选取(1)中的最佳PEG浓度,在此浓度 下与梯度浓度的硫酸铵形成双水相体系,进行 蛋白质的萃取分离,测定上、下相中蛋白质的 含量,确定出最佳的硫酸铵浓度。
双水相体系的双结线模型
双水相萃取
双水相萃取
双水相萃取技术是一种新型的有机合成技术,它可以将一种有机物质从另一种有机物质中分离出来,这可以大大地提高有机化学反应的效率。
双水相萃取是以水为介质的组合相萃取,其特点是有机溶剂和水在反应容器中共存,利用不同的pH值将两种有机物质分别提取到两个水相中去。
双水相萃取这种技术可以用于有机合成中,当反应容器中有多种不同有机物质时,利用双水相萃取可以将其中一种有机物质从另一种有机物质中提取出来,从而可以有效地减少对反应物的有害影响,提高反应的效率。
同时,双水相萃取还可以用于多相反应的分离,如有机-水-有机-水多相反应、有机-水-水有机反应等,这种技术可以将有机物和水的相,利用不同的pH值将其分离出来,提取各自的产物。
双水相萃取技术也可以用于重金属元素的提取和富集,将有机物中含有重金属元素的物质提取出来,提高重金属元素的度。
双水相萃取技术可以用来将有机物中含有大量盐和其他有机物的物质,利用pH值分别提取出来,从而大大改善污染现象。
双水相萃取技术还可以将有机物质中含有有害物质的有机物从另一种有机物中提取出来,减少有害物质对人体的危害。
双水相萃取技术的优点不仅体现在反应效率的提高,而且还体现在它的环境友好性。
因为双水相萃取技术整个反应过程中所使用的有机溶剂是水,那么在完成反应后,所产生的废物也是水,这就避免了对环境的污染,更有利于保护自然环境。
总之,双水相萃取技术可以有效地实现有机物质从另一种物质中的分离和提取,节省了大量的时间和费用,可以有效地提高反应的效率,也符合生态环境的发展趋势。
因此,双水相萃取技术在有机化学领域有着重要的应用价值,并将在未来发挥更大作用。
双水相萃取
成本较高。即使水溶性聚合物和盐可
以回收再用; 选择性较低,分离纯化倍数低,一般 只适用于粗分离;
业应用;
第 4 章
目前的一些应用
1. 提取酶和蛋白质; 2. 进行萃取性生物转化 ; 3. 食品工业中用来从酸水解产物中提取二肽、 氨基酸、核苷酸等物质 ; 4. 萃取细胞、细胞器、膜等粒子;
第 3 章
优点与缺点
双水相萃取法的特点:能够保留产物的活性;整个操作可以连续化;
在除去细胞或细胞碎片时,还可以纯化蛋白质2~5倍,与传统的过滤法和
离心法相比,收率更高;
优点
操作条件温和,在常温常压下进行;
缺点
含较高浓度的水溶性聚合物和盐,会
带到产物中,需要辅助处理方法;
两相的界面张力小,易分散两相的
盐的种类和浓度 2
各相要保持电中性,使得带电物质 在两相移动分配;盐的种类和添加 其他种类的盐有助于提高选择性;
3 体系pH值
pH会影响蛋白质中可以离解基团 的离解度,改变所带电荷和分配系 数;pH也影响磷酸盐的离解程度;
温度 4
温度影响物质的分配系数。但一般 来说,影响很小,1~2度的温度 变化不影响目标产物的萃取分离;
双水相萃取
(Aqueous Two Phase Extraction)
汇报人: 日 期: xxx 2016-4-20
目录
Contents
01 - 双水相萃取技术 02 - 分离原理 03 - 优点与缺点 04 - 目前应用
第 1 章
什么是双水相萃取技术?
双水相体系
两种水溶性聚合物的水溶液;
相图
杠杆规则:系线上各点均为组
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双水相萃取技术D09生物张燊睿092203112 内容提要:本文主要叙述双水相萃取技术的概念,原理,操作,未来发展方向以及在生物、食品工业中的应用。
Abstract:This paper mainly describes the two aqueous phase extraction technology concept, principle, operation, the future development direction as well as in the biological, food industry application关键词:萃取、分离、双水相体系、提取、生物分离、未来发展、亲和作用。
引言:随着基因工程、蛋白质工程、细胞培养工程、、代谢工程等高新技术研究工作的广泛的开展,各种高附加值得食品生化新产品不断涌现,对食品、生化等分离技术提出了越来越高的要求。
包括精馏、吸取、萃取、蒸发、结晶在内传统的分离技术的三大特点:分离过程伴随有相的变化;筛分过程不能实现分子级别的分离;精制过程成本极高,这些特征对于节约能源、生物分离、环境保护、资源开发、替代能源、高纯材料等当代化学工程与科学技术不相适应。
围绕以上几个问题的讨论就构成了分离技术研究与发展的主流,即新型分离技术产生的背景。
双水相系统:基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品,需经细胞破碎后才能提取、纯化,细胞颗粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难,同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。
由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会变性,因此传统的溶剂萃取法并不适合。
采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题,但同样存在相的分离问题。
当两种聚合物、一种聚合物与一种亲液盐或是两种盐(一种是离散盐且另一种是亲液盐)在适当的浓度或是在一个特定的温度下相混合在一起时就形成的。
例如用聚乙二醇(PEG Mr为6000)/磷酸钾系统从大肠杆菌匀浆中提取β-半乳糖苷酶。
这是一个很有前途的新的分离方法,特别适用于生物工程得出的产品的分离。
一.双水相萃取原理:双水相萃取技术又称水溶液两相分配技术(partition of two aqueoue phase system)近年来发现的、引人注目的、极有前途的新型分离技术。
早在1896年,荷兰微生物学家Beijerinck[1]发现,把明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉溶液混合时得到一种不透明的混合溶液,静止后风味两相,上相含大部分水,下相含大部分琼脂,而两相的主要成分都是水,人们把这种现象称为聚合物的不相溶性,由此产生了双水相萃取。
1955年,瑞典伦德大学的Albertsson[2]首次利用双水相技术从单细胞藻类中分离淀粉核,从此开创了双水相分配技术。
1979年德国GBF 的Kula和Kroner等[3]水相体系用于提取酶和蛋白质,使胞内酶提取过程大为改善。
几十年来,国内外的研究者们已经就双水相分配技术的各个方面展开了系统的研究,包括新型双水相体统的开发,成相机理研究、系统物性的测定、热力学性质的研究生物大分子及小分子活性物质的分配、萃取工艺流程的设计、工业化大生产中的应用以及聚合物的回收等等,并取得很大进展。
双水相萃取的聚合物不相容性:根据热力学第二定律,混合是熵增过程可以自发进行,但分子间存在相互作用力,这种分子间作用力随相对分子质量增大而增大。
当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时,由于相对分子质量较大的分子间的排斥作用与混合熵相比占主导地位,即一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子,当达到平衡时,即形成分别富含不同聚合物的两相。
这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相溶性。
可形成双水相的双聚合物体系很多,如聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx),聚丙二醇/聚乙二醇,甲基纤维素/葡聚糖。
双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx,该双水相的上相富含PEG,下相富含Dx。
另外,聚合物与无机盐的混合溶液也可以形成双水相,例如,PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃取。
PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。
生物分子的分配系数取决与溶质于双水相系统间的各种相互作用,其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用。
因此,分配系数是各种相互作用的和。
1.相系统的选择;成功的利用双水相萃取技术分离提取目标蛋白质的第一步是选择合适的双水相系统,使目标蛋白质的收率和纯化程度均达到较高的水平,并且成相系统易于利用静置沉降或离心沉降法进行相分离。
如果以胞内蛋白质为萃取对象,应使破碎的细胞碎片分配于下相中,从而增大两相间地密度差,满足两相的快速分离、沉降操作成本和操作时间的产业化要求。
2.水相萃取工艺设计:条件:待分离物质与原料液中的杂质应分配在不同的相中;待分离物质在双水相体系中的某一相中的分配系数相对较大,使得经过一次萃取后就能得到较高的提取率;双水相系统的上下相应易于分离。
双水相萃取技术的工艺流程一般分为三部分:目的产物的萃取;PEG的循环;无机盐的循环。
2.1 目的产物的萃取:(1)如果目标产物在上相中的分配系数足够大,则细胞匀浆液中的目标产物可采用一步或两步双水相萃取工艺获得较高的纯化倍数。
一步双水相萃取是把生物材料悬浮液和双水相系统混合后,分离上下相,其中下相含有大多数杂质,而上相在通过超过滤操作进行进一步的提纯目标产物,同时高聚物一相可以得到回收。
在两步萃取操作中,把一步萃取体系中的上相分离出来后,再加入盐使其形成新的双水体系,则富含PEG的上相得到回收,同时,含有目标产物的盐相通过超滤等操作得到分离目标,而且可以通过浓缩可以进行回收再利用。
(2) 细胞内蛋白质的萃取:双水相萃取法可选择性地使细胞碎片分配于双水相系统下的下相,而目标产物分配于上相,同时实现目标产物的部分纯化和细胞碎片的除去,从而节省利用离心法或膜分离法除去碎片的操作过程。
因此,双水相萃取应用于胞内蛋白质的分离纯化是非常有利的。
从细胞匀浆中萃取目标产物时,除成相系统外,匀浆液浓度是影响分离效率的重要因素。
一方面,为降低设备体积,减少城乡聚合物用量,即降低设备投资和操作成本,添加匀浆液浓度应尽量高。
但令一方面,如果匀浆液添加过多,其中细胞碎片、核酸和蛋白质的浓度达到与成相系统浓度相当的值,会不同程度地扰乱成相系统,改变相体积比。
因此,一般来说,根据细胞种类与目标产物的不同,每千克系统的处理量上限为200~400g湿细胞。
步双水相萃取工艺以获得较高的纯化倍数。
第一步萃取使细胞碎片、大部分杂蛋白和亲水性核酸、多糖等进入下相,而目标产物分配在上相;如目标产物尚未有杂质时,可在上相中加入适量的盐使其重新形成双水相,进行第二步萃取,除去大部分多糖与核酸;为便于目标产物与PEG分离和PEG的重复利用,在第三步萃取中,使目标产物分配与盐相。
如第一步选择性足够大,目标产物的纯度已达到要求,则可直接进入第三步,将目标产物分配与盐相,再用超过滤法去除残余的PEG,以提高产品的纯度。
2.2 PEG循环:在大规模双水相萃取过程中,成相材料的回收和循环使用,不仅可以减少废水处理的费用,还可以节约化学试剂,降低成本。
PEG的回收有两种方法:(1)加入盐使目标产物转入富盐相来回收PEG;(2)将PEG相通过离子交换树脂,用洗脱机先洗去PEG,再洗出蛋白质。
2.3 无机盐的循环:一种方法使将含磷酸钠的盐相冷却到6摄氏度,使盐结晶析出,然后用离心机分离收集;另一种方法是用电渗析法、膜分离法回收盐类或出去PEG相的盐。
三.双水相萃取技术在生物、食品工业中的应用。
双水相萃取在生物和食品工业等领域的研究和应用发展较快。
到目前为止,双水相萃取应用及研究主要集中在以下几个方面:3.1 提取酶和蛋白质。
这是双水相体系研究和应用最多的方面。
对发酵液、细胞培养液、植物、动物组织中细胞内、外的酶和蛋白质均可提取。
工业上已有几种双水相体系用于从发酵液中分离提取蛋白质和酶。
绝大多数是用PEG作上相聚合物,葡萄糖、盐溶液和羟甲基淀粉的其中一种作下相成相物质。
3.2 进行萃取性生物转化。
应用实例有:利用葡萄糖和淀粉生产乙醇、利用葡萄糖生产丙酮丁醇、利用淀粉和纤维素水解生产葡萄糖、水解酪蛋白、发酵生产乳酸、将青霉素G转化为6-氨基青霉烷酸等。
3.3 食品工业中用来从酸水解产物中提取二肽、氨基酸、核苷酸等风味物质。
在生物技术方面,可用来提取DNA。
3.4 萃取细胞、细胞器、膜等粒子.主要目的有:分离提纯、分级分离、探测体内反应或体外处理时颗粒表面的变化、研究颗粒表面结构与生物学功能的相互关系、研究细胞与细胞或细胞与生物大分子间相互作用、探测种属关系十分接近的细胞表而细微的差别,大多数都是用亲和萃取方法来达到目的的。
3.5 应用与液—液分配层析(LLPC).将一种聚合物连接在固体颗粒(支持物)上,另一种聚合物的溶液作为流动相。
这种柱层析技术课分离蛋白质、核酸4.1开发廉价的新型双水相系统聚合物成相价格昂贵是阻碍改技术应用于生产的主要因素,磷酸盐会带来环境问题,体系盐浓度高,无法实现亲和分配,并会破坏某些生物物质的活性,使其应用范围受到一定限制。
因此开发廉价的聚合物是该技术应用的急需解决的问题。
新型功能双水相体系是指高聚物易于回收或操作简便的双水相体系。
新型双水相体系主要有两类:廉价高聚物∕高聚物体系及新型功能双水相体系,廉价双水相得开发主要集中在寻找一些廉价的高聚物取代现用的昂贵的高聚物。
这样可以大大降低成本,利于工业放大。
新的双水相体系表mean活性剂—水体系、双水相胶束体系的相继被发现,这些双水相体系各有优势,这些体系不仅操作成本低,萃取效果好,还为活性物质提供了更温和的良好的环境。
4.2 双水相分配与相关技术的集成化集成化概念引入化工分离领域,形成了过程集成化新概念是化工过程技术概念上的革命。
过程集成化是指不同的分离技术上的相互渗透,实现优势互补,从而达到整体优化的目的。
双水相分配技术与温度诱导相分离、电泳、层析和亲和技术可以实现集成化,具体表现在3方面:与常规技术结合来解决双水相萃取本身的难点问题;引进其他分离技术进行融合以提高分离效率,简化分离过程;为已有的技术提供新的思路。
4.2.1 与温度诱导相分离的集成:采用乙烯基氧与丙烯基氧的共聚物和PEG 可形成温敏性双水性体系。
蜕皮甾族化合物的提取是简便、快捷、便宜的温度诱导双水相萃取技术应用的成功例子。
4.2.2 与电泳技术的集成:电泳是生化工程中常规的分析和分离手段,引入到双水相分配中形成了一个新的概念——双水相电泳。
4.2.3 与层析分离技术的集成化;利用双水相分配去除细胞碎片等固体颗粒,并实现初步纯化后,将包含有目标物的富聚合物相或富盐相直接上层析柱进行层析分离。