酶促反应动力学(有方程推导过程)
酶促反应动力学实验.
酶动力学综合实验实验（一）——碱性磷酸酶Km值的测定【目的要求】1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响2.了解米氏方程、Km值的物理意义及双倒数作图求Km值的方法。
【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。
其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。
但它不是单一的酶，而是一组同功酶。
本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。
2、米氏方程：Michaelis-Menten 在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：错误！未找到引用源。
(1) 式中：v表示酶促反应速度，错误！未找到引用源。
表示酶促反应最大速度，[S]表示底物浓度，错误！未找到引用源。
表示米氏常数。
3、错误！未找到引用源。
值的测定主要采用图解法，有以下四种：①双曲线作图法（图1-1，a）根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2错误！未找到引用源。
时的底物浓度[s]值即为Km值，以克分子浓度（M）表示。
这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。
实测错误！未找到引用源。
一个近似值，因而1/2错误！未找到引用源。
不精确。
此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。
②Lineweaver- Burk作图法双倒数作图法（图1-1，b）实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。
其中之一即取（1）式的倒数，变换为Lineweaver- Burk方程式：错误！未找到引用源。
(2)以错误！未找到引用源。
对错误！未找到引用源。
作图，即为y=ax+b形式。
此时斜率为错误！未找到引用源。
，纵截距为错误！未找到引用源。
把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—错误！未找到引用源。
③Hofstee作图法（略）把（2）式等号两边乘以错误！未找到引用源。
，得：错误！未找到引用源。
(3)以v对错误！未找到引用源。
酶促反应动力学米氏方程
酶促反应动力学米氏方程摘要：1.酶促反应动力学的基本概念2.米氏方程的推导过程3.米氏方程的应用4.酶促反应动力学的影响因素5.总结正文：一、酶促反应动力学的基本概念酶促反应动力学是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。
在酶促反应中，酶作为催化剂，可以降低反应所需的活化能，从而加速反应速率。
酶促反应动力学主要研究酶浓度、底物浓度、温度、pH、抑制剂和激活剂等因素对反应速率的影响。
二、米氏方程的推导过程米氏方程是描述酶促反应速度与底物浓度之间关系的经典方程。
其推导过程如下：1.假设酶分子的数量为[E]，底物浓度为[S]，酶促反应速度为v。
2.酶在催化过程中会与底物结合形成酶- 底物复合物（ES），此过程为慢反应。
3.酶- 底物复合物在达到一定程度后会分解为酶和产物，此过程为快反应。
4.根据慢反应和快反应的速率常数，可以得到酶促反应速度的表达式。
5.将表达式中的慢反应和快反应速率常数用米氏常数（Km）表示，即可得到米氏方程：v = (Km * [S]) / (Km + [S])三、米氏方程的应用米氏方程可以用于分析酶促反应的动态过程，预测反应速度与底物浓度的关系，以及研究酶的结构与功能。
此外，通过比较不同底物和酶的米氏方程，可以了解酶的专一性和底物选择性。
四、酶促反应动力学的影响因素酶促反应动力学受到多种因素的影响，主要包括：1.酶浓度：在一定范围内，酶浓度的增加会提高反应速率，但当酶浓度达到饱和时，反应速率不再随酶浓度增加而提高。
2.底物浓度：底物浓度的增加会提高反应速率，但当底物浓度达到一定程度时，反应速率不再随底物浓度增加而提高。
3.温度：温度的升高会加速反应速率，但过高的温度会导致酶失活，使反应速率降低。
4.pH：酶的活性受pH 值的影响，pH 值的改变会影响酶的催化效率。
5.抑制剂和激活剂：抑制剂会降低酶的催化效率，而激活剂会提高酶的催化效率。
五、总结酶促反应动力学是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。
酶促反应动力学
第一节 酶促反应的动力学方程
一、化学动力学基础
1、反应分子数和反应级数 1）反应分子数
指在反应中真正相互作用的分子数。
A
P
A+B
P+Q
2）反应级数
指实验测得的反应速率与反应物浓度之间的关系，符合 哪种速率方程，则这个反应就是几级反应。
蔗糖 + H2O 蔗糖酶 葡萄糖 + 果糖
1
3）零级反应的特征
反应速率与反应物浓度无关。初始浓度增加，反应速度不变， 要使反应物减少一半所需完成的反应量增加，因此最后表现为半 衰期与初始浓度成正比。
二、底物浓度对酶促反应的影响
1、酶促反应初速度与底物浓度之间的关系 1903年Henri以蔗糖酶水解蔗糖为例，研究底物浓度与酶促反
应速度之间关系时，发现两者的关系符合双曲线关系。
k2
Km= (k2+k3)/k1
Km是[ES]的分解常数与生成常数的比值。 Km的真正含义是， Km越大意为着[ES]越不稳定，越容易分解。但不能说明[ES]是容 易分解成底物还是产物。
kcat/Km可表示为 [k3/(k2 + k3)]k1， k3/(k2 + k3)代表[ES] 分解成产 物的分解常数占[ES] 总分解常数的比值。 k3/(k2 + k3)越大，说明 [ES]越容易分解成产物。 k1是[ES] 生成常数。因此， kcat/Km数 值大不仅表示[ES]容易生成，还表示[ES]易分解成产物。真正代 表酶对某一特定底物的催化效率。所以，也称为专一性常数。 极限值是k1 ，意为[ES]不会再分解为底物。
酶的化学本质是蛋白质，因此，酶 对温度具有高度的敏感性，随着温度 的升高，分子的构象会逐渐地被破 坏，失去催化活性。
酶促反应动力学(有方程推导过程)
酶促反应动力学(kinetics of enzyme- catalyzed reactions)是研究酶促反应速度及其影响因素的科学。酶促反应的影响因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。
01
酶促反应动力学
02
3.4 酶促反应动力学
酶浓度的影响
在一定温度和pH下，酶促反应在底物浓度大于100 Km时，速度与酶的浓度呈正比。 酶浓度对速度的影响机理：酶浓度增加，[ES]也增加，而V=k3[ES]，故反应速度增加。
，所以
(2)
将（2）代入（1）得：
(3)
当[Et]=[ES]时，
(4)
所以
将（4）代入（3），则：
01
Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底
02
物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓
03
度时相应的反应速度。从米氏方程可知：
04
当底物浓度很低时
05
<< Km,则 V≌Vmax[S]/Km ，反应速度
〔E〕〔S〕
〔ES〕
〔E〕〔I〕
〔EI〕
ki
解方程①②③得： 〔ES〕=
〔E〕t
（1 + ）＋1
Km
〔S〕
〔I〕
Ki
又因vi＝k3〔ES〕,代入上式得： Vi＝
（1 + ）＋〔S〕
Km
〔I〕
Ki
Vmax〔S〕
〔I〕
Ki
很多药物都是酶的竞争性抑制剂。例如磺胺药与对氨基苯甲酸具有类似的结构，而对氨基苯甲酸、二氢喋呤及谷氨酸是某些细菌合成二氢叶酸的原料，后者能转变为四氢叶酸，它是细菌合成核酸不可缺少的辅酶。由于磺胺药是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂，进而减少细菌体内四氢叶酸的合成，使核酸合成障碍，导致细菌死亡。抗菌增效剂-甲氧苄氨嘧啶(TMP)能特异地抑制细菌的二氢叶酸还原为四氢叶酸，故能增强磺胺药的作用。
生物化学 酶促反应动力学
酶的抑制作用
A.不可逆抑制
✓ 抑制剂与酶以共价键结合 ✓ 不能用透析、超滤方法除去抑制剂 ✓ 酶的修饰抑制
B.可逆抑制
✓ 抑制剂与酶以非共价键结合 ✓ 能用透析、超滤方法除去抑制剂，而使酶的活性恢复 ✓ 三种类型
①竞争性抑制
- 可以测定每一种底物（A或B）的Km，通过饱和[B]而改变[A]测定A的 KAm，和饱和[A]而改变[B]测定B的KBm
- BiBi反应的2种类型:
i) 序列反应：在任何产物释放之前，两种底物必须先结合到酶上
有序反应: 按照一定顺序前后结合两种底物和按前后顺序释放两种产物 随机反应: 两种底物与酶的结合及两种产物与酶的分离没有固定顺序
✓抑制剂与底物相似，可以竞争性地与酶的活性中心结合 ✓增加底物的浓度可以解除抑制
②非竞争性抑制
✓抑制剂与底物不相似，抑制剂是与活性中心外结合位点结合 ✓可形成酶-抑制剂-底物三元复合物
③反竞争性抑制
✓酶与底物先结合，然后再与抑制剂结合
可逆抑制与不可逆抑制的区别
[I]↑ [I]↑
v0
v0
v0
0
[E]
阴离子(少数) ➢Cl-等
有机小分子(少数) ➢胆汁酸盐等
酶促反应的中间络合物学说
1. 酶（E）的结合基团结合底物（S）形成酶-底物复合物（E-S）
E+S E-S
2. 酶的催化基团催化底物(S)形成产物(P)，E-S转变为E-P
E-S E-P
3. 酶的结合基团释放产物P，E-P形成E和P
E-P E + P
B.可逆抑制
✓ 抑制剂与酶以非共价键结合 ✓ 能用透析、超滤方法除去抑制剂，而使酶的活性恢复 ✓ 三种类型
第九章 酶促反应动力学
第九章酶促反应动力学（一）底物浓度对酶反应速率的影响用反应初速度v对底物浓度[S]作图得P355 图9-6。
曲线分以下几段：（1）OA段：反应底物浓度较低时v与[S]成正比，表现为一级反应， v = k[S]。
根据酶底物中间络合物学说，酶催化反应时，首先和底物结合生成中间复合物ES，然后再生成产物P，并释放出E。
E + S = ES →P + EOA段上，底物浓度小，酶未被底物饱和，有剩余酶，反应速率取决于ES浓度，与[S]呈线性关系，v正比于[S]。
（2）AB段：反应速度不再按正比升高，表现为混合级反应。
此时酶渐渐为底物饱和，[E S]慢慢增加，v也慢慢增加，为分数级反应。
（3）BC段：反应速度趋于V max，为零级反应，酶促反应表现出饱和现象。
此时底物过量[S]>[E],[E]已全部转为[E S]而恒定，因此反应速率也恒定，为最大反应速率，V max为[E]所决定。
非催化反应无此饱和现象。
酶与底物形成中间复合物已得到实验证实。
（二）酶促反应力学方程式（1）米氏方程推导1913年Michaelis和Menten提出并推导出表示[S]与v之间定量关系的米氏方程V max[S]V =K m + [S]Km：米氏常数，物理意义为反应速率为最大速率V max一半时底物的浓度，单位与底物浓度同。
推导：酶促反应分两步进行。
k1k3E + S ES →P + Ek2v = k3 [ES]一般k3为限速步骤v = k3 [ES] …①1.[ES] 生成速率：d[ES]/dt = k1([E] - [ES]) [S]2.[E S]分解速率：-d[ES] / dt = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3) [ES]3.稳态下[ES]不变，ES生成速率和分解速率相等：k1 ([E]- [ES]) [S] = (k2+k3) [ES]4.引入K m：令K m = k2+k3 / k1代入K m = ([E]- [ES]) [S] / [ES] ,K m [ES] = [E] [S]- [S] [ES], [ES] (K m + S) = [E] [S],[ES] = [E] [S] / K m+[S],5.代入①式：v = k3 [ES] = k3 [E] [S] / K m + [S] …②6.引入V max：为所有酶都被底物饱和时的反应速率，即此时[E]= [ES]V max = k3 [ES] = k3 [E]代入②式：v = V max [S] / K m + [S]米氏方程表示K m及V max已知时，v~[S]的定量关系。
酶促反应动力学
ES + I Ki ESI
E+P
非竞争性抑制的双倒数方程：
3. 反竞争性抑制作用
• 抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物(ES) 结合，使ES的量下降。这样，既减少从 ES转化为产物的量，也同时减少从ES解 离出游离酶和底物的量。
• 特点：Vmax和Km均降低。
E+S
ES + I Ki ESI
（三）Km值和Vmax值的测定
双倒数方程式： Km 1 1 1 + v = V Vmax max [S]
.
双倒数做图法： • 用于测Km值和Vmax值 • 用于判断可逆性抑制反应的性质
二、酶浓度对反应速度的影响
• 当[S]>>[E]时， [E]与v呈正比 关系。
三、温度对反应速度的影响
双重影响 • 最适温度：酶促反应速度最快时的环境 温度。 • 体内大多数酶的最适温度在35～40℃之 间。 • 最适温度不是酶的特征性常数。 • 低温不使酶破坏。
第三节
酶促反应动力学
研究的是酶促反应速度及其影响因素的 关系。 酶促反应速度：用单位时间内底物的 消耗量或产物的生成量表示 研究酶促反应动力学要采用初速度 初速度：反应速度与时间呈正比的阶 段。 反应10min. 或底物消耗在5%
影响因素： • 底物浓度（[S]） • 酶浓度（[E]） • 温度 • pH
1. 竞争性抑制作用
• 概念：抑制剂与酶的底物结构相似，可 与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶 与底物结合形成中间产物，而抑制酶的 活性。
E+S +
ES
E+P
I
Ki
v= EI
Vmax [S] Km (1+
第三章 酶促反应动力学(简)-1
例题3－1
6
二、单底物酶促反应动力学
单底物酶促反应动力学系指由一种 反应底物参与的不可逆反应。属于 此类反应的有酶的水解反应、异构 反应以及多数裂解反应。
7
中间络合物学说
100
ห้องสมุดไป่ตู้
在低底物浓度时, 反应速度与 底物浓度成正比，表现为一级 反应特征。 当底物浓度达到一定值，反应 速度达到最大值（Vmax ），此 时再增加底物浓度，反应速度 不再增加，表现为零级反应。 (酶浓度不变时)
ln( [ S ]0 [ S ]) [ S ]0 − [ S ]
VmaX Km
1 − KM
1 Vmax
t [ S ]0 − [ S ]
例3－2,3-3,3-4
24
根据米氏方程，结合t=0,[S]=[S]0的初值积 分得到 [ S ]0 Vmax t = ([ S ]0 − [ S ]) + K m ln [S ] [ S ]0 Km 1 引入转化率 χ s ⎯⎯ ⎯ ⎯ → t = ⎯ χs ln( )+ Vmax 1 − χ s Vmax
14
k +1 k +2 ⎯⎯→ ES ⎯⎯→ P + E E + S← ⎯⎯ k −1
米氏方程:
Vmax [ S ] v= K m + [S ]
米氏常数:
k −1 + k + 2 k+2 Km = = Ks + k +1 k +1
15
酶反应速度与底物浓度的 关系曲线
当[S] <<Km时
V=
V max [ S ] V max [ S ] = = K’S ] [ Km + [ S ] Km
酶促反应动力学笔记
酶促反应动力学目的：酶催化反应的速度及各种因素对反应速度的影响1.米氏方程的推导米氏学说是1913年Michaelis和Menton建立的，认为反应分为两步，先生成酶-底物复合物（中间产物），再分解形成产物，释放出游离酶。
经过Briggs和Haldane的补充与发展，得到了现在的米氏方程。
对于上面的反应，首先有三点假设：第一，底物大过量，即[S]》[E]。
第二，在反应初期，产物浓度极小，忽略逆反应即k-2=0；第三，稳态假设，即随着反应的进行，复合物的形成速度逐渐降低，分解加快，在某一时刻达到平衡，复合物的浓度为常数，这种状态称为“稳态”。
体系达到稳态后，底物的消耗和产物的生成速度都是常数，且相等。
经测定，酶加入体系后，在几毫秒之内即可达到稳态，所以我们测定的初速度通常是稳态速度。
在产物积累较多之前，体系一直保持稳态，所以反应速度v=k2[ES]。
根据稳态假设，有k1[E][S]=(k-1+k2)[ES]，即[ES]=k1[E][S]/(k-1+k2)。
定义(k-1+k2)/k1=Km，因为[E]=[E]0-[ES]，故[ES]= [E]0[S]/(Km+[S])。
代入速度方程，得到v= k2[E]0[S]/(Km+[S])。
因为当[ES]=[E]0时速度最大，所以Vm=k2[E]0。
代入，得到下列米氏方程：2.米氏常数的意义米氏常数的物理意义是反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。
其酶学意义在于，它是酶的特征常数，只与酶的性质有关，与酶浓度无关。
不同的酶其Km不同，同种酶对不同底物也不同。
在k2极小时1/Km可近似表示酶与底物的亲和力，1/Km越大，亲和力越大。
在酶的多种底物中，Km最小的底物叫做该酶的天然底物。
3.米氏常数的测定从酶的v-[s]图上可以得到Vm，再从1/2Vm处读出[s]，即为Km。
但实际上只能无限接近Vm，却无法达到。
为得到准确的米氏常数，可以把米氏方程加以变形，使它相当于线性方程，通过作图得到准确的米氏常数。
07-酶促反应动力学
17
(二)、可逆抑制和不可逆 抑制的动力学鉴别
加入一定量的抑制剂，以V～[E]作图
不可逆抑制剂：部分酶失活 原点右移， 斜率不变 当[E] > 不可逆抑制剂浓度 时能显现出酶的活性
可逆抑制剂：原点不变， 斜率下降
18
(三)、可逆抑制作用的动力学
1．竞争性抑制
底物、抑制剂和酶之间有如下平衡
S + E + I
ki2 ki1
k1 k2 k3
ES
P + E
k2 Km k1
ki 2 Ki ki1
EI Ki：抑制常数（inhibitor constant）
19
(三)、可逆抑制作用的动力学
溶液平衡时 [E] = [Ef ] + [ES] + [EI]
Arg127,Glu270,Tyr248,Zn2+
37
Ser48,His51,NAD+, Zn2+
4、活性中心位于酶表面的一个裂缝内
疏水微环境 使底物分子有效浓度很高 个别极性残基有利于催化作用
5、底物与酶通过弱相互作用结合
稳定酶与底物的结合
6、具有柔性
酶的活性中心易受影响
酶活性
一级序列决定三维结构 氨基酸残基提供了结构基础
Vmax [ S ] V Km [S ]
[S ] Km [S ] [S ] Km V Vmax Vmax Vmax Vmax
纵轴截距: Km/Vmax , 斜率: 1/ Vmax， 横轴截距: -Km
13
二、酶的抑制作用
能引起蛋白质失活的条件都影响酶的活力， 引致酶活性丧失的作用称为失活作用 抑制作用(inhibition)： 引起酶活力降低或丧失的现象 抑制剂(inhibitor)： 使酶发生抑制作用的物质
第9章 酶促反应动力学
第九章酶促反应动力学第一节化学动力学基础一、反应速率及其测定二、反应分子数和反应级数反应分子数反应级数三、各级反应的特征（一）一级反应其速率与反应物浓度的一次方成正比。
-dc/dt=kclnc=-kt+lnc0lnc=-kt+B（直线）K=(1/t)ln(c0/c)c=(1/2)c0时k=(ln2)/t1/2t1/2=(ln2)/k半衰期与反应物的初始浓度无关。
（二）二级反应反应的速率与反应物浓度的二次方成正比。
1．若A和B为同一物质-dc/dt=kc2，dc/c2=-kdt；c/c0=1/(1+kc0t)；c/c0=1/2时，k=1/c0t1/2。
2．A和B的初始浓度相同k=(1/t){x/[a(a−x)] }3．A和B的初始浓度不同k=[1/t(a−b)]/ln{[b(a−x)]/[a(b−x)]}a：反应物A的初始浓度。
b：反应物B的初始浓度。
(a-x)：反应时间为t时A的浓度。
(b-x)：反应时间为t时B的浓度。
（三）零级反应反应速率与反应物的浓度无关。
-dc/dt=k，或dx/dt=k。
X=kt，或k=x/t。
第二节底物浓度对酶反应速率的影响一、中间产物学说中间产物学说的实验依据：（1）核酸和酶的复合物可直接用电镜观察；（2）下图；（3）复合物的溶解度和稳定性有所变化；（4）有些复合物可直接分离得到。
酶催化的反应中各成份的变化：酶反应的速度在不停地变，实验上只有初速度的测定才有意义。
酶反应的初速度与底物浓度之间的关系：二、酶促反应的动力学方程式（一）米氏方程的推导米氏方程v=Vmax[S]/(Km+[S])符合v-[S]曲线。
若Km>>[S]，v=(Vmax/Km)[S]；若[S]>>Km，v=Vmax；由v=Vmax[S]/(Km+[S])，得Km=[S][(Vmax/v)-1]，为典型的双曲线方程。
（二）动力学参数的意义1．Km的意义a.Km值等于反应速度达最大反应速度一半时的底物浓度，单位是浓度单位，是酶的特征常数，酶对一定的底物只有一个特定的Km：V/2=V[S]/(Km+[S])，则Km=[S]。
酶促反应动力学实验知识讲解
酶促反应动力学实验酶动力学综合实验实验（一）——碱性磷酸酶值的测定【目的要求】1.了解底物浓度对酶促反应速度的影响2.了解米氏方程、值的物理意义及双倒数作图求值的方法。
【实验原理】1、碱性磷酸酶：碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多。
其次为肾脏、骨骼、肠和胎盘等组织。
但它不是单一的酶，而是一组同功酶。
本实验用的碱性磷酸酶是从大肠杆菌中提取的。
2、米氏方程：在研究底物浓度与酶促反应速度的定量关系时，导出了酶促反应动力学的基本公式，即：(1)式中：v表示酶促反应速度，表示酶促反应最大速度，[S]表示底物浓度，表示米氏常数。
3、值的测定主要采用图解法，有以下四种：①双曲线作图法（图1-1，a）根据公式（1），以v对[s]作图，此时1/2时的底物浓度[s]值即为值，以克分子浓度（M）表示。
这种方法实际上很少采用，因为在实验条件下的底物浓度很难使酶达到饱和。
实测一个近似值，因而1/2不精确。
此外由于v对[S]的关系呈双曲线，实验数据要求较多，且不易绘制。
②作图法双倒数作图法（图1-1，b）实际工作中，常将米氏方程（式（1））作数学变换，使之成为直线形式，测定要方便、精确得多。
其中之一即取（1）式的倒数，变换为方程式：(2)以对作图，即为形式。
此时斜率为，纵截距为。
把直线外推与横轴相交，其截距相交，其截距即为—。
③作图法（略）把（2）式等号两边乘以，得：(3)以v对作图，这时斜率为，纵截距为，横截距为。
④作图法（略）把（2）式等号两边乘以[S],得：(4)以对[s]作图，这时斜率为，纵截距为。
（a）(b)本实验主要以双倒数法，即作图法来测定碱性磷酸酶值。
具体原理如下：本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，在适宜条件下（10.0，和60℃），准确反应13分钟。
在碱性条件下酚可与酚试剂生成蓝色化合物，以波长620比色。
在一定条件下色泽深浅与光密度成正比。
酶促反应动力学实验
实验 酶促反应动力学—-—-蔗糖酶米氏常数的测【目的要求】1．了解酶促动力学研究的范围。
2．以蔗糖酶为例，掌握测定米氏常数（Km ）【实验原理】在酶促反应中，当反应体系的温度、pH 和酶浓度恒定时，反应初速度（v ）则随底物 浓度[S ］的增加而加速,最后达到极限,称为最大反应速度（v)。
Michaelis 和Menten 根据反应速度与底物浓度的这种关系，推导出如下方程：][][S k S V v m +=此式称为米氏方程，式中Km 称为米氏常数，按此方程，可用作图法求出Km 。
方法有： 1．以v[S ］作图由米氏方程可知,v=V ／2时,Km ＝［S]即米氏常数值等于反应速度达到最大反应速度一半时所需底物浓度。
因此,可测定一系列不同底物浓度的反应速度v,以v 对[S]作图。
当v ＝V ／2时，其相应底物浓度即为Km 。
2．以1／v 对1／［S ］作图取米氏方程的倒数式：VS V k v m 1][11+•=以1／v 对1／[S]作图可得一直线，其斜率为Km ／V ，截距为1/V .若将直线延长与横轴相交，则该交点在数值上等于—l ／Km.本实验以蔗糖为底物．利用一定量蔗糖酶水解不同浓度蔗糖所形成的产物(葡萄糖和果糖）的量来计算蔗糖酶的Km 值。
葡萄糖和果糖能与3，5—二硝基水杨酸试剂反应,生成桔红色化合物，可于520nm 处比色测定之.【试验材料】 1．试剂(1)标准葡萄糖溶液：准确称取100mg 葡萄糖溶于少量饱和的苯甲酸溶液（0。
3%)，再转移到100ml容量瓶中,用饱和苯甲酸溶液稀释到刻度，混匀，即得浓度为1mg／m1的标准葡萄糖溶液。
冰箱贮藏可长期保存；（2）pH4.5的0。
1mol/L醋酸缓冲液：取lmol/L醋酸钠溶液43m1及lmol／L醋酸溶液57m1，稀释至1000m1即得;(3)pH4.5的10％蔗糖溶液:准确取l0g蔗糖溶于少量pH4.5的0。
1mol／L醋酸缓冲液,转移到100ml容量瓶中,用同样缓冲液稀释到刻度备用；(4)3,5-二硝基水杨酸试剂:溶液I：4.5%NaOH溶液300m1,1％3，5一二硝基水杨酸溶液880m1及酒石酸钾钠（KNaC4O6·4H20）255g三者一起混合均匀。
第7章 酶促反应动力学
符合一级反应动力学，酶未被全部饱和，因此在[S]低时不能 正确测得酶活力； （2）当[S]>>Km时，v=Vmax，此条件下可正解测得酶活力 （3）当[S]=Km时，v=Vmax/2
Km的意义
1、Km是酶的特征物理常数 Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关，但与底物、 温度、pH及离子强度有关。 2、Km可判断酶的专一性和天然底物 Km最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。1/km近似 表示酶与底物的亲和力。 3、当k3<<k2时，Km=k2/k1，Km=Ks（解离常数），严格 地说是1/Ks表示酶与底物的亲和力，当k3极小时，1/Km才 表示酶与底物的亲和力。
二、酶的抑制作用
➢ 酶的失活与抑制的区别 ➢ 酶抑制程度的表示方法 ➢ 酶抑制作用的类型 ➢ 可逆与不可逆抑制作用的鉴别 ➢ 可逆抑制作用动力学 ➢ 一些重要的抑制剂
（一）酶的失活与抑制的区别
凡是使酶蛋白质变性而引起酶活力丧失的作用称为失 活作用；由于酶必需基团化学性质的改变，但酶未变 性，而引起酶活力的降低或丧失而称为抑制作用。 变性剂对酶的变性作用无选择性 抑制剂对酶的抑制作用有选择性
特点：
A.抑制剂结构与底物的分子结构不相似。 B.抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合。 C.抑制作用的强弱取决于[I]，不能通过增加[S]减弱或解 除抑制。 D.Vmax降低，Km不变。
酶的可逆抑制作用——反竞争性抑制
酶只有与底物结合后才能与抑制剂结 合。L-Phe，L-Arg等对碱性磷酸酶的 作用是反竞争性抑制，肼类化合物抑 制胃蛋白酶、氰化物抑制芳香硫酸酯 酶的作用也属此类。
抑制剂只与酶—底物复合物结合生成抑制 剂—酶—底物死端复合物（ESI），从而抑 制酶的活性。
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为解释酶被底物饱和现象，Michaelis和 Menten做了大量的定量研究，积累了足够的实验 数据，提出了酶促反应的动力学方程：
S E k1 ES k2 P E
S Et ES
k1
ES
[ES]生成速度：v1 k1Et ES S ，[ES]分解速度：v2 k1ES k2ES
三. pH对酶促反应速度的影响
大多数酶的活性受 pH 影响显著，在某一 pH 下 表现最大活力，高于或低于此pH，酶活力显著下降。 酶表现最大活力的pH称为酶的最适 pH(optimumpH pHm)。典型的酶速度-pH曲线 是较窄的钟罩型曲线，但有的酶的速度-pH曲线并 非一定呈钟罩型。如胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的速度pH曲线。
Et S Km S
(1)
由于酶促反应速度由[ES]决定，即 v k2 ES
，所以 ES v (2)
k2
将（2）代入（1）得：
v k2
Et S Km S
v
k2Et S Km S
(3)
当[Et]=[ES]时， v Vm
所以 Vm k2 Et
3. Km在实际应用中的重要意义 （1）鉴定酶：通过测定可以鉴别不同来源或相同来源但在不同发育阶段、 不同生理状态下催化相同反应的酶是否属于同一种酶。
（2）判断酶的最佳底物：如果一种酶可作用于多个底物,就有几个Km值， 其中Km最小对应的底物就是酶的天然底物。如蔗糖酶既可催化蔗糖水解 (Km=28mmol/L),也可催化棉子糖水解(Km=350mmol/L),两者相比， 蔗糖为该酶的天然底物。
胃蛋白酶的速度-温度曲线如下图：
胃蛋白酶和葡萄糖-6-磷酸酶的pH活性曲线 ：
pH对酶促反应速度的影响机理： 1、pH影响酶和底物的解离: 酶的活性基团的解离受pH影响，底物有的也能 解离，其解离状态也受pH的影响，在某一反应pH下，二者的解离状态最有 利于它们的结合，酶促反应表现出最大活力，此pH称为酶的最适pH；当反 应pH偏离最适pH时，酶促反应速度显著下降。
2.米氏常数的意义
（1）. 物理意义： Km值等于酶反应速度为最大速度一半时的底物浓度。
（2）. Km 值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈 大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反 应速度。
（3）. Km 值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应 条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同， Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km 值也不同。各种酶的 Km 值范 围很广，大致在 10-1～10-6 M 之间。
当酶反应体系处于恒态时： v1 v2
即： k1Et ESS k1ES k2ES
Et
S ES ES
S
k1 k1
k2
令： k1 k2 Km k1
则：KmES ESS Et S
经整理得： ES
2、pH影响酶分子的构象：过高或过低pH都会影响酶分子活性中心的构象， 或引起酶的变性失活。
动物体内多数酶的最适pH值接近中性，但也有例外，如胃蛋白酶的最适pH约 1.8，肝精氨酸酶最适pH约为9.8(见下表)。
一些酶的最适pH
四、 底物浓度对反应速度的影响 1、酶反应与底物浓度的关系
1902年，Henri用蔗糖酶水解蔗糖的实验中观 察到：在蔗糖酶酶的浓度一定的条件下测定底物 （蔗糖）浓度对酶 反应速度的影响, 它们之间的 关系呈现矩形双曲线(rectangular hyperbola)。 如下图所示：
在底物浓度很低时，反应速度随底物浓度的增 加而急骤加快，两者呈正比关系，表现为一级反 应。随着底物浓度的升高，反应速度不再呈正比 例加快，反应速度增加的幅度不断下降。如果继 续加大底物浓度，反应速度不再增加，表现为零 级反应。此时，无论底物浓度增加多大，反应速 度也不再增加，说明酶已被底物所饱和。所有的 酶都有饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度 各不相同而已。
酶浓度对速度的影响机理：酶浓 度 增 加 ， [ES] 也 增 加 ， 而 V=k3[ES]，故反应速度增加。
二. 温度对酶促反应速度的影响
酶促反应与其它化学反应一样，随温度的增加，反应速度加快。化学反应 中温度每增加10℃反应速度增加的倍数称为温度系数Q10。一般的化学反应 的Q10为2～3，而酶促反应的Q10为1～2。
在一定范围内，反应速度达到最大时对应的温度称为该酶促反应的最适温
度（optimum temperature Tm）.一般动物组织中的酶其最适温度为35～
40℃，植物与微生物中的酶其最适温度为30～60℃，少数酶可达60℃以上， 如细菌淀粉水解酶的最适温度90℃以上。
温度对酶促反应ห้องสมุดไป่ตู้度的影响机理：
3.4 酶促反应动力学
酶促反应动力学
酶促反应动力学(kinetics of enzymecatalyzed reactions)是研究酶促反应速度 及其影响因素的科学。酶促反应的影响因素 主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、 抑制剂和激活剂等。
一. 酶浓度的影响
在一定温度和pH下，酶促反应 在底物浓度大于100 Km时，速度 与酶的浓度呈正比。
1. 温度影响反应体系中的活化分子数：温度增加，活化分子数增加，反应 速度增加。
2. 温度影响酶的活性：过高的温度使酶变性失活，反应速度下降。
最适温度不是酶的特征常数，因为一种酶的最适温度不是一成不变的， 它要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂、酶反应时间等因素的影响。 因此，酶的最适温度与其它反应条件有关。
(4)
将（4）代入（3），则：
v
Vmax S Km S
Vmax指该酶促反应的最大速度，[S]为底 物浓度，Km是米氏常数，V是在某一底物浓 度时相应的反应速度。从米氏方程可知：
当底物浓度很低时 [S] << Km,则 V≌Vmax[S]/Km ，反应速度 与底物浓度呈正比; 当底物浓度很高时， [S]>> Km ，此时V≌Vmax ，反应速度达最大 速度，底物浓度再增高也不影响反应速度。