生物物质分离工程

生物物质分离工程实验

李菊娣 编

辽宁石油化工大学环境工程系

二○○七年三月

生物物质的分离、提取实验是以实验操作为主的技能课程，是生物工程专业学生的必修课，是在学习《分析化学》、《生物化学》《微生物学》、《发酵工程》、《生物分离工程》等专业基础课及专业实验课的基础上开设的课程。目的在于通过本课程的实验训练，使学生对整个生物工程下游生产过程有一个全面的认识和理解，既可培养他们实际操作的技能，又可达到提高他们理论联系实际能力的目的。通过学习，使学生能够掌握物质分离常用的纯化方法和常见的分离设备，为以后的学习和科研工作打下良好的基础。

实验一、微生物细胞的破碎及分离

实验二、青霉素的萃取及萃取率的计算

实验三、醋酸丁酯萃取红霉素

实验四、牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备

实验五、胰凝乳蛋白酶的制备

实验六、薄层色谱法鉴定果汁中的糖

实验七、离子交换法提取L-精氨酸

备注：实验二、三选作其一；实验五、六选作其一。

实验一 微生物细胞的破碎及分离

一、实验目的与要求

实验目的：

1、掌握超声波细胞破碎的原理和技术，学习细胞破碎率的评价方法。

2、通过本试验使学生复习以前所学的分离知识及掌握微生物学实验、发酵工程实验技能，同时通过本试验使学生掌握超声波破碎仪的使用。

3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题的能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究打好基础。

实验要求：

1、复习生物物质分离课程所学到的微生物细胞的分离方法，了解影响微生物细胞的破碎因素。

2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。

3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分析实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。

4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。

二、实验原理、内容

频率超过15-20 kHZ的超声波，在较高的输入功率下（100-250W）可破碎细胞。其工作原理是：超声波细胞粉碎机由超声波发生器和换能器两个部分组成。超声波发生器是将220V、50Hz的单相电通过变频器件变为20-25Hz、约600V的交变电能，并以适当的阻抗与功率匹配来推动换能器工作，做纵向机械振动，振动波通过浸入在样品中钛合金变副杆对破碎的各类细胞产生空化效应，从而达到破碎细胞的目的。

三、实验主要仪器设备和材料

超声波细胞破碎机、显微镜、酒精灯、载玻片、血球计数板

接种所需材料

1、酵母细胞悬浮液：0.2g/ml 的啤酒酵母溶于50mmol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH=4.7）。

2、土豆培养基：土豆（去皮切块）200g；琼脂20g；蔗糖20g；蒸馏水1000ml。选优质土豆去皮切块，加水煮沸30min，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补充加水至1000ml,粉状，115℃灭菌20min。

四、实验方法、操作步骤

1、啤酒酵母的培养：

菌种纯化：酵母菌种转接至斜面培养基上，28-30℃下，培养3-4d，培养成熟后，用接种环取一环酵母菌至8ml液体培养基中，28-30℃下，培养24h。

扩大培养：将培养成熟的8ml液体培养基中的酵母菌全部转接至含80ml液体培养基的三角瓶中，28-30℃下，培养15-20h。

2、取1ml酵母细胞悬浮液经适当稀释后，用血球计数板在显微镜下计数。

将80ml酵母细胞悬浮液放入100ml容器中，液体浸没超声发射针1cm，打开开关，将频率钮设置至中档，超声破碎1min，间歇1min,破碎20次。

取1ml破碎后的细胞悬浮液经适当稀释后，滴一滴在血球计数板上，盖上盖玻片，用显微镜进行观察、计数。计算细胞破碎率。

3、破碎后的细胞悬浮液，于12000r/min、4℃离心30min，去除细胞碎片。用Lowry 法检测上清液蛋白质含量（具体方法见附件一）。

五、实验结果与讨论

用显微镜观察细胞破碎前后的形态变化。

用两种方法对细胞破碎率进行评价：一种是直接计数法，对破碎后的样品进行适当稀释后，通过在血球计数板上用显微镜观察来实现细胞的计数，从而计算出破碎率；另一种是间接计数法，将破碎后的细胞悬浮液离心分离掉固体（完整细胞和碎片），然后用Lowry法测量上清液中的蛋白质含量，也可以评价细胞的破碎程度。

六、实验报告记载要求

1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间

2、实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。

实验二 青霉素的萃取与萃取率的计算

一、实验目的与要求

实验目的：

1、掌握有机溶剂萃取抗生素的原理和技术，学习液液萃取设备的结构和特点，掌握碘量法测定青霉素含量的方法，并能够计算出青霉素的萃取率。

2、通过本试验使学生复习以前所学的萃取知识及分析化学知识、掌握分离工程实验技能，同时通过本试验使学生熟练掌握萃取设备的使用。

3、通过按照给定的研究题目，独立的进行试验，并观察试验中的各种现象，分析总结实验得出的各种数据并撰写相应的研究及实验报告等各过程，来培养学动手能力和独立分析问题能力，并了解学习科学研究的基本过程与要求，提高科学研究的素质，为将来从事科学研究作好基础。

实验要求：

1、复习生物物质分离课程所学到的萃取分离方法，了解影响萃取过程中的因素。

2、独立查阅相关资料，设计实验方案，并对实验所需的各种药品、玻璃仪器及分析设备列出清单，写出详尽的试验过程及需要。

3、三人一组，互相配合，开展实验，动手完成实验，并记录并分实验中的实验现象、数据，必要时及时修改试验计划。

4、总结试验数据，经教师认定后，撰写实验报告。

二、实验原理、内容

萃取过程是利用混合物在两种不相混溶的液相中各种组分溶解度的不同，从而达到分离的目的。当pH=2.3时，青霉素在乙酸乙酯中比在水中溶解快，因而可以将乙酸乙酯加到青霉素混合液中，并使其充分接触，从而使青霉素被萃取浓集到乙酸乙酯中，达到分离提纯的目的。青霉素分子本身不消耗碘，其降解产物消耗碘，青霉素经碱水解生成的青霉噻唑酸可与碘作用，根据消耗的碘量可计算青霉素含量，条件是pH=4.5，温度在20-25度之间。

三、实验主要仪器设备和材料

分液漏斗、电子天平、酸式滴定管、碘量瓶、pH试纸

硫代硫酸钠、碘化钾、醋酸缓冲液、淀粉指示剂、乙酸乙酯、K2Cr2O3

四、实验方法、操作步骤

1、硫代硫酸钠的标定

取K2Cr2O3 0.15g于碘量瓶中，加入50ml水，使之溶解，再加入碘化钾2g，溶解后加入稀硫酸40ml，摇匀，密塞，在暗处放置10分钟。取出后再加水250ml稀释，用硫代硫酸钠