【珍藏版】质粒提取中的原理
质粒提取与分析 Protocol
质粒提取与分析是分子生物学实验中的基本技术之一，它是从细菌中提取和纯化质粒DNA，并对质粒DNA进行相关的分析和检测。
下面是质粒提取与分析的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理质粒是一种独立于细菌染色体之外的DNA分子，它不参与细胞的染色体复制，而是在细胞分裂时进行自我复制。
质粒提取的原理是通过物理和化学方法裂解细菌，释放出质粒DNA，然后通过离心、沉淀和洗涤等步骤将质粒DNA与细菌其他成分分离，最终得到纯化的质粒DNA。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o溶液Ⅰ：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）、50mmol/L葡萄糖。
o溶液Ⅱ：0.1mol/L NaOH、1% SDS。
o溶液Ⅲ：3mol/L醋酸钾、20mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）。
o70%乙醇。
o TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）、1mmol/L EDTA （pH=8.0）。
2.耗材：o移液器。
o离心管和离心管盖。
o 1.5ml微量移液器。
o无菌水。
o0.22μm滤膜。
o培养板和涂布器。
o细菌培养液（如LB液体培养基）。
o氯仿。
o异戊醇。
三、实验仪器1.实验室搅拌器。
2.高速冷冻离心机。
3.水浴锅。
4.无菌工作台或超净工作台。
5.紫外线分光光度计。
6.电泳仪和电泳槽。
7.显微镜。
8.恒温摇床或振荡器。
9.烘箱或微波炉。
10.量筒和烧杯。
11.计时器。
12.手套和实验服。
四、准备工作1.阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等。
6.设置离心机的高速和低速离心参数，以及水浴锅的温度等参数。
质 粒 提 取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤--（二）一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
质粒提取总结(原理、小提、中提、浓度测定)
如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
质粒小提
质粒小提（这里试剂盒没有柱平衡步骤）：
1、大离心管4000rpm离心5min，吸除上清；
2、每5ml菌液、加入250μlP2，上下颠倒6-8次，温和，＜5min；
4、加入350μlP3，上下颠倒6-8次，温和；12000rpm离心10min；
5、取上清，加到柱子里，12000rpm离心2min，弃废液；
6、加入去蛋白液HB 500μl，12000rpm离心1min，弃废液；
7、加入75%乙醇700μl，12000rpm离心1min，弃废液；
8、重复上一步；
9、空离一次，12000rpm离心2min，弃收集管；
10、晾干；
11、加ddH2O溶解，放2min，12000rpm离心2min。
注意：如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
3、向离心管中加入250μl溶液P1（先检查是否加入RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；
质 粒 提 取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
质粒提取试剂盒原理
质粒提取试剂盒原理
质粒提取试剂盒是一种用于提取质粒DNA的试剂盒，其原理是利用离心、溶解、吸附、洗脱等步骤将目标DNA从细胞裂解液中分离出来。
下面将详细介绍质
粒提取试剂盒的原理及各个步骤的作用。
首先，细菌裂解液中的细胞膜和细胞壁会被破坏，使得细胞内的质粒DNA暴
露出来。
接着，加入试剂盒中的一种缓冲液，能够使DNA和其他细胞成分分离开来，使得DNA能够在后续步骤中被提取出来。
然后，通过离心将细胞碎片和其他
杂质沉淀到管底，上清液中的DNA得以分离。
接下来，将上清液加入试剂盒提供
的柱子中，DNA会在柱子上被特定的材料吸附住，而其他杂质则会被洗脱掉。
最后，用洗脱缓冲液将DNA从柱子上洗脱下来，得到纯净的质粒DNA。
质粒提取试剂盒的原理是基于DNA的物理性质和化学性质，通过不同步骤的
组合实现对质粒DNA的高效提取。
在整个提取过程中，试剂盒提供的各种缓冲液
和柱子起着至关重要的作用，能够使DNA得以分离和纯化。
这种原理简单而高效，适用于从各种细菌中提取质粒DNA，为后续的分子生物学实验提供了可靠的DNA
样本。
总的来说，质粒提取试剂盒的原理是通过细胞裂解、DNA分离、DNA吸附、
洗脱等步骤，将目标DNA从细胞裂解液中提取出来。
这种原理简单易行，操作方便，适用于实验室中的质粒DNA提取工作。
希望通过本文的介绍，能够让大家对
质粒提取试剂盒的原理有一个更加清晰的认识，为实验工作的顺利开展提供帮助。
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA 分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
一、试剂准备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl[t1] (pH 8.0）12.5ml，0.5M EDTA（pH 8.0）10ml，葡萄糖4.730g，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
50 mM葡萄糖最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
质粒提取原理
质粒提取原理质粒提取是分子生物学实验中常见的操作，其原理主要是利用离心、溶解、沉淀等方法将目标质粒从细菌中提取出来，为后续的实验操作提供必要的材料基础。
下面将详细介绍质粒提取的原理及相关操作步骤。
一、离心法。
离心法是质粒提取的基础步骤之一，其原理是通过高速离心使得细菌细胞和质粒分离。
首先，将含有目标质粒的培养基液体培养物进行离心，使得细菌细胞被沉淀到离心管底部，上清液中则含有目标质粒。
接着，将上清液转移至新的离心管中，再次进行离心操作，将残余的细菌细胞去除，得到含有目标质粒的上清液。
二、溶解法。
溶解法是质粒提取的另一关键步骤，其原理是通过特定的溶解液将目标质粒从细菌细胞中释放出来。
一般情况下，利用含有EDTA和蛋白酶K的溶解液对细菌细胞进行裂解，使得细菌细胞壁和膜被破坏，质粒得以释放。
此时，目标质粒已经被释放到溶解液中，为后续的纯化操作做好准备。
三、沉淀法。
沉淀法是质粒提取的最后一步，其原理是通过加入盐类或醇类使得目标质粒沉淀到溶液底部，从而实现质粒的分离和纯化。
一般情况下，将加入盐类或醇类的溶液与目标质粒混合后，通过离心将质粒沉淀到离心管底部，上清液中则含有杂质和其他不需要的物质。
最后，将上清液倒掉，得到沉淀的质粒，即可用于后续的实验操作。
综上所述，质粒提取的原理主要包括离心、溶解和沉淀三个步骤。
通过这些操作，可以有效地将目标质粒从细菌中提取出来，并得到相对纯净的质粒样品，为分子生物学实验提供了重要的基础材料。
在实际操作中，需要严格按照操作步骤进行操作，并注意操作中的细节，以确保提取到高质量的质粒样品。
希望本文介绍的质粒提取原理能够对相关实验工作有所帮助。
提取质粒原理
提取质粒原理
质粒是一种小型的环状DNA分子，存在于细菌和其他一些微
生物中。
质粒的基本结构由起始点、复制起始启动子、多个基因以及其他调控元素组成。
其中，起始点是质粒复制的起点，复制起始启动子是质粒复制的启动信号。
质粒中的基因可以包括抗生素抗性基因、代谢途径基因、毒力基因等。
质粒的复制过程可以通过转座酶介导的侵入、插入复制和滚环复制等多种方式实现。
其中，插入复制是最为常见的方式之一。
插入复制是指质粒在细胞分裂过程中，通过拷贝DNA片段并
将其插入到另一个质粒中实现复制。
这种复制方式使得质粒能够在细菌中快速传播，这也解释了为什么质粒往往携带有抗生素抗性基因。
质粒的传播也可以通过水平转移实现。
水平转移是指质粒从一个细胞中传递到另一个细胞中，从而在细菌间传播。
水平转移是质粒传播的主要机制之一，并被广泛应用于基因工程和遗传学研究中。
总的来说，质粒是细菌和其他微生物中常见的一种DNA分子，通过复制和水平转移等方式在细菌间传播，携带有多种基因，包括抗生素抗性基因等。
质粒在生物学研究和基因工程中具有重要的应用价值。
质粒提取过程中的各溶液成分及作用原理
溶液3（P3、S3、N3）
主要成分： 3M 醋酸钾（potassium acetate），5M 醋酸
溶液3的主要作用是中和第二步加入的强碱以及清除掉蛋白质等细胞内的杂 质。强碱溶液氢氧化钠长时间与DNA基础会破坏其结构，因此需要进行中 和。中和氢氧化钠，5 M醋酸就足够了，为何又要加入醋酸钾呢？做过质 粒提取实验的同学应该记得，在加入溶液3后，会有大量沉淀出现。这些沉 淀其实醋酸钾与溶液2中的SDS相互作用，反应生成的十二烷基硫酸钾 （PDS）。加入溶液3后，SDS遇到钾离子，生成PDS不溶于水，会迅速发 生沉淀。
质粒提取过程中的各溶液成分及 作用原理（碱裂解法提质粒）
写于20150701
溶液1（P1、S1）
主要成分： 25 mM Tris-HCl（pH8.0），10 mM EDTA，50 mM 葡糖糖（Glucose） 溶液1也可以不含葡萄糖。
溶液1的主要作用是将菌体沉淀悬浮起来。25mM Tris-HCl是缓冲溶液， 保证反应体系的pH恒定。EDTA是金属离子螯合剂，10 mM EDTA的作 用是与微生物体内的金属离子相互结合，抑制DNase的活性。50 mM葡 萄糖的作用是增加溶液的粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉降的时间。 溶液1在使用前通常要加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚， 降解掉溶液中的RNA。由于RNA酶属于蛋白质，蛋白质稳定性很差，所 以加了RNase A的溶液1需要低温4℃保
主要成分：10 mM Tris-HCl （pH 7.5）或者ddH2O
EB的作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。Elution buffer中不能含 有过高浓度的盐离子，因为在高盐环境中，盐阳离子会打破硅胶负 氧根和水之间的氢键，使得整体的硅胶携带正电，会吸引携带负电 的DNA分子。另外，加热过的洗脱液（<50°C）可以加速DNA从 硅胶膜上脱离下来。另外，离心前保持EB缓冲液在膜上停留时间 长一些，将更有利于DNA的洗脱。 ddH2O的洗脱效率较低，可以 在第一次洗脱后，将洗脱液重新加到硅胶柱上进行第二次洗脱。
质 粒 提 取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
质粒提取的原理
质粒提取的原理
质粒提取是一种通过物理吸附技术从混合样本中提取出特定质粒的方法。
它主要用于细胞培养、分子生物学、化学和其他科学研究中，可以用来提取DNA、RNA、蛋白质或其他活性物质。
质粒提取的原理是通过物理吸附技术来提取特定质粒。
它包括质粒的分离、洗涤、回收和提取。
其中，质粒分离是利用质粒的大小、结构和特性将质粒分离出来，以便进行洗涤和回收。
洗涤是指将质粒和其他杂质分离开来，有助于消除样品中的杂质，提高提取效率。
回收是指将洗涤后的质粒再次回收到容器中，以便进行提取操作。
而提取操作是利用特定的试剂将质粒从洗涤液中提取出来，以获得高纯度的质粒。
质粒提取技术有助于科学家从细胞或混合样本中提取DNA、RNA、蛋白质等有价值的质粒，从而可以进行进一步的研究。
它的优点在于：1）操作过程简单，可以在实验室进行无污染的提取；2）可以有效提取大量样本，提高提取效率；3）可以获得高纯度的质粒，在分子水平上更易于检测。
质粒提取技术已经成为生命科学研究中一种重要的技术手段，可以用来提取DNA、RNA、蛋白质等有价值的质粒，从而实现科学家对细胞培养、分子生物学、化学和其他科学研究的研究目标。
它可以有效的提取大量样本，从而更加方便实验，提高实验效率，提供高
纯度的质粒用于更深入的分子研究。
质粒提取原理
质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
分离质粒DNA有三个步骤:
培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细菌，分离和纯化质粒DNA。
在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等的原因，可能使质粒DNA链发生断裂。
所以，多数质粒粗提取物中含有三种构型的质粒:共价闭合环状
DNA(cccDNA): 质粒的两条链没有断裂;超螺旋开环DNA(ocDNA): 质粒的一条链断裂;松弛的环状分子线形DNA(lDNA): 质粒的两条链均断裂;线性分子质粒DNA的分子构型。
质粒DNA琼脂塘凝胶电泳模式图可分为:松弛线性的DNA; 松弛开环的OC构型; 超螺旋的SC构型。
由于琼脂糖中加有嵌入型染料溴化乙锭，因此，在紫外线照射下DNA电泳带成橘黄色。
道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA则位于凝胶的最后边;道中的L DNA 是经核酸内切限制酶切割质粒之后产生的，它在凝胶中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之间。
质粒抽提原理
质粒抽提原理质粒抽提是分子生物学实验中常见的一项操作，它是指从细菌中提取质粒DNA的过程。
质粒是一种环状的DNA分子，存在于细菌细胞质中，可以携带一些特定的基因信息。
在分子生物学研究中，我们常常需要从细菌中提取质粒DNA，以进行进一步的实验操作，比如重组DNA、转染等。
因此，了解质粒抽提的原理对于分子生物学实验是非常重要的。
质粒抽提的原理主要包括菌液培养、细胞裂解、质粒分离和纯化等步骤。
首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在含有抗生素的培养基中，使得只有携带目标质粒的细菌能够生长。
接着，通过离心等手段，将细菌进行收集和洗涤，然后进行细胞裂解，使得细菌细胞壁破裂，释放出细胞质中的DNA。
在细胞裂解后，我们需要通过离心等手段，将质粒DNA与细胞壁碎片、蛋白质等其他杂质分离开来。
最后，通过酚-氯仿提取、离心、乙醇沉淀等步骤，将质粒DNA纯化出来，得到我们所需要的目标DNA。
在质粒抽提的过程中，有几点需要特别注意。
首先，细菌的培养条件需要严格控制，保证细菌的生长和目标质粒的复制。
其次，细胞裂解需要选择合适的方法和试剂，以确保细胞壁能够完全破裂，并且不会对DNA造成损伤。
最后，在质粒DNA的纯化过程中，需要严格控制温度、pH值等条件，以保证DNA的稳定性和纯度。
总的来说，质粒抽提是一项重要的分子生物学操作，它为我们提供了获取目标DNA的重要手段。
通过对质粒抽提原理的深入了解，我们可以更好地进行分子生物学实验，并且为基因工程、生物技术等领域的研究提供有力支持。
希望通过本文的介绍，读者能够对质粒抽提原理有一个清晰的认识，从而在实验操作中能够更加熟练地进行相关操作，提高实验效率和结果的准确性。
质 粒 提 取 原理及步骤
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pB R322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
质粒DNA的提取
质粒DNA的提取一、原理采用碱变性发抽提取质粒DNA。
该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。
在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。
质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。
而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
二、方法1.挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
2.将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。
反复数次，收集全部菌体。
3.倾去上清，滤纸吸干。
4.加30μlTE缓冲液（10mmol/L Tris—HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
5.加30μlTENS溶液（10mmol/L Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L EDTA,0.1mol/LNaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
6.加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
7.上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
8.上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
9．倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
10．倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
lI．加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
12，加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
提取质粒原理
提取质粒原理质粒是一种存在于细菌和酵母等微生物细胞内的可自主复制的DNA分子，是重要的基因工程载体。
提取质粒是基因工程中常见的操作步骤，其原理主要包括细菌培养、DNA提取、酶切、连接等多个环节。
首先，进行细菌培养。
在进行质粒提取前，首先需要进行细菌培养，将含有目标质粒的细菌菌落接种到含有适当抗生素的培养基中，进行培养。
培养的条件包括温度、pH值、氧气含量等，需要根据具体的细菌菌株来确定最适合的培养条件。
其次，进行DNA提取。
DNA提取是提取质粒的关键步骤，可以利用化学方法或商用DNA提取试剂盒进行提取。
在提取过程中，需要注意保护DNA不受到外界的污染和降解，以保证提取的DNA质量。
接着，进行酶切。
酶切是利用限制性内切酶对目标DNA进行特异性切割，得到所需的DNA片段。
在酶切过程中，需要根据酶切位点设计合适的引物，控制酶切反应的条件，以确保酶切的准确性和高效性。
然后，进行连接。
连接是将目标DNA片段与质粒进行连接，形成重组质粒。
连接的方法包括经典的T4 DNA连接酶法和无酶法连接等，需要根据实验的具体要求选择合适的方法。
最后，进行质粒鉴定。
鉴定提取的质粒是否包含目标DNA片段，可以通过PCR扩增、酶切鉴定、测序等方法进行验证。
鉴定结果的准确性直接影响后续的实验操作和研究结果的可靠性。
在实际操作中，提取质粒需要严格控制每个步骤的条件和操作，以确保提取的质粒具有高纯度、高浓度和高活性。
同时，需要根据实验的具体要求和目的，选择合适的提取方法和工具，以提高提取效率和成功率。
总之，提取质粒是基因工程中重要的操作步骤，其原理包括细菌培养、DNA提取、酶切、连接和鉴定等多个环节。
掌握提取质粒的原理和操作技巧，对于开展基因工程研究和应用具有重要的意义。
质粒提取的原理1
质粒提取的原理1质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb 以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA 的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA 已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合。
5、加入0.2ml溶液II（0.2 mM/L NaOH，1％SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min .6、加入0.15m1预冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min .7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min.9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
质粒提取的原理1
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，下面主要介绍碱裂解法提取质粒DNA的方法。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH 和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。
碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37℃振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I（1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0）充分混合。
5、加入0.2ml溶液II（0.2 mM/L NaOH，1％SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min .6、加入0.15m1预冷溶液III（5 mol/L KAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min .7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min.9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
细菌质粒提取原理及步骤(精)
质粒提取原理及步骤一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA ，这些方法都含有以下3个步骤：1. 细菌培养物的生长。
2. 细菌的收获和裂解3. 质粒DNA 的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA 。
然而，较长一代的载体(如pB R322 由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR ３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA 量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA 的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1 大质粒(大于15kb 容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA 进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS 一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
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1．溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。
当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。
葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNa se作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。
2．溶液II－NaOH－SDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS：SDS是离子型表面活性剂。
它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。
（2）解聚细胞中的核蛋白。
（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-…R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是Na Ac-HAc的缓冲液。
用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。
而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。
前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。
乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使D NA失水而易于聚合。
一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。
因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。
但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。
折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。
也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。
一般在室温下放置15－30分钟即可。
5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。
在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。
6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SD S-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。
也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。
在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。
7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。
磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。
8．如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。
本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％PEG，其最终PEG浓度为12％。
PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。
9．抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。
经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。
而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。
作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。
所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。
经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。
也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。
10．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。
加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。
一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。
也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。
11．为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。
用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。
在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。
保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。
为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。
8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。
用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。
平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。
－－－－－－－－－－－－－－质粒抽提原理（转载自 生物谷网站）碱裂解法从大肠杆菌制备质粒，是从事分子生物学研究的实验室每天都要用的常规技术。
为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；溶液III，3 M 醋酸钾/ 2 M 醋酸。
让我们先来看看溶液I的作用。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。
那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。
所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。
在溶液I中加入高达10 mM 的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDT A。
如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水，或LB培养基来悬浮菌体就可以了。
有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。
轮到溶液II了。
这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。
要新从浓N aOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。
很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。
事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。
如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。
很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。
有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。
这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。
基因组DNA的断裂会带来麻烦，后面我再详细说明。