荧光定量的原理及过程介绍
荧光定量pcr原理及应用
荧光定量PCR原理及应用一、引言荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction）是一种广泛应用于生物学和医学领域的分子生物学技术，它能够在短时间内扩增DNA序列并定量测量样品中特定DNA的数量。
本文将深入探讨荧光定量PCR的原理和应用。
二、荧光定量PCR原理2.1 PCR基本原理回顾在了解荧光定量PCR原理前，我们首先回顾一下PCR的基本原理。
PCR是一种通过反复复制DNA片段的技术，它基于DNA复制的三个基本步骤：变性、引物结合和延伸。
1.变性：将DNA加热到95℃，使其两个链分离成单链。
2.引物结合：将温度降至适合引物结合的温度。
引物是针对待扩增的DNA片段设计的短寡核苷酸序列，它们与待扩增片段的两端互补。
引物结合到待扩增片段上。
3.延伸：在适当的酶的作用下，延伸引物，合成互补链。
通过重复这个循环，DNA片段会指数增加。
2.2 荧光定量PCR原理荧光定量PCR在PCR的基础上进行了改进，引入荧光染料和荧光探针。
荧光染料可以与DNA结合并发出荧光信号，荧光探针可以在PCR过程中实时检测DNA的扩增情况。
1.引物设计：荧光定量PCR需要设计两个引物，一个用于扩增目标DNA，另一个用于扩增内参（house-keeping gene），作为对比和标准。
2.荧光染料：在PCR反应体系中添加荧光染料，如SYBR Green。
SYBR Green可以结合到PCR产物的DNA上，并发出荧光信号。
3.荧光探针：荧光定量PCR还可以使用荧光探针，如TaqMan探针。
TaqMan探针是一种特殊的寡核苷酸序列，它含有两个荧光染料（荧光报告染料和荧光阻断染料）和一个酶切位点。
在PCR反应中，当探针与待扩增片段结合时，酶会切除探针，导致荧光信号的降低。
4.实时检测：荧光定量PCR可以实时检测PCR反应体系中的荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的变化，可以定量测量待扩增片段的数量。
荧光定量PCR的原理及其应用
荧光定量PCR的循环过程
变性
在95℃下，DNA双链被打开，形成单 链模板。
延伸
在72℃下，DNA聚合酶从引物3'端开 始延伸DNA链。
退火
感谢您的观看
THANKS
定量分析。
引物设计
引物是荧光定量PCR反应的关 键，用于扩增特定的DNA片 段。引物设计需遵循一定的 原则，如特异性、长度、GC 含量等。
反应条件
荧光定量PCR反应需要设置适 当的反应条件，如温度、时 间、循环数等。这些条件直 接影响扩增效率和准确性。
荧光信号的收集和分析
荧光信号收集
在荧光定量PCR反应过程中，仪器会自动收集每个循环的 荧光信号。这些信号可以实时监测扩增过程，并用于定量 分析。
由于荧光定量PCR技术采用了标准曲线法， 可以建立统一的定量标准，使得不同实验 之间的结果具有可比性和可重复性。
缺点
成本较高
荧光定量PCR技术需要特殊的仪器设备和荧光染料，因此 相对于传统PCR技术，其成本较高。
操作复杂
荧光定量PCR技术的操作相对较为复杂，需要经过一定的 培训和技术指导才能获得准确的结果。
用将更加深入和广泛。
对未来发展的展望和挑战
要点一
展望
荧光定量PCR技术将继续发展，新方法和新技术的应用将 进一步提高其灵敏度、特异性和自动化程度。同时，荧光 定量PCR的应用领域也将不断拓展，为临床诊断和生物科 学研究提供更多有效的工具。
要点二
挑战
尽管荧光定量PCR技术已经取得了很大的进展，但仍存在 一些挑战和限制，如提高检测灵敏度和特异性、降低成本 和提高检测速度等。未来需要不断改进和完善技术，以适 应不断变化的需求和应用场景。
荧光定量PCR原理及实验步骤
荧光定量PCR原理及实验步骤
一、实时荧光定量PCR原理
常规PCR技术对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。
实时定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
几个概念：
（1）扩增曲线：
（2）荧光阈值：
（3）Ct值：
（4）标准曲线
SYBR Green工作原理：
1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光
4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光
信号。
二、实验步骤
1. 实验前先在大型仪器共享平台上预约多元荧光定量PCR仪。
1、将所需引物和SYBgreen（避光）拿出，解冻。
计算好所有引物和SYBgreen
的用量。
2、反应体系（25μL）如下：
H2O 11μL
SYBgreen 12.5Μl
上游引物0.25μL
下游引物0.25μL
cDNA 1μL
可先将H2O 和SYBgreen按照所需量配好后，分装，再根据需要加引物和模板。
4、加完所有试剂后，盖上盖子，混匀，离心。
上机。
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
1、试述荧光定量pcr技术的原理、方法、注意事项及其在临床与科研中的应用
荧光定量PCR是一种在PCR反应过程中，通过荧光信号的检测来对PCR产物进行实时定量分析的技术。
1. 原理：
荧光定量PCR利用荧光染料或者荧光探针，标记扩增过程中的每一个循环的产物，这些荧光标记的产物在激发光的作用下会发出荧光。
随着反应的进行，PCR产物不断累积，荧光信号也随之增强。
通过对荧光信号的实时监测，可以推断出样本中起始模板的数量。
2. 方法：
主要方法包括探针法、SYBR Green I染料法和分子信标法等。
探针法使用与目标序列特异性结合的荧光探针来标记PCR产物。
SYBR Green I染料法则是利用染料与双链DNA的结合特性，将染料添加到反应体系中，随着PCR产物的增加，染料的荧光信号也增强。
3. 注意事项：
荧光定量PCR对样品纯度要求较高，应避免杂质的干扰。
反应体系中的成分和浓度需要精确控制，以确保实验结果的准确性。
荧光定量PCR的结果解读需要参考标准曲线，以确定未知样本中的目标序列数量。
4. 在临床与科研中的应用：
在临床应用中，荧光定量PCR被广泛用于病原体检测、基因突变分析、遗传病诊断以及癌症研究等。
例如，用于检测病毒如HIV、HBV等的载量，或者检测癌症相关基因的表达水平。
在科研领域，荧光定量PCR可用于基因表达分析、基因组学和表观遗传学研究中。
例如，比较不同组织或细胞类型的基因表达差异，或者研究表观遗传修饰对基因表达的影响。
总的来说，荧光定量PCR技术是一种高灵敏度、高特异性的核酸定量分析方法，对于临床诊断和科学研究具有重要意义。
荧光定量法
荧光定量法一、引言在生物医学研究中，荧光定量法是一种常用的实验技术，用于测量样品中特定物质的浓度。
荧光定量法基于荧光现象，通过测量样品发出的荧光强度来确定目标物质的含量。
本文将详细介绍荧光定量法的原理、应用以及优缺点。
二、原理荧光定量法基于荧光现象，即当物质受到激发光照射后，能够吸收光能并发出辐射光。
荧光现象是由于物质的电子在激发态和基态之间跃迁所导致的。
在荧光定量法中，使用荧光染料或荧光标记的抗体等荧光探针与目标物质结合后，通过测量荧光强度来确定目标物质的浓度。
荧光定量法的基本原理如下： 1. 激发：使用特定波长的激发光照射样品，使样品中的荧光探针被激发到激发态。
2. 荧光发射：被激发的荧光探针从激发态跃迁回基态时，会发出荧光。
荧光的波长和强度与样品中目标物质的浓度相关。
3. 检测：使用荧光仪测量样品发出的荧光强度，并将其与标准曲线进行比较，从而确定目标物质的浓度。
三、应用荧光定量法在生物医学研究中有广泛的应用，以下是一些常见的应用领域：1. 生物分析荧光定量法可用于测量生物样品中的蛋白质、核酸、细胞等目标物质的浓度。
例如，可以使用荧光探针标记的抗体来定量检测特定蛋白质在细胞中的表达水平，或者使用荧光探针检测核酸序列的浓度。
2. 药物研发荧光定量法在药物研发中起着重要的作用。
通过荧光定量法可以测量药物在体内的药物浓度，评估药物的代谢和排泄情况，从而优化药物剂量和给药方案。
3. 环境监测荧光定量法可用于环境监测中，例如测量水样中的污染物浓度。
通过使用荧光探针与目标污染物结合，可以快速、准确地测量水样中的污染物含量，为环境保护提供重要参考。
4. 食品安全荧光定量法在食品安全领域也有应用。
例如，可以使用荧光探针检测食品中的有害物质，如重金属、农药残留等。
荧光定量法具有高灵敏度和高选择性，能够有效地检测食品中的微量有害物质。
四、优缺点荧光定量法作为一种常用的实验技术，具有以下优点： - 高灵敏度：荧光探针的荧光强度可以非常敏感地反映目标物质的浓度变化。
荧光定量pcr技术原理
荧光定量pcr技术原理荧光定量PCR技术（qPCR）是一种广泛应用于遗传学、病毒学、生物学以及医学等领域的分子生物学技术。
qPCR技术不仅能够准确快速地定量检测DNA模板，还可以检测RNA模板和蛋白质模板。
下面，将对qPCR技术的原理和步骤进行详细解释。
qPCR技术可以快速、精确地检测DNA，RNA和蛋白质等生物分子，其基本原理是通过PCR扩增反应，将DNA等靶分子浓缩，使其达到检测的限度。
同时，通过加入荧光标记的探针或引物，可以精确地记录反应的进程。
PCR反应完成后，荧光信号的变化可以直接反映出DNA分子的变化情况，进而得出浓度的定量结果。
qPCR反应主要包含两个步骤：PCR扩增基因片段和荧光信号检测。
PCR扩增基因片段的过程与普通PCR相同，但是在反应体系中加入荧光标记的探针或引物，所以荧光定量PCR反应的结果不仅表明结果是否出现，还可以定量检测出靶基因的数量。
因此，qPCR技术经常用于测定遗传性状、基因表达水平、微生物的定量，等等。
qPCR技术的优点主要体现在检测精度和灵敏度方面。
相对于传统的PCR技术，qPCR技术具有更高的检测灵敏度和更高的重复性，并且可以在较短的时间内处理大量样本；同时，qPCR技术可以在未开放区间（如DNA合成反应合成DNA的时候）检测反应的进程，这大大提高了实验的灵活性和可操作性。
2. 荧光定量PCR技术步骤（1）实验设计。
实验设计是qPCR技术的第一步，必须选择适当的引物和探针设计。
引物和探针的设计通常使用在线工具进行设计，二者均需具有较高的特异性，对非靶标序列不产生杂交效应，并且需要对目标序列具有较高的亲和性，以获得较好的扩增效果和检测结果。
（2）qPCR反应。
qPCR反应可以在各种qPCR仪器中进行。
在反应中，将提取的DNA或RNA按照设计好的引物和探针进行PCR扩增。
反应条件会因引物和探针的选择而有所不同。
反应结束后，qPCR仪器可以自动记录荧光信号变化，并计算扩增产物的数量，从而得出样品中目标序列的浓度。
荧光定量PCR的原理及应用
荧光定量PCR的原理及应用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）是一种基于荧光信号的分子生物学技术，用于定量检测目标DNA序列的数量。
它结合了传统的聚合酶链反应（PCR）技术和荧光探针技术，通过检测盘细胞PCR扩增过程中产生的荧光信号的数量来确定目标序列的初始模板DNA的量。
以下是荧光定量PCR的原理和应用相关内容。
1.原理：荧光定量PCR基于PCR扩增技术，通过DNA的双链不断不断的分离和扩增，形成指数级别的增加，从而使DNA数量可检测，实现定量的目标DNA检测。
在PCR反应体系中加入DNA荧光探针，该探针含有一个荧光染料和一个阻断器。
在PCR反应中，荧光探针与引物结合，并通过荧光染料发射荧光信号。
当引物与靶DNA序列结合时，即在扩增成产物的过程中，荧光探针被水解，导致发射的荧光不再受到阻断器的遮挡，荧光信号显著增加。
通过检测PCR反应中荧光信号的强度，来确定目标序列的初始模板DNA量。
2.应用：（1）基因表达分析：荧光定量PCR可用于分析特定基因在不同组织、细胞类型或疾病状态下的表达水平差异。
通过测量目标基因的荧光信号，可以定量表达水平。
（2）病原体检测：荧光定量PCR可用于检测并定量常见病原体的存在。
例如，通过检测病毒或细菌的DNA或RNA来确定其感染程度。
（3）遗传疾病诊断：荧光定量PCR可用于检测一些遗传疾病相关基因突变的存在，并定量突变的数量。
（4）细菌或病毒负荷检测：在一些感染疾病的监测中，荧光定量PCR可用于检测和定量病菌或病毒在患者体内的负荷，可用于监测治疗效果。
（5）环境微生物分析：荧光定量PCR可用于分析和定量土壤、水样和空气等环境中的微生物（如细菌、真菌和病毒）的存在和变化。
（6）转基因分析：在转基因研究中，荧光定量PCR可用于检测和定量外源基因的存在并分析其表达水平。
（7）单细胞分析：荧光定量PCR可用于对单个细胞中目标基因或突变的检测和定量。
这对于研究单细胞的异质性和功能以及肿瘤细胞的进化和耐药性等方面的研究具有重要意义。
定量PCR基本原理及方法
✓ Ct值与起始模板的关系
logN=log N0 +nlogE n=Ct 每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数 的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。
Y轴—Ct值
6
X—起始拷贝数的对数
✓ 绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较
Excitation
R
3’
11
3’
3’
5’
QQQ
Q
5’
分子信标（Molecular Beacon Probe）
R ExcitatEiomnission Q
Excitation
12
荧光共振能量传递（FRET Probe）
Oligo 1: Fluorescein Excitation
Transfer
野生型 突变型 杂合型
21
利用熔解曲线检测基因突变 FRET探针进行熔解曲线分析确定基因型
FRET探针与模板结合时，因共振能量的传递而信号增强，而当在Tm 值时， FRET探针与PCR产物分开，荧光信号减弱。通过实时捕捉到的PCR产物在熔解过程 中荧光信号的变化，得到PCR产物的熔解曲线。因为发生基因突变的PCR产物有特定 的Tm 值，通过测定探针与PCR产物分开时的熔解温度Tm值，就能确定样品的基因型。
8
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
5’
3’
SG
Emission
SG
SG
3’
SG
5’
SG
9
内掺式染料 SYBR-Green I
Excitation
SG
5’
3’
荧光定量pcr的原理和过程
荧光定量pcr的原理和过程荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的改进方法，通过引入荧光探针来实现对PCR反应的实时监测和定量分析。
荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等领域，具有高灵敏度、高特异性、高准确性等优势。
荧光定量PCR的原理基本与传统PCR相同，都是通过不断复制DNA片段来扩增目标序列。
但是，荧光定量PCR在PCR反应体系中加入了特异性的荧光探针，这种探针能够与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号。
通过实时监测荧光信号的强度，可以准确地定量PCR反应中的目标序列数量。
荧光定量PCR的过程主要包括：样品制备、引物设计、反应体系配置、PCR扩增、荧光信号检测和数据分析等步骤。
首先，样品制备是荧光定量PCR的第一步。
样品可以是DNA、RNA或cDNA等，需要根据实验的目的选择合适的样品类型，并进行样品提取和纯化。
接下来，引物设计是荧光定量PCR的关键步骤之一。
引物是用于扩增目标序列的短DNA片段，通常由两个引物组成：前向引物和反向引物。
引物的设计需要根据目标序列的特点，如长度、GC含量、特异性等进行合理选择，并使用生物信息学工具进行引物序列的合成。
然后，反应体系配置是荧光定量PCR的另一个重要步骤。
反应体系通常包括模板DNA、引物、荧光探针、核苷酸三磷酸（dNTPs）、聚合酶和缓冲液等组分。
其中，荧光探针是荧光定量PCR的关键组分，它通常由荧光染料和荧光信号抑制剂构成。
荧光染料可以与目标序列特异性结合，并在PCR反应过程中发出荧光信号；而荧光信号抑制剂可以抑制未结合的荧光染料发出的背景信号。
接着，进行PCR扩增。
PCR扩增是通过不断循环进行三个温度阶段的反应来扩增目标序列。
首先是变性阶段，将反应体系中的DNA变性为单链DNA；然后是退火阶段，使前向引物和反向引物与目标序列特异性结合；最后是延伸阶段，聚合酶在适当温度下将dNTPs加入到引物结合的DNA链上，从而合成新的DNA链。
荧光定量pcr原理和步骤
荧光定量pcr原理和步骤荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，能够快速、准确地定量检测DNA或RNA的含量。
下面将介绍荧光定量PCR的原理和步骤。
荧光定量PCR的原理主要基于传统PCR技术和荧光探针技术的结合。
传统PCR通过不断复制DNA模板，使其数量呈指数增加，但并不能定量测定模板初始含量。
为了解决这一问题，qPCR引入了特定的荧光标记探针，该探针可与扩增产物特异性结合，通过荧光信号的增加来反映模板的初始数量。
荧光定量PCR的步骤如下：1. DNA模板制备：从待检测样本中提取DNA，并进行纯化处理，确保所得到的DNA质量较高。
2. 反应体系配置：根据实验需要，准备PCR反应液，包括DNA模板、引物（forward primer和reverse primer）、DNA聚合酶、核苷酸和缓冲液等。
3. 反应条件设定：根据引物序列的特性和所需扩增产物的长度，确定PCR反应的温度周期条件，包括退火温度、延伸时间和循环次数等。
4. 荧光探针设计：根据待检测序列的特点，设计合适的荧光探针，通常这些探针包括一个荧光染料和一个猪尾巴。
5. 温度循环程序：将配置好的PCR反应液放入热循环仪中，根据反应条件进行温度循环，使DNA发生退火、延伸和复性，并产生大量的扩增产物。
6. 荧光检测：热循环仪会不断读取PCR反应体系中荧光信号的变化，通过荧光强度来定量检测DNA的含量。
荧光信号的强度与模板DNA的初始含量成正比。
7. 数据分析：通过计算荧光信号和模板DNA的标准曲线，可以得到待检测样本中目标序列的初始含量。
8. 结果解读：根据数据分析的结果，可确定待检测样本中目标DNA的绝对或相对含量。
荧光定量PCR凭借其高度敏感和快速准确的特点，已广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传病筛查等领域。
随着技术的不断发展，荧光定量PCR将在医学诊断和疾病预测中发挥更加重要的作用。
荧光定量PCR的原理及应用
荧光定量PCR的原理及应用1. 荧光定量PCR的原理荧光定量PCR（Quantitative PCR，简称qPCR）是一种能够准确测量DNA模板数量的分子生物学技术。
它是传统PCR技术的一种改进和发展，通过引入荧光探针来实现DNA模板的定量测量。
1.1 PCR的基本原理PCR是一种在体外复制DNA的方法，它是由DNA的三个步骤循环不断重复而实现的。
这三个步骤分别是变性、退火和延伸。
•变性：将反应体系中的DNA加热至95°C，使其双链DNA解链成两条单链。
•退火：降温至较低的温度，使引物（引导复制的短链DNA）与目标序列特异性结合。
•延伸：在适宜的温度下，DNA聚合酶进行DNA链的合成。
1.2 荧光定量PCR的原理荧光定量PCR在PCR的基础上引入了荧光探针，通过测量PCR反应产生的荧光信号来实现DNA模板的定量。
•引物：在荧光定量PCR中，通常需要设计一对引物，一个为前向引物，一个为反向引物。
引物的选择应具有高度特异性，能够特异性地与目标DNA序列结合。
•荧光探针：荧光探针是一种含有荧光染料和荧光猝灭剂的双标记探针。
当荧光探针与其靶序列结合时，荧光染料和猝灭剂之间的距离变远，荧光信号被释放出来，可以被测量到。
荧光定量PCR的原理是基于荧光探针的特性。
在PCR反应中，引物与荧光探针特异性结合目标DNA序列，DNA聚合酶在合成DNA链的过程中会加上荧光探针。
当PCR反应进行时，荧光探针结合的DNA链会被逐渐增加，荧光信号也会相应增强。
通过实时测量PCR反应体系中荧光信号的强度，可以推断出目标DNA序列的起始数量。
2. 荧光定量PCR的应用荧光定量PCR在现代生物学研究中广泛应用于许多领域。
以下是一些主要的应用范围：2.1 基因表达分析荧光定量PCR可以用于研究基因的表达水平。
通过测量不同样品中特定基因的mRNA复制数目，可以判断该基因在不同生物样品中的表达水平差异。
这对于研究基因功能、寻找治疗靶点以及评估药物的有效性都具有重要意义。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基于PCR技术的一种变种，它利用荧光探针实现对PCR产物的定量检测。
荧光定量PCR结合了PCR扩增和实时荧光检测技术，能够快速、准确地检测目标DNA的含量。
本文将介绍荧光定量PCR的原理及其在科研和临床应用中的重要性。
一、荧光定量PCR的原理荧光定量PCR的原理基本与常规PCR相似，也包括三个步骤：变性、退火和延伸。
其区别在于，在PCR反应体系中加入了含有荧光素的探针，这些探针与目标DNA序列特异性结合，并在PCR反应中被DNA聚合酶酶切，导致荧光信号的释放。
在PCR反应进行过程中，荧光信号与PCR产物量成正比，通过检测荧光信号的强度，可以实时监测PCR反应的进程，从而实现对目标DNA的定量检测。
荧光定量PCR可以通过不同的荧光探针来检测多个靶标，实现多重PCR检测。
二、荧光定量PCR的应用1. 病原微生物检测：荧光定量PCR广泛应用于病原微生物的检测，包括细菌、病毒、真菌等。
通过荧光定量PCR技术，可以实现对微生物的快速、准确的检测，有助于早期诊断和治疗。
2. 癌症诊断：荧光定量PCR可用于癌症早期筛查和诊断。
通过检测癌基因的表达水平，可以帮助医生判断肿瘤的类型、分级和预后，指导个体化治疗方案。
3. 遗传病检测：荧光定量PCR可用于遗传病的基因检测。
通过对患者DNA样本进行荧光定量PCR分析，可以准确检测遗传突变，帮助家庭规划和遗传咨询。
4. 食品安全监测：荧光定量PCR可以用于食品中致病微生物和转基因成分的检测。
通过对食品样品中目标DNA的定量检测，可以确保食品安全，保障公众健康。
5. 环境微生物监测：荧光定量PCR可用于环境微生物的监测和鉴定。
通过对环境样品中微生物的定量检测，可以了解微生物种类和数量，指导环境保护和生态恢复工作。
荧光定量PCR作为一种高灵敏、高特异性的分子生物学技术，在医学、生物学、食品安全和环境科学等领域发挥着重要作用。
实时荧光定量pcr的原理和方法
实时荧光定量pcr的原理和方法实时荧光定量PCR（qPCR）是一种分子生物学技术，用于检测和定量特定DNA或RNA序列的存在和相对丰度。
它可以在短时间内快速、准确地测量目标序列的数量，并在许多领域中被广泛应用，包括基因表达分析、病原体检测和基因突变分析等。
实时荧光定量PCR的主要原理是通过放大DNA模板，并使用荧光探针或染料进行实时监测。
这些荧光探针通常是DNA寡核苷酸序列，带有一个共振能量转移对（RET pair），由一个荧光引物（donor）和另一个荧光引物（acceptor）组成。
在初始的PCR循环中，通过在高温下使DNA变性，使两个引物和DNA分离。
在下一个低温的退火步骤中，这两个引物会与DNA互补结合。
当两个引物结合到DNA模板上时，它们的荧光引物也会接近彼此，从而使共振能量转移发生，导致荧光信号减弱或消失。
这种现象被称为荧光淬灭。
当PCR循环继续进行时，每个复制周期会以指数级增加DNA模板的数量。
由于引物的结合会导致荧光淬灭，因此在每个PCR循环的末尾，荧光信号将与DNA模板的数量成正比。
实时荧光定量PCR中常用的荧光探针有探针PCR和SYBR Green。
探针PCR使用两个引物和一个荧光探针，该探针带有一个荧光团和一个辅助荧光团。
在荧光探针与DNA模板结合时，两个荧光团之间的共振能量转移会发生，导致荧光信号的减弱。
SYBR Green则是一种将DNA结合的染料，在PCR循环中，SYBR Green会与所有DNA结合，并发出荧光信号。
使用探针PCR时，可以通过测量荧光信号的减弱来确定目标DNA的存在量。
而使用SYBR Green时，可以通过测量荧光信号的增加来判断目标DNA的数量。
实时荧光定量PCR的操作过程如下：1. DNA提取和纯化：从样品中提取所需的DNA或RNA，并经过纯化处理，以去除可能干扰PCR反应的杂质。
2. 引物设计：设计适合的引物和荧光探针，以在PCR反应中特异性地扩增目标序列。
荧光定量原理
两种不同术式治疗老年人股骨颈骨折疗效比较目的：比较人工股骨头置换术与全髋关节置换术治疗老年人股骨颈骨折的临床疗效。
方法：回顾性分析2011年1月一2012年12月我院所收治的老年股骨颈骨折患者48例，随机分为两组，对照组22例行股骨头置换术，观察组26例行全髋关节置换术，比较2组手术时情况、术后关节功能恢复情况。
结果：对照组在手术时间、术中出血量、住院时间及术后下地时间方面均明显优于观察组，P＜0.05，差异有统计学意义；对照组术后并发症及翻修率高于观察组，P＜0.05，差异有统计学意义；对照组术后1年、2年Harris评分优良率分别为72.73%、63.64%，观察组为88.46%、80.77%，观察组明显优于对照组，P＜0.05，差异有统计学意义。
结论：人工股骨头置换具有手术时间短、创伤小等优点，而全髋关节置换术远期疗效优于人工股骨头置换术，两种手术方法各有优缺点，治疗时应根据患者病情具体分析。
标签：股骨颈骨折；全髋关节置换术；人工股骨头置换术；老年人随着我国人口的老龄化，老年人股骨颈骨折的发病率也逐年上升，严重危害着老年人的正常生活。
根据骨折特点，选择一种安全、有效的治疗方案是改善预后、提高救治效果的关键。
而保守治疗和各种内固定治疗都有较高的骨不愈合及股骨头缺血坏死[1]，仅有约25%可恢复功能，因此临床上在无明确手术禁忌证的情况下，多主张进行手术治疗。
目前，人工股骨头置换术和全髋置换术是治疗有移位的老年人股骨颈骨折的的主要方法，但二者的适应证及利弊方面尚存广泛争议。
本文将48例老年人股骨颈骨折患者，按手术方法不同将其分为两组，对照组行股骨头置换术，观察组行全髋关节置换术，将两组的手术时情况、术后并发症的发生情况及术后关节功能恢复情况等项指标进行对比，以探讨治疗老年人股骨颈骨折最佳手术方式。
现将分析结果报告如下。
1一般资料与方法1.1一般资料从我院2011年1月一2012年12月收治的股骨颈骨折患者中，选出年龄>60岁患者48例，其中男21例，女27例；平均年龄72.5±8.6岁；其中39例新鲜骨折，9例陈旧骨折；骨折类型：头下型21例，经颈型25例，头颈型1例，基底型1例；按Garden分型：Ⅲ型34例，Ⅳ型14例；致伤原因：摔伤32例，车祸伤16例。
荧光定量分析仪原理
荧光定量分析仪原理
荧光定量分析仪是一种利用化学物质在吸收辐射能量后再放出辐射的特性来定量测定样品中特定物质含量的仪器。
它基于荧光现象的产生和测量，与光谱仪一起使用，能够提供准确、快速的分析结果。
荧光定量分析仪的工作原理是通过激发样品中的化学物质产生荧光，并测量荧光的强度来确定物质的含量。
它利用激发光源产生的电磁辐射能量来激发样品中的分析物，激发后的分析物进入高能级激发态，当分析物从高能级跃迁回到基态时，会放出能量较低的光子，即荧光。
荧光的发射波长和强度与分析物的浓度成正比关系。
荧光定量分析仪通常包括一个光源、一个激发光滤光片、样品室、检测器和信号处理系统。
光源产生适当波长的激发光，经过激发光滤光片选择特定波长的光进入样品室。
样品室中的分析物被激发后产生荧光，荧光通过检测器接收并转换成电信号。
信号处理系统对电信号进行放大和数字化处理，并根据预先建立的标准荧光强度与分析物浓度的关系曲线，计算出样品中分析物的含量。
荧光定量分析仪具有灵敏度高、选择性强、操作简便等优点，广泛应用于化学、生物、环境等领域的测量和分析。
它在药物研发、环境监测、食品安全等方面发挥了重要作用，为科学研究和工业应用提供了可靠的分析结果。
荧光定量PCR
荧光定量PCR（Quantitative Real-Time PCR，简称qPCR）是一种分子生物学技术，用于精确测定样本中特定核酸序列的数量。
其基本原理基于PCR（聚合酶链式反应）技术和实时荧光检测，能够在PCR扩增过程中连续监测荧光信号的变化，从而实现对起始模板量的定量分析。
荧光定量PCR原理简述：1.PCR扩增：qPCR采用传统的PCR方法，包括变性（DNA双链解开成单链）、退火（引物与靶序列配对）和延伸（DNA聚合酶合成新链）这三个基本步骤，反复进行使得目标序列指数级扩增。
2.荧光标记与检测：SYBR Green法：SYBR Green是一种非特异性的双链DNA结合染料，在游离状态下几乎不发出荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光强度显著增强。
因此，随着PCR过程中的产物增加，荧光信号也相应增加，荧光强度与PCR产物的数量成正比。
TaqMan探针法：此方法更为特异，使用一种特殊的寡核苷酸探针，其两端分别标记了荧光报告基团和淬灭基团。
在PCR反应中，当探针与靶序列配对时，位于中间的探针被Taq 酶水解，导致荧光报告基团与淬灭基团分离，从而产生荧光信号。
只有当特定的扩增产物生成时才会释放荧光。
荧光定量PCR实验步骤概览：1.样品制备：RNA提取：从组织、细胞或其他生物样本中提取总RNA，常用TRIZOL或类似试剂进行裂解、离心分相和乙醇沉淀来纯化RNA。
cDNA合成：对于mRNA的定量，需要先将RNA逆转录为cDNA。
2.设计与合成引物：针对目标基因设计一对特异性的PCR引物，用于扩增目的片段。
3.PCR反应体系构建：将纯化的cDNA或DNA模板、特异性引物、Taq聚合酶、缓冲液、dNTPs和其他必要成分如SYBR Green染料或TaqMan探针等加入至PCR管中，配置成最终的PCR反应体系。
4.实时荧光PCR扩增与检测：在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，仪器在每次循环的适当阶段收集荧光信号，并记录下来。
荧光定量pcr原理
荧光定量pcr原理荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）是一种可以在实验室中快速准确测量DNA的技术，它使用荧光来检测和计算特定DNA序列的定量，在生物学和医学研究中极其重要。
本文旨在深入讨论荧光定量PCR的原理，以及它是如何在分子生物学研究中发挥作用。
一、荧光定量PCR原理荧光定量PCR（qPCR）是一种检测DNA的技术，它使用荧光探针和背景抑制剂来检测DNA片段的存在。
qPCR使用DNA复制的反应来放大特定的DNA序列，并使用荧光探针来检测这些序列。
荧光定量PCR的过程包括三个主要阶段：反应制备、反应启动和反应完成。
在反应制备阶段，实验室工作人员将模板DNA、反转录酶（RT）、DNA聚合酶（Taq）、荧光探针和背景抑制剂放入PCR反应管中。
在反应启动阶段，Taq DNA聚合酶将反应温度升至95摄氏度以上，以启动DNA复制。
在复制过程中，荧光探针捕获复制产物，并发出荧光信号，使其可以被检测到。
在反应完成阶段，实验室工作人员将反应温度降至60摄氏度以上，以终止DNA复制。
在这个阶段，实验室工作人员可以使用特定设备（如实时PCR仪或qPCR仪）测量DNA复制产物的定量，以确定模板DNA的定量。
二、荧光定量PCR的应用荧光定量PCR在分子生物学研究中发挥着重要作用，它可以用来精确测量模板DNA的定量，以及从细胞或组织样本中快速鉴定出特定的基因。
它还可以用来研究不同细胞和组织中特定基因的表达水平，以及研究基因突变、转录因子的活性等问题。
荧光定量PCR在病毒感染的检测中也发挥着重要作用，它可以快速确定病毒的存在，以及病毒在体内的活跃度。
例如，可以使用qPCR快速检测COVID-19病毒，从而帮助诊断和控制疾病的传播。
此外，荧光定量PCR还可以用于在肿瘤组织中鉴定具有致癌潜能的基因突变，并帮助确定患者是否需要接受放疗或化疗治疗。
qPCR技术也可以用于检测细菌和真菌感染，以及检测抗药性菌株，帮助确定最佳治疗方案。
简述荧光定量PCR的原理及应用
简述荧光定量PCR的原理及应用1. 荧光定量PCR的原理荧光定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种通过荧光信号来定量测量PCR反应产物数量的方法。
它是PCR技术的一种变体，通过引入荧光染料来实现高灵敏度和高特异性的DNA检测和定量。
荧光定量PCR的主要原理如下：1.1 反应物准备首先，需要准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物（primer）、核酸酶、核苷酸三磷酸酶（polymerase）、适当的缓冲液和荧光探针。
其中荧光探针是关键，它在PCR反应过程中与目标DNA序列特异性结合，并通过荧光信号的产生反映PCR产物的数量。
1.2 PCR反应过程PCR反应由若干个循环组成，每个循环包括DNA的变性、引物的结合和延伸，以及荧光探针的结合和信号发生。
具体步骤如下：1.反应体系加热至94°C，使DNA模板变性为单链。
2.使反应体系温度降低至引物的退火温度，使引物与单链DNA特异性结合。
3.延伸阶段，引物提供的3’端作为DNA的起始点，并与DNA模板的互补碱基配对，聚合酶在此基础上合成新的DNA链。
4.荧光探针降解为引物，释放出一个荧光信号。
5.利用PCR仪测量荧光信号的强度，并与已知浓度的标准品进行比较，从而计算出待测样品中目标DNA序列的含量。
2. 荧光定量PCR的应用荧光定量PCR广泛应用于各个领域的生物研究和临床诊断中。
以下列举了一些常见的应用：2.1 基因表达分析荧光定量PCR可用于测量目标基因在不同组织、细胞或生物样品中的表达水平。
通过定量PCR可以准确测量少量目标基因的RNA表达，从而比较不同条件下基因的表达差异。
2.2 病原微生物检测荧光定量PCR在病原微生物的快速检测和定量分析中具有重要作用。
例如，可以用荧光定量PCR检测病原体感染引起的特定基因片段的存在和数量，从而诊断疾病。
2.3 突变分析荧光定量PCR也可以用于检测基因的突变。
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特殊的吸收-增强效应
NiK(1.66Å) <FeK(1.94Å)< CrK(2.29Å)
X光管辐射直接激发的CrKα ：占CrKα辐射总量的72.5% FeKα辐射直接激发的CrKα：占CrKα辐射总量的23.5% ; NiKα辐射直接激发的CrKα ：占CrKα辐射总量的2.5% NiKα辐射激发的FeKα辐射激发的CrKα（第三元素激发）： 占CrKα辐射总量的1.5%
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吸收-增强效应
吸收效应： 当初级辐射射入样品和样品产生的荧光射出样品时，受 样品原子的吸收导致荧光强度减弱的现象称为吸收效应； 是由于初级辐射和基体元素特征线的波长刚好位于分析 元素吸收限的短波侧。基体对于这些辐射的吸收系数可 能大于或小于分析元素的系数系数。
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吸收-增强效应
增强效应： 分析元素的特征光谱线受共存的基体元素特征辐射的 激发导致分析强度的增加称为增强。基体元素特征线 波长位于分析元素吸收限的短波侧，使分析元素受到 基体辐射的强烈激发。
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定量分析中的基本问题
基体效应及其校正
基体效应是指：共存元素对分析线强度 的吸收和增强影响。基体指除分析元素 以外的元素。基体效应是分析误差的 主要来源之一。图中：
1. 以“ Alpha ”表示产生吸收影响的 路径，如Ni----Fe----探测器；
2. 以“ Normal ”表示的路径是元素受 激发产生的荧光不受任何影响直接 进入探测器，如Ni-------探测器。
基体分类：分成如下若干类型的基体： 当(/)M-B < (/)i时，属于轻基体 当(/)M-B (/)i时，属于中性基体 当(/)M-B (/)i时，属于重基体 当(/)M-B (/)B时，属于等效基体
1
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基体效应的定义
基体效应: 样品中共存元素对分析元素光谱强度的影响。 在理想情况下,分析线的强度与元素浓度呈现简单的线性关系: RA,M = WA,M․RA,A 但由于样品中共存元素间存在基体效应很难实现这种关系。 多色激发时，荧光强度公式为：
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定量分析的基本问题
1. 基体效应 2. 光谱重叠影响 3. 背景影响 4. 定量分析方法 5. 样品制备
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基体效应
基 体: 是指样品中除分析元素外的其他组成元素.在多元体系中不同的分 析元素,具有不同的基体。考虑二次吸收－增强效应，总的基体对 于某个基体元素的吸收与增强影响，基体对于分析线的强度影响不 同与单个基体对于分析线的影响。
定量分析的原理及过程
PANalytical
1
1
荧光分析的应用范围
元素范围： 4 号铍 ( Be )~ 92 号铀 ( U ) 浓度范围： 0.x PPm ~ 100 % 样品形态： 金属、非金属、化合物、固 体、液体,
粉末、压片、固溶体和不规则样品
1
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定量分析原理
X射线荧光分析法基本上就是一种测定出样品产生的X射线荧 光强度，然后根标准样品的X射线强度对比的比较方法。
1
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Al-Si体系中的基体影响
质量衰减系数 2MAC (cm/g
AlK1.487kev
AlKab1.559kev
3100
SiK1.740 kev
2600
SiKab 1.838 kev
2100
E(Al KSi abs. ) : Si
由于现代光谱仪的自动化程度很高，仪器稳定性很好，分 析误差主要来源于样品制备和样品本身存在的基体影响。因此， 制定定量分析方法的关键是如何正确处理基体效应和制定适当 的样品制备方法。
1
3
X射线光谱定量分析的步骤
选择分析方法和制样方法。 激发分析元素特征谱线，涉及到X射线管和电源。 把二次光谱色散成孤立的分析线，以便单独测量。一般采 用波长色散和能量色散，也可采用两种色散的组合方式 进 行强度测量。 探测和测量。 把元素的X射线强度换算成元素浓度，这涉及到标样或计 算方法以及吸收-增强效应的校正。
100
90 80 70 60 50 40 30
20 10
0
0
20
40
60 80 100
SiO2 (%)
1
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铁-镍-铬体系的第三元素影响
NiK NiKab
Nik
FeK
FeKab
NiK FeK CrKab CrK
初级激发产生 的 CrK 的强度占Cr总强度的72.5%; 初级荧光 NiK同时激发 Fe 和Cr; 初级荧光FeK直接增强 CrK 占 Cr 总强度的23.5％; 初级荧光NiK的直接增强 CrK 占 Cr 总强度的2. 5％ 二次荧光FeK对CrK的增强占Cr 总强度的1.5％。
基体中Al K的低吸收；
1600
E(Si KAl abs. ) : Al
基体中Si K 的高吸收
1100
Al K Si K
600
100% Al2O3 100% SiO2
100
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
能量(keV)
1
13
Al-Si体系中的基体影响
最大计数率 KCPS
Ii =
Ki I 0W
()
(
A
i
) 0 ()
m
sin
m
sin
K
i "W
"
i
A
1
2
1
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基体效应的分类
在光谱分析中基体对测量的分析线的强度影响可分为两 大类： (1) 吸收-增强效应：由于基体的化学组成引起 (2) 物理状态影响:由样品的粒度、均匀性，密度和表
面结构等因素所致。
3. 以“ Gamma ”表示的路径是以增 强效应为主，如Ni--Fe--Cr--探测器。
116Biblioteka 基体影响的校正方法1. 实验校正法：外标法、内标法、散射内标法、 比例稀释法等；
1
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Al-Si体系中的基体影响
当分析元素的原子序数大于22（钛）时，与分析元素的原子 序数相差1或2的元素构成中性基体。对于中等和重元素，邻 近元素的吸收增强特性基本相似，以致可互作内标。当原子 序数减少时，邻近元素谱线的波长差和吸收系数差增大，致 使ZK线受Z1元素的强烈吸收。例如在铝(13)硅(14)共存的 氧化物体系中，尽管硅对A1K的吸收系数(500)比铝的自吸系 数(385)大，但SiK对A1K的强烈增强足以抵消硅的吸收 。